具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

以下实施例所用的人肾癌细胞786-O细胞购自中科院；实施例所用的索拉非尼为北京索莱宝生物科技有限公司市售的5mg规格的产品。

本发明实施例提供一种肾癌索拉非尼耐药细胞株的构建方法，该构建方法包括如下步骤：

(a)将对数生长期的786-O细胞接种在培养瓶中并进行培养；

(b)待细胞融合至50％～60％时，向培养基中添加索拉非尼并进行传代培养，得到第三代细胞；再将第三代细胞依次置于索拉非尼浓度梯度递增的培养基中分别进行传代培养，其中，索拉非尼浓度梯度为1.8～2.2μM/L，每个培养基均传代培养至第三代细胞；

(c)待培养基中索拉非尼浓度不低于10μM/L时，传代培养50～70天，分离786-O细胞，即得所述肾癌索拉非尼耐药细胞株。

进一步地，步骤(b)中，向培养基中添加索拉非尼至终浓度为2～4μM/L；具体可以为2μM/L、3μM/L或4μM/L。

进一步地，步骤(b)中，索拉非尼浓度梯度递增的培养基中最低索拉非尼浓度为4～6μM/L。

在本发明中，对步骤(a)中培养的参数以及培养基的种类不作严格限制，可以采用本领域的常规培养基以及常规培养参数，例如，在一实施例方式中，培养采用的培养基为含10％胎牛血清的DMEM-f12培养液，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实施例1

本实施例为肾癌耐药株786-O/SORA细胞的诱导建立

复苏人肾癌细胞株786-O细胞后用含10％胎牛血清的DMEM f12培养液于37℃，5％CO₂培养箱中培养；取对数生长期的786-O细胞接种于96孔板(每孔1x10⁴个细胞)中并设7个复孔。为找寻细胞能够耐受索拉非尼的IC50(细胞的半抑制浓度)。48小时后加入不同浓度梯度的索拉非尼，各列培养孔中分别加入索拉非尼至终浓度为0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L 48小时后每孔各加100mLCCK8工作液，在培养箱中培养2小时后放入酶标仪以450nm波长检测，读出每孔的OD值并计算平均值，以时间为横坐标、OD值平均值为纵坐标，绘制成生长曲线，测出786-O/SORA细胞的IC50值，重复3次。

上述实验结果如图1所示，由图1可知：细胞能够耐受索拉非尼的IC50为4μmol/L，因此，确定筛选从浓度为4umol/L开始；具体构建方法如下：

(a)将对数生长期的786-O细胞接种在培养瓶中并进行培养，培养采用的培养基为含10％胎牛血清的DMEM-f12培养液，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％；

(b)待细胞融合至50％～60％时，向培养基中添加索拉非尼至终浓度为4μM/L并进行传代培养，得到第三代细胞；再将第三代细胞依次置于索拉非尼浓度梯度递增的培养基中分别进行传代培养，其中，索拉非尼浓度梯度为2μM/L，每个培养基均传代培养至第三代细胞；

(c)待培养基中索拉非尼浓度为10μM/L时，传代培养60天，分离786-O细胞，即得上述肾癌索拉非尼耐药细胞株(786-O/SORA)。

实施例2

本实施例为肝癌耐药株786-O/SORA细胞的形态学观察：

倒置相差显微镜观察活细胞形态分别取对数生长期的786-O对照细胞和786-O/SORA耐药细胞生理盐水清洗换液后，在倒置显微镜(x200倍)下观察活细胞形态，观察结果如图2所示；

由图2可知，通过光镜可以观察到786-O细胞大小基本一致，多为梭形，部分为圆形(图2左图)；而786-O/SORA细胞大小也基本一致，但细胞更加细长(图2右图)。

实施例3

本实施例为肾癌耐药株786-O/SORA细胞的生长曲线测定

取对数生长期的786-O细胞(786-O CON)和786-O/SORA(786-O SORA)细胞用0.5％EDTA的胰酶消化并计数，按每孔5000个细胞的密度接种入96孔板并设7个复孔，每孔再各加200L培养基，放置于37℃,5％CO₂培养箱中培养0h、12h、24h、48h、72h、96h；于各时间点吸弃培养基，每孔各加100mLCCK8工作液，在培养箱中培养2小时后放入酶标仪以450nm波长检测，读出每孔的OD值并计算平均值，以时间为横坐标、OD值平均值为纵坐标，绘制成生长曲线，如图3所示；

按照上述方法测定786-O(786-O CON)和786-O/SORA(786-O SORA)细胞在索拉非尼浓度为4μM/L的培养基中的生长曲线，如图4所示。

由图3可知，连续检测两细胞的生长状态后发现耐药细胞株786-O/SORA较正常肿瘤细胞株786-O CON的增殖速度更快，并在培养至96小时时曲线仍然向上，而此时正常肿瘤细胞株786-O/CON的生长曲线趋于平缓,显示耐药细胞株786-O/SORA具有更强的增殖能力。

由图4可知，在含有索拉非尼的培养基中，随着时间的延长，耐药细胞株786-O/SORA较正常肿瘤细胞株786-O CON的增殖速度更快，耐药细胞株具有更强的增殖能力。

实施例4

本实施例为786-O/SORA细胞株的细胞凋亡能力分析

1)将耐药细胞株786-O/SORA和正常肿瘤细胞株786-O分别铺于6孔板内，待细胞铺满60％，6孔分别加入含有0、1、2、4、8、16μM/L索拉非尼的培养基处理48h后用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，再用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃离心5min收集细胞。

2)用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5min。

3)吸弃PBS，加入100μL 1×Binding Buffer重悬细胞，调节其浓度为1×106细胞/mL。

4)加入5μL Annexin V/PE和10μL 7-AAD，轻轻混匀。

5)避光、室温反应10-15min。

6)加入400μL 1×Binding Buffer，混匀，样品在1h内用流式细胞仪检测，激发波长Ex＝488nm；发射波长Em＝578nm，Annexin V-PE的橙红色荧光建议使用FL2通道检测；激发波长Ex＝546nm；发射波长Em＝647nm，7-AAD红色荧光建议使用FL3通道检测。用CellQuest软件进行分析，绘制双色散点图(two-color dot plot)，PE为横坐标，7-AAD为纵坐标。每个样采集10,000events。细胞分成三个亚群，活细胞呈很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞呈较强的橙红色荧光，晚期凋亡细胞呈橙红和红色荧光双重染色。。

分析结果如图5所示，由图5可知：在SORA细胞IC50之前，随着索拉非尼浓度的升高，SORA细胞索拉非尼细胞凋亡率明显低于亲本细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5

本实施例为肾癌耐药株786-O/SORA细胞划痕能力修复实验

(1)传代细胞：将进入对数生长期的786-O细胞(正常细胞)和786-O/SORA细胞用0.5％胰酶消化处理，离心，弃上清,以完全培养基DMEM f12重悬细胞沉淀，吹匀后计数细胞并调整至所需细胞的浓度，种单细胞悬液于六孔板中，每孔细胞数为4x10⁵个。

(2)饥饿细胞：待24-48小时细胞贴壁，密度达90％时，将正常培养基换成不含生长因子或无血清的培养基，使细胞饥饿12小时。

(3)划痕：用100u1无菌枪头在每个孔中长满的单层细胞上迅速而轻轻地划1～3道痕1xPBS冲洗去掉脱落的细胞，更换无血清的培养基继续培养直至划痕的空间长满细胞。

(4)拍照观察：在显微镜下观察划痕修复的过程，分别取0h,24h,48h,72h,96h时间点拍照记录，比较不同细胞损伤修复速度的差异。

(5)计算：使用ImageJ计算0h及96h结果图片中细胞迁移面积进行对比，

计算结果如图6所示，由图6可知，与786-O对照细胞(Ctrl)相比较，786-O/SORA(Sorafenib)耐药细胞株的迁移速度更快。

实施例6

本实施例为786-O/SORA细胞P-gp、c-Met、AXL基因表达分析

P-gp蛋白(P-glyeoprotein,P-pg)属于ATP结合盒膜转运蛋白超家族，其具有ATP依赖性的药物外排功能，能将药物泵出细胞膜外而降低细胞内药物浓度。肿瘤细胞膜上的P-gp过度表达，是肿瘤细胞产生耐药的重要机制之一。

c-MET与AXL受体都是受体酪氨酸激酶(RTK)，在正常细胞发育和运动中发挥重要作用。异常激活c-MET与AXL可导致肿瘤生长和癌细胞转移进展。

逆转录获得互补脱氧核糖核酸cDNA：

1、将786-O细胞(对照组)、786-O/SORA细胞分别种于6孔板中，培养至密度70％-80％，倒掉培养基，预冷PBS冲洗3遍，吸干净PBS后加入1ml Trizol，使用1ml枪头冰上研磨，收集到1.5mlEP管中，室温放置5min。

2、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，颠倒混匀30次后室温放置15min。

3、4℃12000r离心15min。

4、吸取上层水相400ul，至另一离心管中。

5、加入等体积(400ul)异丙醇混匀，-20过夜。

6、4℃12000r离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

7、加入1ml 70％乙醇(无酶水配置)，温和均匀，悬浮沉淀。

8、4℃12，000r离心10min，弃上清。

9、4℃12000r离心10s，使用白枪头吸出多余乙醇，将EP管倒扣于滤纸上。

10、室温晾干5-10min。

11、可用20ul H20(无RNA酶水)，冰上或室温，5-10min。

12、用紫外分光光度计测定RNA浓度，-20℃保存。

13、逆转录合成cDNA第一链:

(1)取RNA 2pl，5xqDNA Buffer(TianGen公司)2μl，DEPC水补至10pl；将基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀；简短离心，并置于42℃，孵育3min；然后置于冰上放置。

(2)配制反转录反应体系混合液：10×King RT Buffer 2μl、Fastking RT EnzymeMix 1μl、FQ-RT Primer Mix 2μl、RNase-Free ddH₂0补足到10μl。将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀，42℃，孵育15min，95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA于-20备用。

14、荧光定量PCR步骤(1)反应体系如下(20μl)

引物序列(此引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成)；

GGGAGCTTAACACCCGACTT P-gp-forward；

CAGCAGCTGACAGTCCAAGA P-gp-reverse；

GTCCCCAATGACCTGCTGAA c-Met-forward；

AGTTGGGCTTACACTTCGGG c-Met-reverse；

CACCCCAGAGGTGCTAATGG AXL-forward；

GGTGGACTGGCTGTGCTT AXL-reverse；

(2)反应条件：95℃预变性30sec，(95℃变性10sec，60℃退火30sec)×38个循环，95℃终末变性30sec，60℃终末退火1min，95℃终末延伸15sec用AppliedBiosystems7500Fast Real-Time PCR System软件分析，分析结果如图7所示；

由图7可知，与正常细胞相比，786-O/SORA细胞的P-gp、c-MET与AXL基因的mRNA的含量明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。