具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本发明中所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1建立犬乳腺癌细胞系

1.原代肿瘤分离

通过手术切除，从一只5岁的泰迪母犬获得乳腺肿物，临床和组织病理诊断为犬乳腺肿瘤(CMT)：具有坚实、增厚和疼痛的临床表现。手术提取后，用磷酸盐缓冲液(PBS)和青霉素链霉素溶液(Gibco，美国)快速浸泡肿瘤标本。

2.瘤细胞原代培养

将上述获得的肿瘤组织用含1％青霉素链霉素溶液(Gibco,USA)的PBS研磨洗涤3次。然后，将肿瘤碎片用15毫升离心管收集，加入组织体积3-4倍的0.2％浓度的胶原酶Ⅱ(Sigma,V900892)在含5％二氧化碳的摇床中于37℃分解2小时，室温离心，1000rpm 5分钟，收集细胞，重悬于10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基(美国Gibco)，加1％青链霉素，细胞悬液加入25平方厘米的培养瓶(美国康宁)，在37℃5％CO₂的细胞培养箱中培养。每天用显微镜观察细胞。

3.建立细胞系：

当细胞培养达到90％融合时，用PBS洗涤3次，然后用含0.25％胰蛋白酶(HyClone,USA)和0.02％EDTA的完全培养基2ml处理细胞。从消化的细胞中提取二次培养物，换入新的25cm²瓶中，浓度为1x10⁵cells/ml，用含15％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基重悬。继续培养，每隔3d传代1次，分种率1:3。利用成纤维细胞贴壁速度明显快于上皮细胞的特点，可将上皮细胞纯化出来。将用差速贴壁法初步纯化的细胞正常消化后制备成单细胞悬液。在细胞计数板计算出细胞的浓度。用完全培养基调整细胞浓度至每100μL含有10个细胞，充分混匀后，均匀加入96孔板中，100μL/孔。每隔3d更换一次新鲜的培养基，如此培养10-14d可见到一些孔中会长出细胞群落，即为纯化的犬乳腺癌细胞系，记作犬乳F17。

进行试验观察与验证，通过多次消化传代纯化，得到图1所示纯化后细胞。采用核型分析，提取细胞核染色体，镜下观察如图2。将分离纯化后细胞接种裸鼠皮下，所有接种老鼠均形成肿瘤，成瘤率100％，如图3。将荷瘤小鼠肿物进行HE切片染色，观察乳垫肿物及肺转移切片情况，如图4所示，其中A为裸鼠自发性肺转移肿物HE切片，B为裸鼠乳腺荷瘤HE切片。结果说明犬乳F17细胞接种裸鼠皮下，可成功复制乳腺肿瘤模型，且可发生自发性肺转移，成功率为100％。将纯化的细胞进行细胞免疫荧光检测，观察其Ki-67、SOX-2、DELTA-CATENIN、CLAUDIN-1等肿瘤标志物蛋白表达情况，如图5所示。具体地：细胞形态：癌细胞呈多极形上皮形态特征，聚集成片或团簇状，与培养瓶壁贴附牢固，较难消化分离。

染色体分析：挑选染色体分散良好的100个中期的分裂相细胞进行染色体分析。待细胞生长至90％，常规消化细胞，离心收集细胞后，加入37℃预温的0.075mol/L KCl溶液8mL，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37℃预温水浴箱低渗处理25min，加入1mL新配置的固定剂(甲醇：冰乙酸＝3:1)，用吸管小心吹打、混匀，1000r/min离心8min，弃上清液，加入8mL固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定20min。1000r/min离心8分钟，弃上清液，重复固定一次。弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。吸取少量细胞悬液，滴2-3滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，气干。将标本置Giemsa染液中，染色8min，水洗去浮色，气干。结果表明，染色体数为78，符合狗细胞染色体数量，分离细胞来源于犬。

成瘤率和生长模式：成瘤率为100％，肿瘤生长符合Gompertzian指数函数模型。待小鼠荷瘤生长至2cm³，安乐后剖检小鼠，检查肿瘤转移情况，在小鼠肺脏可见多个转移灶，肺自发转移率100％。犬乳F17细胞系指数增殖期在第2-4天。

犬乳F17细胞系生物学特性：将培养好的细胞分为2组，每组为3个细胞爬片，弃掉培养液，用PBS洗一遍，4％多聚甲醛室温固定10min，分别用PBS洗3遍，1％Triton X-100透膜10min，PBS洗3遍，用山羊血清封闭40min。一组滴加单克隆抗体SOX-2(1：100稀释)，另一组滴加Ki-67单抗(1：100稀释)，4℃孵育过夜，PBS洗3遍，两组分别滴加FITC标记羊抗鼠IgG(1：100稀释)，室温避光孵育1h，PBS洗3遍，DAPI染色10min，PBS洗3遍，封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察、拍照。细胞免疫荧光检测Ki-67、SOX-2、DELTA-CATENIN、CLAUDIN-1蛋白表达阳性，结果如图5所示。

4.细胞冻存与复苏：细胞冻存复苏后生长良好，能够连续传代。微生物污染检测：细胞无细菌、真菌或支原体污染。

5.细胞计数：将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。常规消化细胞后，将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：细胞数/mL＝四大格细胞总数/4×10⁴。

将上述获得的细胞系别命名为犬乳腺癌细胞系，记为犬乳F17，于2021年05月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称为CGMCC，保藏号为CGMCC No.22349，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2犬乳腺癌Balb/SCID裸鼠模型

为了获得良好的小鼠异种移植模型，将实施例1中经细胞计数后获得的10⁸个犬乳F17细胞悬液(0.2ml PBS重悬)皮下接种于10只5周龄雌性Balb/SCID裸鼠(购自北京维通利华试验动物中心)的左乳脂肪垫中。每周观察小鼠肿瘤的发生情况。当发现肿瘤时，每周用卡尺监测肿瘤的长度和宽度，例如图3所示，持续8周。当小鼠出现呼吸困难、虚弱或无明显肿瘤时处死。收集肿瘤和器官，置于4％多聚甲醛(pH＝7.4)中进行组织病理学检查。所有项目均按照《实验动物护理和使用指南》完成。结果表明本发明CMT-1细胞系裸鼠皮下接种成瘤率100％，有侵袭浸润皮下、真皮层，肿物深层均坏死。4周后自发性肺转移率100％，组织病理学检查证实为转移性腺癌。上述移植肿瘤模型的肿瘤生长曲线符合Gompertz函数模型，为潜伏期后呈对数模式生长。

具体操作如下：

1.细胞常规培养：

当CMT-1培养达到90％融合时，用PBS洗涤3次，然后用0.25％胰蛋白酶(HyClone,USA)消化细胞5min，加入含血清15％的完全培养基终止消化，1000r/min离心5分钟，收集细胞，弃上清，加入新鲜培养基，吹匀细胞换入新的25cm²瓶中，浓度为1x10⁵cells/ml。记作CMT-1。每隔3d传代1次，分种率1:3。

2.Balb/SCID裸鼠荷瘤模型建立：

为了获得良好的小鼠异种移植模型，待细胞培养至90％，用0.25％胰蛋白酶消化细胞5min，加入含15％胎牛血清15％的完全培养基终止消化，1000r/min离心5分钟，收集细胞，进行细胞计数后，将按10⁸个犬乳F17细胞悬液(重悬于0.2ml PBS)分别皮下接种于10只5周龄雌性Balb/SCID裸鼠的左乳脂肪垫中。每周观察小鼠肿瘤的发生情况。当小鼠出现呼吸困难、虚弱或无明显肿瘤时处死。收集肿瘤和器官，置于4％多聚甲醛(pH＝7.4)中进行组织病理学检查。

进行试验观察与验证，荷瘤小鼠具有以下特征：

成瘤率：犬乳F17细胞接种于Balb/SCID裸鼠100％成瘤，肿瘤生长符合Gompertzian指数函数模型。

成瘤时间：犬乳F17细胞接种后一周即可观察到原注射细胞处皮下产生肿块，质地较硬，呈粉红色。

肿瘤生长情况：指数增殖期在第2-5周。

3.荷瘤小鼠肿瘤及癌症转移：

乳腺接种部位可见肿瘤细胞浸润侵袭皮下、真皮层，肿物深层均为坏死。肺脏组织内可见明显腺上皮来源细胞侵袭，成片分布，占位，实变，部分大面积肿瘤细胞浸润区域中心坏死。可见，该犬乳腺癌细胞系的子代细胞，基本或全部保留了亲代细胞的特性，稳定性较高。说明原位接种成瘤率和自发性肺转移率为100％，再现三阴性乳腺癌的临床特征，是一个比较理想可靠的研究模型，适用于犬三阴性乳腺癌的在体、体外研究，可以为肿瘤发生发展机制研究、药物靶点研究、为药物治疗机制研究提供很好体外试验模型。