具体实施方式

过继细胞转移免疫疗法依靠免疫细胞活化和细胞因子分泌来消除患病细胞。然而，细胞因子的全身过量产生会引起安全问题，并且有时对受者可能是致命的。Morgan等人，《分子疗法(Molecular Therapy)》18(4):843-851,2010。本公开旨在部分地通过开发具有降低的炎性特性的免疫细胞来克服这种限制。细胞因子释放综合征(CRS)是与CAR-T细胞疗法相关的常见毒性类型。托珠单抗是一种抗IL6R抗体，常用于缓解CAR-T疗法中的CRS。然而，在CAR-T疗法后出现CRS的患者中，高水平的IL-6仍会循环。此类IL-6分子可以通过血脑屏障，这可能导致严重的神经毒性。此外，接受CAR-T疗法的患者发生CRS的时间是不可预测的，这使得决定何时应给予患者托珠单抗具有挑战性。如果患者出现CRS并且无法立即获得托珠单抗治疗，则会危及生命。

本公开至少部分地基于特异性抗IL-6或抗IL-6R抗体的鉴定，其相对于其他IL-6拮抗性抗体在抑制IL-6信号传导方面显示出优异的效果。预期此类抗IL-6和抗IL-6R抗体将更有效地减少与由IL-6信号传导介导的T细胞免疫疗法相关的副作用。不受理论的束缚，本文公开的方法涉及单独使用CAR-T疗法自动产生IL-6拮抗剂(例如，本文公开的那些)。当CAR-T细胞靶向并杀死肿瘤细胞时，CAR-T细胞会产生本文公开的任何IL-6拮抗剂，例如结合IL-6的scFv抗体。同时，CAR-T细胞介导的肿瘤细胞杀伤会刺激宿主免疫系统释放IL-6。从时间上看，CAR-T细胞产生IL-6拮抗剂会早于宿主免疫系统释放IL-6，预期达到更好的针对IL-6释放的中和效果。本文提供的临床数据已证明在CAR-T疗法期间成功中和了IL-6风暴，使托珠单抗治疗变得不必要。

如本文公开的，共表达靶向癌抗原(例如，CD19或BCMA)的CAR、IL-6拮抗剂和任选地IL-1拮抗剂的基因工程免疫细胞(例如，T细胞)在患有各种类型癌症(包含白血病、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤)的人类患者中显示出优异的治疗效果。接受CAR-T疗法的患者表现出CRS严重程度降低、神经毒性降低或无神经毒性，和/或与CAR-T细胞疗法相关的其他常见副作用(例如发烧、缺氧和/或低血压)减少或无所述副作用，即使在缺乏涉及抗CRS药物诸如IL-6拮抗剂的治疗的情况下。

因此，本文提供了表达嵌合抗原受体(CAR)和一种或多种如本文所述的那些的IL-6拮抗性抗体的修饰免疫细胞及其治疗应用。

I.修饰免疫细胞

本公开的一方面提供了与相同类型的野生型免疫细胞相比具有降低的炎性特性的修饰免疫细胞。野生型细胞是指没有此类敲入和敲除修饰的那些细胞。此类修饰免疫细胞可包括如本文所公开的一种或多种IL-6拮抗性抗体的敲入，以及任选地对目标抗原(例如，癌抗原)具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)。在一些情况下，修饰免疫细胞可以进一步包括敲入一种或多种IL-1拮抗剂，例如IL-1RA或本领域已知的或本文公开的其他IL-1拮抗剂。在一些实施例中，修饰免疫细胞可进一步包括一种或多种内源基因(例如，GM-CSF和/或TCR)的敲除修饰。在其他实施例中，修饰免疫细胞可包括野生型内源性GM-CSF基因、野生型TCR基因或两者。

(i)拮抗性IL-6抗体

IL-6通过包括膜糖蛋白gp130和IL-6受体(IL6R)的复合物发出信号(参见例如Hibi等人，《细胞(Cell)》，63(6):1149-57,1990)。IL-6与靶细胞上的IL6R的结合促进gp130同源二聚化和随后的信号转导。如本文所用，IL6R包含IL6R的膜结合形式和可溶性形式(sIL6R)二者。当与IL-6结合时，可溶性IL6R(sIL6R)充当激动剂，并且还可以促进gp130二聚化和信号传导。可以发生跨信号传导，由此特定细胞类型分泌的sIL-6R诱导仅表达gp130的细胞对IL-6作出反应(参见例如，Taga等人，《免疫学年鉴(Annu Rev Immunol.)》，15:797-819,1997；和Rose-John等人，《生物化学杂志(Biochem J.)》，300(Pt2):281-90,1994)。在一个实例中，sIL6R包括人IL6R的胞外结构域(参见例如Peters等人，《实验医学杂志(J Exp Med.)》，183(4):1399-406,1996)。

在一些实施例中，本文公开的修饰免疫细胞表达拮抗性IL-6抗体，其可以是结合IL-6或结合IL-6受体(IL-6R)的抗体。此类抗体(拮抗性抗体)可干扰免疫细胞上的IL-6/IL-6R的结合，从而抑制由IL-6介导的细胞信号传导。

典型的抗体分子包括重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)，其通常参与抗原结合。V_H和V_L区可以进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“CDR”)，散布有更保守的区域，称为“框架区”(“FR”)。每个V_H和V_L通常由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可以使用本领域已知的方法，例如通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义来精确鉴定框架区和CDR的范围，所有这些在本领域中都是众所周知的。参见，例如Kabat,E.A.等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第五版，美国卫生与公众服务部，美国国立卫生研究院出版物编号91-3242,Chothia等人，(1989)《自然(Nature)》342:877；Chothia,C.等人(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917,Al-lazikani等人(1997)《分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)》273:927-948；和Almagro，《分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)》17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。

如本文所用的抗体(与复数形式互换使用)是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点与靶蛋白例如IL-6或IL-6R特异性结合。如本文所用，术语“抗体”不仅包括完整(即全长)抗体，还包括其抗原结合片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和包括所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，包含抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体包含任何类别的抗体，诸如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且该抗体不需要属于任何特定类别。根据抗体重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白有五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干类可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

在一些实施例中，本文所述的抗体可特异性结合靶蛋白或其受体。与靶标或表位“特异性结合”(在本文中可互换使用)的抗体是本领域熟知的术语，并且确定此类特异性结合的方法也是本领域众所周知的。如果分子与特定靶抗原的反应或结合和与替代靶抗原的反应或结合相比更频繁、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更大，则称该分子表现出“特异性结合”。如果抗体与靶细胞因子的结合和与其他物质的结合相比亲和力更大、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长，则该抗体与靶细胞因子“特异性结合”。例如，特异性(或优先)结合IL-6或IL-6R表位的抗体是与IL-6或IL-6R表位的结合和与其他IL-6表位、非IL-6表位、其他IL-6R表位或非IL-6R表位结合相比亲和力更大、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长。通过阅读该定义还可以理解，例如，特异性结合第一靶抗原的抗体可以或可以不特异性或优先结合第二靶抗原。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包含)排他性结合。通常，但不一定，提及结合意味着优先结合。

在一些实施例中，如本文所述的靶蛋白的拮抗性抗体对靶蛋白(例如，人IL-6或人IL-6R)或其抗原表位具有合适的结合亲和力。如本文所用，“结合亲和力”是指表观结合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。本文所述的拮抗性抗体对靶抗原或抗原表位可具有至少10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10M或更低的结合亲和力(KD)。增加的结合亲和力对应于降低的KD。相对于第二抗原，抗体对第一抗原的更高亲和力结合可以由与结合第二抗原的KA(或数值KD)相比更高的结合第一抗原的KA(或更小的数值KD)表示。在此类情况下，相对于第二抗原(例如，第二构象的相同第一蛋白质或其模拟物；或第二蛋白质)，抗体对第一抗原(例如，第一构象的第一蛋白质或其模拟物)具有特异性。在一些实施例中，与对前体形式的靶蛋白或另一种蛋白质例如和靶蛋白相同家族的炎性蛋白质的结合亲和力相比，本文所述的拮抗性抗体对成熟形式的靶蛋白具有更高的结合亲和力(更高的KA或更小的KD)。结合亲和力的差异(例如，用于特异性或其他比较)可以是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000、10,000或10⁵倍。

结合亲和力(或结合特异性)可以通过多种方法确定，包含平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振或光谱(例如，使用荧光测定)。用于评估结合亲和力的示例性条件是在HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.005％(v/v)表面活性剂P20)中。这些技术可用于测量作为靶蛋白浓度函数的已结合的结合蛋白的浓度。已结合的结合蛋白的浓度([结合])通常与游离靶蛋白的浓度([游离])有关，公式如下：

[结合]＝[游离]/(Kd+[游离])

然而，并不总是需要准确确定KA，因为有时足以获得亲和力的定量测量，例如，使用方法诸如ELISA或FACS分析确定，其与KA成正比，并且因此可以用于比较，诸如确定更高的亲和力是否是例如高2倍，以获得亲和力的定性测量，或获得亲和力的推断，例如通过功能测定如体外或体内测定中的活性。

在一些实施例中，本文所述的IL-6拮抗性抗体可以结合并抑制IL-6信号传导至少50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％或更高)。本文所述的IL-6拮抗性抗体的抑制活性可以通过本领域已知的常规方法确定。

本文所述的抗体可以是鼠、大鼠、人或任何其他来源(包含嵌合或人源化抗体)。此类抗体是非天然存在的，即在没有人类行为的情况下不会在动物中产生(例如，用所需抗原或其片段免疫此类动物)。

本文所述的任何抗体可以是单克隆的或多克隆的。“单克隆抗体”是指同质抗体群，并且“多克隆抗体”是指异质抗体群。这两个术语不限制抗体的来源或其制备方式。

在一个实例中，本文所述方法中使用的抗体是人源化抗体。人源化抗体是指非人(例如，鼠)抗体形式，其是含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其抗原结合片段。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替代。在一些情况下，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包括既不在受体抗体中也不在输入的CDR或框架序列中发现的残基，但被包含以进一步精制和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包括基本上所有的至少一个且通常为两个的可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区和所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最优还将包括至少一部分免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。抗体可具有如WO99/58572中所述修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个和/或六个)，它们相对于原始抗体发生了改变，也称为“源自”一个或多个来自原始抗体的CDR的一个或多个CDR。人源化抗体也可能涉及亲和力成熟。

下面提供了示例性抗IL-6抗体和抗IL-6R抗体的重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)(参考抗体1-6)，其中CDR以粗体显示(按照bioinf.org.uk/abs/描述的规则确定)：

抗体1(结合IL-6R)：

V_H(SEQ ID NO:1):

V_L(SEQ ID NO:2):

抗体2(结合IL-6)：

V_H(SEQ ID NO:3):

V_L(SEQ ID NO:4):

抗体3(结合IL-6)：

V_H(SEQ ID NO:5):

V_L(SEQ ID NO:6):

抗体4(结合IL-6R)：

V_H(SEQ ID NO:7):

V_L(SEQ ID NO:8):

抗体5(结合IL-6)：

V_H(SEQ ID NO:9):

V_L(SEQ ID NO:10):

抗体6(结合gp130)：

V_H(SEQ ID NO:11):

V_L(SEQ ID NO:12):

在一些实施例中，本文所述的IL-6拮抗性抗体结合IL-6抗原(例如，人IL-6)或IL-6R(例如，人IL-6R)中与本文提供的参考抗体(例如，抗体1或抗体2)之一相同的表位或与参考抗体竞争结合IL-6或IL-6R抗原。本文提供的参考抗体包含抗体1-6，本文提供了它们各自的结构特征和结合活性。与本文所述的参考抗体结合相同表位的抗体可以结合与参考抗体完全相同的表位或基本重叠的表位(例如，含有少于3个非重叠氨基酸残基、少于2个非重叠氨基酸残基，或只有1个非重叠氨基酸残基)。两种抗体是否彼此竞争与同源抗原结合可以通过本领域众所周知的竞争测定来确定。此类抗体可以如本领域技术人员已知的那样被鉴定，例如，具有基本相似的结构特征(例如，互补决定区)的那些，和/或通过本领域已知的测定鉴定的那些。例如，可以使用参考抗体之一进行竞争测定以确定候选抗体是否与参考抗体结合相同的表位或竞争其与IL-6或IL-6R抗原的结合。

在一些情况下，本文公开的IL-6拮抗性抗体可包括与本文公开的参考抗体(例如抗体1或抗体2)相同的重链CDR和/或相同的轻链CDR。重链和/或轻链CDR是负责抗原结合的区域/残基；此类区域/残基可以通过本领域已知的方法从参考抗体的重链/轻链序列的氨基酸序列(如上所示)鉴定。参见，例如www.bioinf.org.uk/abs；Almagro,《分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)》17:132-143(2004)；Chothia等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》227:799-817(1987)，以及本领域已知的或本文公开的其他内容。确定抗体中的CDR区在本领域技术范围内，例如，本文公开的方法，例如Kabat方法(Kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,(第五版，1991，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达))或Chothia方法(Chothia等人，1989，《自然(Nature)》342:877；Al-lazikani等人(1997)《分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)》273:927-948)。如本文所用，CDR可以指通过本领域已知的任何方法定义的CDR。具有相同CDR的两种抗体是指通过相同方法测定的两种抗体具有该CDR的相同氨基酸序列。

还在本公开范围内的是如本文公开的任何示例性抗IL-6或抗IL-6R抗体(例如，抗体1或抗体2)的功能性变体。相对于参考抗体，功能性变体可在V_H和/或V_L、或在一个或多个HC CDR和/或一个或多个LC CDR中含有一个或多个氨基酸残基变异，同时保留与参考抗体基本相似的结合和生物活性(例如，基本相似的结合亲和力、结合特异性、抑制活性或其组合)。

在一些实例中，本文公开的IL-6拮抗性抗体包括HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，它们共同含有不超过10个氨基酸变异(例如，不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体诸如抗体1或抗体2的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3相比。“共同”是指所有三个HCCDR的氨基酸变异的总数都在定义的范围内。可替代地或另外，抗IL-6或抗IL6R抗体可包括LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，它们共同含有不超过10个氨基酸变异(例如，不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3相比。

在一些实例中，本文公开的IL-6拮抗性抗体可包括HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其中至少一个含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体诸如抗体1或抗体2的对应HC CDR相比。在具体实例中，抗体包含HC CDR3，其含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体诸如抗体1或抗体2的HCCDR3相比。可替代地或另外，IL-6拮抗性抗体可包括LC CDR1、LC CDR2、和LC CDR3，其中至少一个含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体的对应LC CDR相比。在具体实例中，抗体包括LC CDR3，其含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体的LC CDR3相比。

在一些情况下，氨基酸残基变异可以是保守的氨基酸残基置换。如本文所用，“保守氨基酸置换”是指不改变进行氨基酸置换的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸置换。变体可以根据本领域普通技术人员已知的改变多肽序列的方法来制备，诸如在汇编此类方法的参考文献中发现的方法，例如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，J.Sambrook等人，eds.,第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989，或《分子生物学当前协议(Current Protocols in Molecular Biology)》，F.M.Ausubel等人，eds.,约翰·威利父子出版公司，纽约。氨基酸的保守置换包含在以下组内的氨基酸之间进行的置换：((a)A→G,S；(b)R→K,H；(c)N→Q,H；(d)D→E,N；(e)C→S,A；(f)Q→N；(g)E→D,Q；(h)G→A；(i)H→N,Q；(j)I→L,V；(k)L→I,V；(l)K→R,H；(m)M→L,I,Y；(n)F→Y,M,L；(o)P→A；(p)S→T；(q)T→S；(r)W→Y,F；(s)Y→W,F；和(t)V→I,L。

在一些实施例中，本文公开的IL-6拮抗性抗体可包括与参考抗体诸如抗体1或抗体2的重链CDR共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的重链CDR。可替代地或另外，抗体可包括与参考抗体的轻链CDR共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的轻链CDR。在一些实施例中，IL-6拮抗性抗体可包括与参考抗体诸如抗体1或抗体2的重链可变区具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的重链可变区和/或与参考抗体的轻链可变区具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的轻链可变区。

两个氨基酸序列的“同一性百分比”使用Karlin和Altschul《美国科学学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87:2264-68,1990(在Karlin和Altschul《美国科学学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》90:5873-77,1993中改进)的算法确定。此类算法被合并到Altschul等人《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与目标蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在间隙的情况下，可以如Altschul等人，《核酸综述(Nucleic Acids Res.)》25(17):3389-3402,1997所述利用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。

本公开还提供了本文公开的任何参考IL-6拮抗性抗体的种系变体。相对于其针对相应种系序列的亲本抗体，种系变体在构架区中含有一个或多个突变。为了制备种系变体，亲本抗体或其部分的重链或轻链可变区序列(例如，框架序列)可用作针对抗体种系序列数据库(例如，bioinfo.org.uk/abs/,www.vbase2.org或imgt.org)的查询以识别亲本抗体使用的相应种系序列以及种系序列和亲本抗体之间的一个或多个框架区中的氨基酸残基变异。然后可以基于种系序列将一个或多个氨基酸置换引入亲本抗体以产生种系变体。

在一些实例中，本文所述的拮抗性抗体是人抗体或人源化抗体。可替代地或另外，拮抗性抗体是单链抗体(scFv)。下面提供了示例性的scFv抗体。

IL6/IL6R scFv 1(SEQ ID NO:13):

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQANSFPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASRFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAENSLFLQMNGLRAEDTALYYCAKGRDSFDIWGQGTMVTVSS

IL6/IL6R scFv 2(SEQ ID NO:14):

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASISVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDMSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQWSGYPYTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLWGYYALDIWGQGTTVTVSS

IL6/IL6R scFv 3(SEQ ID NO:15):

QIVLIQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSGYPYTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGKLLKPGGSLKLSCAASGFTFSSFAMSWFRQSPEKRLEWVAEISSGGSYTYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCARGLWGYYALDYWGQGTSVTVSS

IL6/IL6R scFv 4(SEQ ID NO:16):

QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSGGGGSGGRASGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIK

(ii)对GM-CSF具有特异性的抗体

粒细胞——巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，也称为集落刺激因子2(CSF2)，是一种由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的单体糖蛋白。GM-CSF充当细胞因子并刺激干细胞产生粒细胞(例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞)和单核细胞。GM-CSF可触发免疫/炎症级联，激活少量巨噬细胞可借此迅速导致其数量增加，这是对抗感染的关键过程。GM-CSF也可能对免疫系统的成熟细胞有影响，例如，抑制嗜中性粒细胞迁移并导致细胞表面上表达的受体发生改变。

在一些实施例中，本文公开的修饰免疫细胞表达对GM-CSF具有特异性的抗体，单独或与本文公开的任何其他抑制剂组合，例如拮抗性IL-6抗体，其可以是结合IL-6或结合IL-6受体(IL-6R)的抗体。此类抗体(拮抗性抗体)可以抑制由GM-CSF介导的细胞信号传导，从而下调由GM-CSF触发的免疫反应。

本文所述的抗GM-CSF抗体可以具有任何形式和/或来自任何合适的物种，例如其完整的(即全长)、抗原结合片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和任何其他修饰的包括所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的构型，包含抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。在一些实施例中，本文所述的抗GM-CSF抗体可特异性结合特定物种例如人GM-CSF的GM-CSF。

在一些实施例中，本文所述的抗GM-CSF抗体可对靶蛋白或其抗原表位具有合适的结合亲和力。例如，抗GM-CSF抗体可对靶抗原或抗原表位(例如，人GM-CSF或其抗原表位)具有至少10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10M或更低的结合亲和力(KD)。在一些实施例中，本文所述的抗GM-CSF抗体可以结合并抑制GM-CSF信号传导至少50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％或更多)。本文所述的抗GM-CSF抗体的抑制活性可以通过本领域已知的常规方法确定。

下面提供了示例性抗GM-CSF抗体的重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)(参考抗体7至9)，其中CDR以粗体显示(按照bioinf.org.uk/abs/描述的规则确定)：

参考抗体7：

V_H(SEQ ID NO:17):

V_L(SEQ ID NO:18):

参考抗体8：

V_H(SEQ ID NO:19):

V_L(SEQ ID NO:20):

参考抗体9：

V_H(SEQ ID NO:21):

V_L(SEQ ID NO:22):

在一些实施例中，本文描述的抗GM-CSF抗体与本文提供的参考抗体之一诸如抗体9结合GM-CSF抗原中的相同表位或与参考抗体竞争结合GM-CSF抗原。本文提供的参考抗体包含抗体7至9，本文提供了它们各自的结构特征和结合活性。此类抗体可以如本领域技术人员已知的那样被鉴定，例如，具有基本相似的结构特征(例如，互补决定区)的那些，和/或通过本领域已知的测定鉴定的那些。例如，可以使用参考抗体之一进行竞争测定以确定候选抗体是否与参考抗体结合相同的表位或竞争其与GM-CSF抗原的结合。

在一些情况下，本文公开的抗GM-CSF抗体可以包括与本文公开的参考抗体(例如抗体9)相同的重链CDR和/或相同的轻链CDR。重链和/或轻链CDR是负责抗原结合的区域/残基；此类区域/残基可以通过本领域已知的方法从参考抗体的重链/轻链序列的氨基酸序列(如上所示)鉴定。还参见上述描述。

还在本公开范围内的是如本文公开的任何示例性抗GM-CSF抗体(例如，抗体9)的功能性变体。相对于参考抗体，功能性变体可以在V_H和/或V_L中，或在一个或多个HC CDR和/或一个或多个LC CDR中含有一个或多个氨基酸残基变异，同时保持与参考抗体基本相似的结合和生物学活性(例如，基本上相似的结合亲和力、结合特异性、抑制活性或其组合)。

在一些实例中，本文公开的抗GM-CSF抗体包括HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，它们共同含有不超过10个氨基酸变异(例如，不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体诸如抗体9的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3相比。可替代地或另外，抗GM-CSF抗体可以包括LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，它们共同含有不超过10个氨基酸变异(例如，不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3相比。

在一些实例中，本文公开的抗GM-CSF抗体可包括HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，它们中的至少一个含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体诸如抗体9的对应HC CDR相比。在具体实例中，抗体包括HC CDR3，其含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体诸如抗体9的HC CDR3相比。可替代地或另外，本文所述的抗GM-CSF抗体可包括LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，它们中的至少一个含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体的对应LC CDR相比。在具体实例中，抗体包括LC CDR3，其含有不超过5个氨基酸变异(例如，不超过4、3、2或1个氨基酸变异)，与参考抗体的LC CDR3相比。在一些情况下，氨基酸残基变异可以是保守的氨基酸残基置换。

在一些实施例中，本文公开的抗GM-CSF抗体可包括与参考抗体如抗体9的重链CDR共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的重链CDR。可替代地或另外，该抗体可包括与参考抗体的轻链CDR共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的轻链CDR。在一些实施例中，抗GM-CSF抗体可包括与参考抗体诸如抗体9的重链可变区具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的重链可变区和/或与参考抗体的轻链可变区具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)同一性的轻链可变区。在一些实施例中，本文描述的抗GM-CSF抗体可以是本文描述的任何示例性抗GM-CSF抗体的种系变体，例如抗体9。

在一些实例中，本文所述的抗GM-CSF抗体是人抗体或人源化抗体。可替代地或另外，拮抗性抗体是单链抗体(scFv)。下面提供了示例性的scFv抗体。

GM-CSF scFv1(SEQ ID NO:23):

GM-CSF scFv2(SEQ ID NO:24):

GM-CSF scFv3(SEQ ID NO:25):

(iii)对IL-6和GM-CSF具有特异性的双特异性抗体

本文还提供了针对IL-6和GM-CSF二者的双特异性抗体。双特异性抗体包括两个结合部分，一个对IL-6/IL-6R具有特异性，并且另一个对GM-CSF具有特异性。双特异性抗体可以具有本领域已知的或本文公开的任何形式。在一些实施例中，对IL-6/IL-6R具有特异性的结合部分可以源自本文所述的任何示例性IL-6拮抗剂抗体(例如，抗体1或抗体2)或也如本文所述的其功能性变体。可替代地或另外，对GM-CSF具有特异性的结合部分可源自本文所述的任何示例性抗GM-CSF抗体(例如，抗体9)或也如本文所述的其功能性变体。

在一些实施例中，本文所述的双特异性抗体可配置为单一融合多肽，其包括对具有IL-6/IL-6R特异性的第一scFv片段和对GM-CSF具有特异性的第二scFv片段。两个scFv片段可以通过肽接头连接。示例性双特异性抗体提供如下：

双特异性Ab1(粗体和斜体的肽接头)(SEQ ID NO:26)：

双特异性Ab2(粗体和斜体的肽接头)(SEQ ID NO:27)：

双特异性Ab3(粗体和斜体的肽接头)(SEQ ID NO:28)：

(iv)IL-1拮抗剂

白介素-1是本领域已知的细胞因子并且包含两种同种型IL-1α和IL-1β。IL-1在急性炎症以及其他生物学途径的上调和下调中起重要作用。

在一些实施例中，在本文公开的修饰免疫细胞中表达的IL-1拮抗剂可以是白介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)。IL-1RA是一种天然存在的多肽，可由多种细胞分泌，诸如免疫细胞、上皮细胞和脂肪细胞。它与细胞表面IL-1R受体结合，从而阻止由IL-1/IL-1R相互作用触发的细胞信号传导。人IL-1RA由IL1RN基因编码。以下是人IL-1RA的示例性氨基酸序列(SEQIDNO:29)：

黑体和斜体的N端片段是指天然IL-1RA中的信号肽。用于本申请的IL-1RA可以包括对应于上述人IL-1RA的成熟多肽的氨基酸序列(不包括信号肽)。以下是成熟人IL-1RA的示例性氨基酸序列(SEQID NO:58)：

RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTS FESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE

在一些情况下，该信号肽可以被不同的信号序列替换，例如，MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA(SEQ ID NO:59)。所得IL-1RA将具有完整序列(SEQ ID NO:60)：

其他IL-1拮抗剂包含但不限于抗IL-1α或抗IL-1β抗体。

(v)嵌合抗原受体(CAR)

本文公开的修饰免疫细胞可以进一步表达嵌合抗原受体，该受体是一种人工细胞表面受体，其将免疫细胞(例如，T细胞)与CAR结合的病理抗原的结合特异性重定向，从而通过例如免疫细胞的效应活性消除靶患病细胞。CAR构建体通常包括与至少胞内信号传导结构域融合的胞外抗原结合结构域。Cartellieri等人，《生物医学与生物技术杂志(J BiomedBiotechnol)》2010:956304,2010。可以是单链抗体片段(scFv)的胞外抗原结合结构域对目标抗原(例如病理性抗体，诸如癌抗原)具有特异性，并且胞内信号传导结构域可以介导导致免疫细胞活化的细胞信号传导。因此，表达对目标抗原具有特异性的CAR构建体的免疫细胞可以与表达抗原的患病细胞(例如，肿瘤细胞)结合，导致免疫细胞的活化和患病细胞的消除。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域靶向肿瘤抗原，诸如CD19或BCMA。在具体实例中，胞外抗原结合结构域是结合CD19的单链抗体片段，例如SEQ ID NO:52。在其他实例中，胞外抗原结合结构域是与BCMA结合的单链抗体片段，例如SEQ ID NO:57。

本文公开的CAR构建体可以包括一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实例中，CAR包括胞内信号传导结构域，其包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。此类胞内信号传导结构域可以来自CD3ζ、CD3δ/ε、CD3γ/ε，或来自MHC I类分子或合适受体的胞内信号传导结构域，例如TNF受体、免疫球蛋白样受体、Fc受体、细胞因子受体、活化NK细胞受体、BTLA、整联蛋白或Toll配体受体。此外，CAR构建体可以进一步包括一个或多个共刺激信号传导结构域，其可以来自共刺激受体，例如，信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM)、OX40,CD2,CD7,CD27,CD28,CD30,CD40,CDS,ICAM-1,LFA-1(CDlla/CD18),4-1BB(CD137),B7-H3,CDS,ICAM-1,ICOS(CD278),GITR,BAFFR,LIGHT,HVEM(LIGHTR),KIRDS2,SLAMF7,NKp80(KLRF1),NKp44,NKp30,NKp46,CD19,CD4,CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4,VLAl,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD1 Id,ITGAE,CD103,ITGAL,CDlla,LFA-1,ITGAM,CDllb,ITGAX,CDllc,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,NKG2D,NKG2C,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Lyl08),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,LAT,GADS,SLP-76,PAG/Cbp、CD19a或与CD83特异性结合的配体。

本文公开的CAR构建体可进一步包括跨膜铰链结构域，其可从合适的细胞表面受体例如CD28或CD8获得。在一些情况下，CAR构建体可进一步包括铰链结构域，其可位于跨膜结构域和胞内信号传导结构域之间。

(vi)具有IL-6拮抗性抗体、抗GM-CSF抗体和/或IL-1拮抗剂敲入修饰免疫细胞

本文还提供了免疫细胞群，其包括具有如本文所述的IL-6拮抗性抗体(例如，scFv1或scFv2)、抗GM-CSF抗体、IL-1拮抗剂或其组合的敲入修饰的修饰细胞，以及任选地CAR构建体。在一些情况下，IL-6拮抗性抗体和抗GM-CSF抗体可以具有双特异性抗体的形式，例如本文所述的那些。

在一些实施例中，基因修饰免疫细胞可包括IL-6拮抗剂(例如，抗IL-6拮抗性抗体，诸如scFv1或scFv2)和IL-1拮抗剂诸如IL-1RA的敲入修饰。此类免疫细胞可以具有内源性GM-CSF基因并且任选地还具有内源性TCR基因。可替代地，免疫细胞可具有内源性GM-CSF基因和破坏的内源性TCR基因。

本文公开的修饰免疫细胞包括敲入修饰以表达拮抗性IL-6抗体、抗GM-CSF抗体、结合IL-6/IL-6R和GM-CSF的双特异性抗体、本文公开的IL-1拮抗剂，或其组合。敲入修饰可包括将编码IL-6拮抗剂抗体、抗GM-CSF抗体、双特异性抗体、本文公开的IL-1拮抗剂，或其组合的一种或多种外源核酸递送至宿主细胞(例如，如本文所述的免疫细胞)。外源核酸与合适的启动子可操作的连接，使得编码的蛋白质(例如，细胞因子拮抗剂和/或免疫抑制性细胞因子)可以在宿主细胞中表达。在一些情况下，编码IL-6拮抗性抗体的外源核酸可以整合到宿主细胞的基因组中。在其他情况下，外源核酸可能保留在染色体外(未整合到基因组中)。

在一些情况下，任何修饰免疫细胞可以包括进一步的敲入修饰以表达本文公开的CAR构建体。

包括一种或多种敲入修饰的修饰免疫细胞可包括一种或多种外源核酸(例如，外源表达盒)，以用于表达如本文所述的一种或多种目标炎性蛋白的免疫抑制性细胞因子和/或拮抗剂。出于本公开的目的，应明确理解术语“拮抗剂”涵盖所有先前确定的术语、名称和功能状态和特征，由此靶蛋白本身、靶蛋白的生物活性或生物活性的结果在任何有意义的程度上基本上被取消、降低或中和例如至少20％、50％、70％、85％、90％或更多。

本文公开的修饰免疫细胞还可包括敲除一种或多种炎性蛋白(例如，炎性细胞因子或其可溶性受体、炎性生长因子或细胞毒性分子)、敲入一种或多种炎性蛋白拮抗剂或免疫抑制性细胞因子或其组合。

示例性的炎性细胞因子或其可溶性受体包含白介素1α(IL1α)、白介素1β(IL1β)、白介素2(IL-2)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素8(IL-8)、白介素9(IL-9)、白介素(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素17(IL-17)、白介素18(IL-18)、白介素21(IL-21)、白介素23(IL-23)、sIL-1RI、sIL-2Rα、可溶性IL-6受体(sIL6R)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、巨噬细胞炎性蛋白(如MIPα和MIPβ)、巨噬细胞集落刺激因子1(CSF1)、白血病抑制因子(LIF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、肿瘤坏死因子(TNF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、γ干扰素诱导单核细胞因子(MIG)、晚期糖基化终产物受体(RAGE)、c反应蛋白(CRP)、血管生成素-2和血管性血友病因子(VWF)。

目标炎性蛋白的实例包含但不限于炎性细胞因子或其可溶性受体(例如，IL2,IL1α,IL1β,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-12,IL-15,IL-17,IL-18,IL-21,IL-23,sIL-1RI,sIL-2Rα,sIL6R,IFNα,IFNβ,IFNγ,MIPα,MIPβ,CSF1,LIF,G-CSF,GM-CSF,CXCL10,CCL5、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2和VWF)、炎性生长因子(例如，TGFα、VEGF、EGF、HGF和FGF)和细胞毒性分子(例如，穿孔素、颗粒酶和铁蛋白)。

如本文所述的免疫细胞群可以进一步修饰以表达外源细胞因子、嵌合synNotch受体、嵌合免疫受体、嵌合共刺激受体、嵌合杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和/或外源T细胞受体。这可以在敲入和/或敲除修饰之前、之后或同时进行。可以使用常规重组技术将此类受体克隆并整合到任何合适的表达载体中。设计嵌合抗原受体的考虑也是本领域已知的。参见，例如，Sadelain等人，《癌症发现(Cancer Discov.)》，3(4):388-98,2013。

本文公开的免疫细胞可以是T细胞、NK细胞、树突细胞、巨噬细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、髓源性抑制细胞、间充质干细胞、其前体或其组合。

II.制备修饰免疫细胞的方法

可通过本文所述的常规方法和/或途径将任何敲入和敲除修饰引入合适的免疫细胞。通常，此类方法将涉及将遗传物质递送到合适的免疫细胞中以下调目标内源性炎性蛋白的表达、表达目标细胞因子拮抗剂或表达目标免疫抑制性细胞因子。

(A)敲入修饰

为了产生本文所述的一种或多种细胞因子拮抗剂的敲入，可将本文所述的任何拮抗剂和/或免疫抑制性细胞因子的编码序列克隆到合适的表达载体(例如，包含但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关载体、PiggyBac转座子载体和SleepingBeauty转座子载体)，并使用常规重组技术引入宿主免疫细胞。Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)》，第三版，冷泉港实验室出版社。因此，本公开的修饰免疫细胞可包括一种或多种编码至少一种细胞因子拮抗剂或至少一种免疫抑制性细胞因子的外源核酸。在一些情况下，一种或多种拮抗剂和/或一种或多种免疫抑制性细胞因子的编码序列被整合到细胞的基因组中。在一些情况下，一种或多种拮抗剂的编码序列未整合到细胞的基因组中。

包括目标细胞因子拮抗剂或免疫抑制性细胞因子的编码序列的外源核酸可进一步包括合适的启动子，其可与编码序列可操作连接。如本文所用，启动子是指核酸上的核苷酸序列(位点)，RNA聚合酶可与其结合以启动编码DNA(例如，用于细胞因子拮抗剂)转录为mRNA，然后将其翻译成相应的蛋白质(即基因的表达)。当启动子相对于编码序列处于正确的功能位置和方向以控制(“驱动”)该编码序列的转录起始和表达(以产生相应的蛋白质分子)时，启动子被认为与编码序列“可操作连接”。在一些情况下，本文所述的启动子可以是组成型的，其独立于其他调节因子而启动转录。在一些情况下，本文所述的启动子可以是可诱导的，这取决于转录的调节因子。示例性启动子包含但不限于泛素、RSV、CMV、EF1α和PGK1。在一个实例中，可通过常规方法将可操作地连接至一种或多种合适的启动子的编码如本文所述的那些的一种或多种炎性细胞因子的一种或多种拮抗剂的一种或多种核酸引入免疫细胞，以驱动一种或多种拮抗剂的表达。

此外，本文所述的外源核酸可进一步含有例如以下的部分或全部：可选择的标记基因，诸如用于选择哺乳动物细胞中稳定或瞬时转染子的新霉素基因；来自人类CMV立即早期基因的用于高水平转录的增强子/启动子序列；来自SV40的用于mRNA稳定性的转录终止和RNA处理信号；用于正确游离复制的SV40多瘤病毒复制起点和ColE1；多功能多克隆位点；和用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子。用于生产含有转基因的载体的合适方法是本领域众所周知和可获得的。Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning,A Laboratory Manual)》，第三版，冷泉港实验室出版社。

在一些情况下，如本文所述的多种细胞因子拮抗剂可以以多顺反子方式在一个表达盒中构建，使得多种细胞因子拮抗剂作为单独的多肽。在一些实例中，内部核糖体进入位点可以插入两个编码序列之间以实现这一目标。可替代地，可在两个编码序列之间插入编码自切割肽(例如，T2A或P2A)的核苷酸序列。此类多顺反子表达盒的示例性设计在以下实例中提供。

(B)敲除修饰

本领域已知的用于下调宿主细胞中内源基因表达的任何方法可用于降低如本文所述的目标内源细胞因子/蛋白质的产生水平。基因编辑方法可以涉及使用能够切割内源等位基因中的靶区域的核酸内切酶。不存在模板核酸时的非同源末端连接可修复基因组中的双链断裂并将突变(例如插入、缺失和/或移码)引入靶位点。基因编辑方法通常根据参与在目标核酸中产生双链断裂的核酸内切酶类型进行分类。实例包含但不限于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)/核酸内切酶系统、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、核酸内切酶(例如ARC归巢核酸内切酶)、大范围核酸酶(例如，mega-TAL)或其组合。

本领域已经描述了使用大范围核酸酶的各种基因编辑系统，包含修饰的大范围核酸酶；参见例如Steentoft等人，《糖生物学(Glycobiology)》24(8):663-80,2014的综述；Belfort和Bonocora,《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》1123:1-26(2014)；Hafez和Hausner，《基因组(Genome)》55(8):553-69,(2012)；和本文引用的参考文献所综述。在一些实例中，敲除事件可以与敲入事件结合—编码所需分子的外源核酸诸如本文所述的那些可以通过基因编辑插入到目标靶内源性基因的基因座中。

在一些情况下，可以使用CRISPR技术敲除内源基因。示例性靶内源基因包含IL-2、GM-CSF、TNFA T-细胞受体、β2M等。用于敲除靶内源基因IL-2、GM-CSF和TNFA的示例性gRNA在以下实例中提供。

可替代地，可以通过本领域已知的方法使用反义寡核苷酸(例如，干扰RNA，诸如shRNA或siRNA)或核酶来实现任何敲除修饰。对靶细胞因子/蛋白质具有特异性的反义寡核苷酸是指与细胞因子的内源基因的靶区域或编码它们的mRNA互补或部分互补的寡核苷酸。此类反义寡核苷酸可以通过常规方法递送到靶细胞中。可替代地，可以使用表达载体诸如慢病毒载体或其等同物来表达此类反义寡核苷酸。

(C)包括修饰免疫细胞的免疫细胞群的制备

可以通过将一种或多种敲入修饰、一种或多种敲除修饰或其组合引入宿主免疫细胞群来制备包括本文所述的任何修饰免疫细胞或其组合的免疫细胞群。敲入和敲除修饰可以以任何顺序引入宿主细胞。

在一些情况下，在前一个修饰事件之后和下一个修饰事件之前，在不分离和/或富集修饰细胞的情况下，以顺序方式将一种或多种修饰引入宿主细胞。在那种情况下，所得免疫细胞群可以是异质的，包括带有不同修饰或不同修饰组合的细胞。此类免疫细胞群还可以包括未修饰免疫细胞。免疫细胞群中发生的每个修饰事件的水平可以通过相对于宿主免疫细胞总数的诱导此类修饰的遗传物质的量来控制。还参见上述讨论。

在其他情况下，可以在第一次修饰事件之后在进行第二次修饰事件之前分离和富集修饰免疫细胞。这种方法将导致产生基本上同质的免疫细胞群，其带有所有引入细胞的敲入和/或敲除修饰。

在一些实例中，将敲入修饰和敲除修饰分别引入宿主免疫细胞。例如，敲除修饰通过基因编辑来进行以敲除靶细胞因子的内源基因，并且敲入修饰通过将单独的外源表达盒递送到宿主免疫细胞中来进行以产生一种或多种细胞因子拮抗剂。在一些情况下，敲入和敲除事件可以同时发生，例如，敲入盒可以插入到待敲除的靶基因的基因座中。

III.治疗应用

包括如本文所述的修饰免疫细胞的任何免疫细胞群可用于过继性免疫细胞疗法以治疗靶疾病，诸如白血病或淋巴瘤。由于引入免疫细胞的敲入和敲除修饰，特别是敲入IL-6拮抗性抗体、抗GM-CSF抗体(可能是双特异性抗体的片段，其还含有与IL-6或IL-6R结合的片段)、本文所述的IL-1拮抗剂或其组合，预期其治疗用途将减少与常规过继免疫细胞疗法相关的细胞毒性(减少过继免疫细胞治疗中使用的免疫细胞和受者的内源性免疫细胞二者产生的炎性细胞因子，可被输注的免疫细胞激活)，同时达到相同或更好的治疗效果。

为了实施本文所述的治疗方法，可以通过合适的途径(例如静脉内输注)向需要治疗的受试者施用有效量的包括本文所述的任何修饰免疫细胞的免疫细胞群。免疫细胞群可以在施用前与药学上可接受的载体混合以形成药物组合物，这也在本公开的范围内。免疫细胞可以是受试者自体的，即免疫细胞获自需要治疗的受试者，经修饰以减少一种或多种靶细胞因子/蛋白质的表达，例如本文所述的那些，以表达一种或多种本文所述的细胞因子拮抗剂，以表达CAR构建体和/或外源性TCR，或其组合。然后可以将所得修饰免疫细胞施用于同一受试者。与施用非自体细胞相比，向受试者施用自体细胞可导致免疫细胞的排斥减少。可替代地，免疫细胞可以是同种异体细胞，即细胞获自如本文所述修饰的第一受试者，并施用于与第一受试者不同但属于相同物种的第二受试者。例如，同种异体免疫细胞可源自人类供体并施用于与供体不同的人类受体。

待治疗的受试者可以是哺乳动物(例如，人、小鼠、猪、牛、大鼠、狗、豚鼠、兔、仓鼠、猫、山羊、绵羊或猴)。受试者可能患有癌症、具有传染病或免疫病症。示例性癌症包含但不限于血液恶性肿瘤(例如，B细胞急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤)。示例性传染病包含但不包括人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染、人乳头瘤病毒(HPV)感染、登革热病毒感染、疟疾、败血症和大肠杆菌感染。示例性免疫病症包含但不限于自身免疫疾病，诸如类风湿性关节炎、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、炎性肠病、多发性硬化、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、牛皮癣、格雷夫斯病、桥本氏病甲状腺炎、重症肌无力和血管炎。

在一些实例中，在本文公开的方法中待治疗的受试者可以是人类癌症患者。例如，人类患者可能患有B细胞源癌症。实例包含B系急性成淋巴细胞性白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和B细胞非霍奇金淋巴瘤。可替代地，人类患者可能患有乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤或骨肉瘤。

如本文所用，术语“有效量”是指单独或与一种或多种活性剂组合的赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。如本领域技术人员所知，有效量根据所治疗的特定病况、病况的严重程度、个体患者参数(包含年龄、身体状况、大小、性别和体重)、治疗持续时间、施用途径、赋形剂的使用、与其他活性剂的共同使用(如有)以及健康从业者知识和专业知识范围内的类似因素而变化。施用的量取决于待治疗的受试者，包含例如个体免疫系统产生细胞介导的免疫应答的能力。需要给予的活性成分的精确量取决于从业者的判断。然而，本领域技术人员容易确定合适的剂量范围。

如本文所用，术语“治疗”是指将包含一种或多种活性剂的组合物应用或施用给患有靶疾病、靶疾病的症状或易感靶疾病的受试者，目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病、疾病症状或易感疾病。

在一些情况下，本文公开的基因工程免疫细胞用于治疗癌症。此类免疫细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，其靶向癌抗原，例如CD19或BCMA。除了本文公开的任何IL-6拮抗剂(例如，包括SEQIDNO:13或SEQIDNO:14的scFv)之外，基因工程免疫细胞可进一步表达IL-1拮抗剂，诸如IL-1RA。基因工程免疫细胞可能具有敲除的内源性GM-CSF和/或TCR基因。可替代地，基因工程免疫细胞可携带野生型内源性GM-CSF和/或TCR基因。

可以通过合适的途径，例如静脉内输注，将有效量的基因工程免疫细胞施用于需要治疗的人类患者。在一些情况下，可将约1x10⁶至约1x10⁸个CAR+T细胞给予人类患者(例如白血病患者、淋巴瘤患者或多发性骨髓瘤患者)。在一些实例中，人类患者可以接受多剂量的基因工程免疫细胞。例如，患者可以连续两天接受两个剂量的免疫细胞。在一些情况下，第一剂量与第二剂量相同。在其他情况下，第一剂量低于第二剂量，反之亦然。

在本文公开的任何治疗方法中，包括使用基因工程免疫细胞的方法，可以在细胞疗法的同时向受试者施用IL-2。更具体地，可以在细胞疗法之前、期间或之后通过合适的途径将有效量的IL-2给予受试者。在一些实施例中，在施用免疫细胞之后将IL-2给予受试者。

可替代地或另外，用本文公开的细胞疗法治疗的受试者在免疫细胞输注后可免于涉及IL-6拮抗剂的治疗(除了由细胞疗法中使用的免疫细胞产生的IL-6拮抗剂之外)。

包括如本文所述的修饰免疫细胞的免疫细胞群可与其他类型的癌症疗法诸如化学疗法、手术、放射、基因疗法等组合使用。此类疗法可与本文所述的免疫疗法同时或相继(以任何顺序)施用。当与另外的治疗剂共同施用时，由于加合作用或协同作用，可以降低每种药剂的合适的治疗有效剂量。

在一些实例中，受试者在本文公开的CAR-T疗法之前接受合适的抗癌疗法(例如，本文公开的那些)以降低肿瘤负荷。例如，受试者(例如，人类癌症患者)可以以显著降低肿瘤负荷的剂量接受化学疗法(例如，包括单一化学治疗剂或两种或更多种化学治疗剂的组合)。在一些情况下，化学疗法可将受试者的总白细胞计数降低至低于10⁸/L，例如低于10⁷/L。可以通过常规方法监测初始抗癌疗法后和/或本文公开的CAR-T细胞疗法后患者的肿瘤负荷。如果患者在初始抗癌疗法和/或CAR-T疗法后显示出癌细胞的高生长率，则患者可接受新一轮的化学疗法以降低肿瘤负荷，然后进行任何如本文公开的CAR-T疗法。

可用于与本文所述的修饰免疫细胞组合的其他抗癌治疗剂的非限制性实例包含但不限于免疫检查点抑制剂(例如，PDL1、PD1和CTLA4抑制剂)、抗血管生成剂(例如，TNP-470、血小板因子4、血小板反应蛋白-1、金属蛋白酶组织抑制剂、催乳素、血管抑素、内皮抑素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性KDR和FLT-1受体，以及胎盘增殖蛋白相关蛋白)；VEGF拮抗剂(例如，抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段)；化学治疗化合物。示例性化学治疗化合物包含嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)；嘌呤类似物(例如氟达拉滨)；叶酸拮抗剂(例如巯嘌呤和硫鸟嘌呤)；抗增殖剂或抗有丝分裂剂，例如长春花生物碱；微管破坏剂，诸如紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛)、长春新碱、长春花碱、诺考达唑、埃坡霉素和长春瑞滨以及表鬼臼毒素；DNA损伤剂(例如，放线菌素、安吖啶、蒽环类、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、癌得星、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六亚甲基二胺奥沙利铂、异环磷酰胺、美法仑、merchlorehtamine、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷)。

在一些实施例中，放射或辐射和化学疗法与包括本文所述的修饰免疫细胞的细胞群组合使用。其他有用的药剂和疗法可见于《医师案头参考(Physician's DeskReference)》，59补充版，(2005)，Thomson P D R,Montvale N.J.；Gennaro等人，Eds.Remington的《药学科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy)》20补充版，(2000)，Lippincott Williams和Wilkins,Baltimore Md.；Braunwald等人，Eds.《哈里森内科学(Harrison's Principles of Internal Medicine)》，15补充版，(2001)，McGrawHill,NY；Berkow等人，Eds.《默克诊断和治疗手册(The Merck Manual of Diagnosis andTherapy)》，(1992)，默克研究实验室，新泽西州拉威。

IV.用于治疗用途或制造修饰免疫细胞的试剂盒

本公开还提供了用于涉及本文所述免疫细胞群的本文所述的任何靶疾病的使用的试剂盒和用于制造如本文所述的修饰免疫细胞的试剂盒。

如本文所述的用于治疗用途的试剂盒可包含一个或多个包括免疫细胞群的容器，其可被配制以形成药物组合物。免疫细胞群包括本文所述的任何修饰免疫细胞或其组合。如本文所述的免疫细胞诸如T淋巴细胞、NK细胞和其他细胞的群体可以进一步表达如本文所述的CAR构建体和/或外源TCR。

在一些实施例中，试剂盒可另外包括在本文所述的任何方法中使用免疫细胞群的说明。所包含的说明可以包括向受试者施用免疫细胞群或包括它们的药物组合物以在受试者中实现预期活性的描述。该试剂盒可进一步包括基于识别受试者是否需要治疗来选择适合治疗的受试者的描述。在一些实施例中，说明书包括向需要治疗的受试者施用免疫细胞群或包括它们的药物组合物的描述。

与使用免疫细胞群或包括如本文所述的免疫细胞群的药物组合物有关的说明通常包含关于用于预期治疗的剂量、给药时间表和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的试剂盒中提供的说明通常是标签或包装说明书上的书面说明。标签或包装说明书表明药物组合物用于在受试者中治疗疾病或病症、延迟疾病或病症的发作和/或减轻疾病或病症。

本文提供的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包含但不限于小瓶、瓶、罐、软包装等。还考虑了与特定装置组合使用的包装，诸如吸入器、鼻施用装置或输注装置。试剂盒可具有无菌接入端口(例如，容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器还可具有无菌接入端口。药物组合物中的至少一种活性剂是包括任何修饰免疫细胞或其组合的免疫细胞群(例如，T淋巴细胞或NK细胞)。

试剂盒任选地可以提供附加组件，诸如缓冲剂和解释信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装说明书。在一些实施例中，本公开提供包括上述试剂盒的内容物的制品。

此处还提供了用于制备如本文所述的修饰免疫细胞的试剂盒。此类试剂盒可包含一个或多个容器，每个容器含有用于将敲入和/或敲除修饰引入免疫细胞的试剂。例如，试剂盒可含有基因编辑系统的一种或多种成分，以用于进行如本文所述的那些的一种或多种敲除修饰。可替代地或另外，试剂盒可包括一种或多种用于表达也如本文所述的细胞因子拮抗剂的外源核酸和用于将外源核酸递送到宿主免疫细胞中的试剂。此类试剂盒可进一步包含对宿主免疫细胞进行所需修饰的说明。

V.一般技术

除非另有说明，否则本公开的实践将采用分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中得到了充分的解释，诸如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)冷泉港出版社；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesi)》(M.J.Gait,ed.1984)；《分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)》，Humana出版社；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:ALaboratory Notebook)(J.E.Cellis,ed.,1989)学术出版社；《动物细胞培养(AnimalCell Culture)》(R.I.Freshney,ed.1987)；《引入细胞和组织培养(Introduction to Celland Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum出版社；《细胞和组织培养：实验室程序(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell,eds.1993-8)J.Wiley和Sons；《酶学方法(Methods inEnzymology)(学术出版社公司)；《实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.)：《哺乳动物细胞基因转移载体(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos,eds.,1987)；《分子生物学当前协议(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等人eds.1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)(Mullis等人，eds.1994)；《免疫性当前协议(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人，eds.,1991)；《分子生物学简短协议(Short Protocols in Molecular Biology)(Wiley和Sons,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；抗体(Antibodies)(P.Finch,1997)；《抗体：实践方法(Antibodies:a practice approach)》(D.Catty.,ed.,IRL出版社，1988-1989)；《单克隆抗体：实践方法(Monoclonalantibodies:a practical approach)》(P.Shepherd和C.Dean,eds.,牛津大学出版社，2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:a laboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社，1999)；抗体(The Antibodies)(M.Zanetti和J.D.Capra,eds.哈伍德学术出版社，1995)；《DNA克隆：实践方法(DNA Cloning:A practicalApproach)》，第I和II卷(D.N.Glover ed.1985)；《核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)》(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)；《转录和翻译(Transcriptionand Translation)》(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.1984)；《动物细胞培养(Animal CellCulture)》(R.I.Freshney,ed.1986)；《固定细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)》(lRL出版社，1986)；和B.Perbal，《分子克隆实用指南(A practical Guide To MolecularCloning)》(1984)；F.M.Ausubel等人(eds.)。

本公开在其应用方面不限于在本文的描述中阐述或在附图中示出的构造和部件布置的细节。本公开能够有其他实施例并且能够以各种方式被实践或执行。另外，本文所使用的措词和术语是为了进行说明，不应被看作限制性的。使用“包含(including)”、“包括(comprising)”或者“具有(having)”、“含有(containing)”、“涉及(involving)”以及其在本文中的变型意在包括其后所列项和其等同物以及附加项。也如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包含复数形式，除非上下文另有明确规定。

不再赘述，相信本领域技术人员基于以上描述可以最大限度地利用本发明。因此，以下特定实施例应被解释为仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物均通过引用并入。

实施例1：在293T细胞中表达的IL-6拮抗性抗体在抑制IL-6信号传导中的作用

用Lipofectamine 2000(Thermo Scientific)的第三代自灭活(SIN)慢病毒转移载体转染HEK293T细胞，该载体编码源自本文公开的参考抗体1、2、3和4的单链可变片段(scFv)抗体，其靶向IL-6或IL-6R。CD8前导序列位于抗IL6 scFv之前。参见以下实施例7中的描述。scFv抗体与人IgG1的Fc片段融合。将含有由转染的HEK293T细胞表达的scFv抗体的转染细胞的上清液收集、稀释，并在存在2ng/ml人IL-6的情况下加入HEK-Blue IL-6报告细胞(Invivogen)。使用HEK-Blue IL-6报告细胞是因为它们能够在人IL-6刺激下产生分泌性胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。过夜孵育后，收集HEK-Blue IL-6细胞的上清液并用Quant-Blue底物溶液孵育。通过分光光度计在650nm波长处测量转化底物Quant Blue(Invivogen)的吸光度来量化SEAP产生。

如图1所示，所有scFv抗体都能够通过与报告细胞上表达的IL-6或IL-6R结合来抑制IL-6信号传导。在测试的4种scFv抗体中，与源自参考抗体3和4的scFv抗体相比，源自抗体1和2的scFv抗体在抑制IL-6信号传导方面表现出更高的效率。例如，源自参考抗体1和2的scFv抗体在稀释度0.5下显示出对IL-6信号传导的抑制接近100％，而源自参考抗体3和4的那些在相同稀释度下显示出抑制效率低于60％。该结果表明抗体1和抗体2在阻断IL-6-IL6R信号传导方面更有效。

实施例2：在293T细胞中表达的抗IL-6抗体和IL-1RA在阻断IL-6和IL-1信号传导方面的组合作用

将编码构建体1、构建体2和构建体3的核酸克隆到第3代自灭活(SIN)慢病毒转移载体中。构建体1从N端到C端包含T2A接头，源自参考抗体2的scFv抗体(靶向IL-6)、P2A接头和IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)(T2A-Sir-P2A-IL1RA)。构建体2从N端到C端含有T2A接头、scFv抗体、(G₄S)₃接头和IL1RA(T2A-Sir-(G4S)₃-IL1RA)。构建体3从N端到C端含有scFv抗体、(G₄S)₃接头、IL1RA和T2A接头(Sir-(G₄S)₃-IL1RA-T2A)。在构建体1、2和3中，CD8前导序列位于抗IL6 scFv之前。参见下面实施例7中的描述。在构建体1中，ahGH前导序列位于P2A和IL1RA之间。

通过Lipofectamine2000(Thermo Scientific)用上述慢病毒转移载体转染293T细胞。收集来自转染细胞的上清液，并在10pg/ml IL-1B存在下以指示的不同稀释度加入HEK-BlueIL-1R细胞(Invivogen)中。过夜孵育后，收集HEK-Blue IL-1R细胞上清液，用Quant-Blue底物溶液(Invivogen)孵育，并通过分光光度计在650nm波长处测量转化底物的吸光度。

在2ng/ml IL-6存在下，还将上清液以指示的不同稀释度加入到HEK-Blue IL-6细胞(Invivogen)中。过夜孵育后，收集HEK-Blue IL-6细胞上清液，并用Quant-Blue底物溶液(Invivogen)孵育，并通过分光光度计在650nm波长处测量转化底物的吸光度。

如图2A和图2B所示，本文所述的双结构成功阻断了IL-1和IL-6信号传导。

实施例3：293T细胞中表达的IL-6和GM-CSF拮抗性抗体在阻断IL-6和GM-CSF信号传导方面的组合作用

通过常规重组技术产生用于表达对IL-6和GM-CSF以及上述实施例2中描述的IL1RA具有特异性的三种示例性双特异性抗体的构建体。每种双特异性抗体都含有源自参考抗体2(靶向IL-6)的scFv和源自参考抗体7、参考抗体8或参考抗体9(均靶向GM-CSF)的scFv。双特异性抗体中的两个scFv片段通过GSGGSG接头连接。每个双特异性抗体都通过P2A接头连接到IL1RA。这些构建体被命名为Ab2/Ab9-P2A-IL1RA、Ab2/Ab7-P2A-IL1RA和Ab2/Ab8-P2A-IL1RA(分别对应于图3A至图3C中的1、2和3)。在这些构建体中，CD8前导序列位于抗IL6 scFv之前，并且ahGH前导序列位于P2A和IL1RA之间。参见下面实施例7中的描述。

通过重组技术将编码上述构建体的核酸插入到第3代自灭活(SIN)慢病毒转移载体中。所得慢病毒转移载体通过Lipofectamine 2000(Thermo Scientific)转染到293T细胞中。收集来自转染细胞的上清液。

在2ng/ml GM-CSF存在下，将上清液以指示的不同稀释度加入到TF-1细胞中，共培养2天，因为TF-1细胞完全依赖于GM-CSF进行增殖。然后通过PromegaAqueousOne Solution Cell Proliferation Assay评估TF-1细胞的增殖。

在2ng/ml IL-6存在下，还将上清液以指示的不同稀释度加入到HEK-Blue IL-6细胞(Invivogen)中。过夜孵育后，收集HEK-Blue IL-6细胞上清液，并用Quant-Blue底物溶液(Invivogen)孵育，并且通过分光光度计在650nm波长处测量转化底物的吸光度。

此外，在10pg/ml IL-1B存在下，将上清液以指示的不同稀释度加入到HEK-BlueIL-1R细胞(Invivogen)中。过夜孵育后，收集HEK-Blue IL-1R细胞上清液，并用Quant-Blue底物溶液(Invivogen)孵育，并且通过分光光度计在650nm波长处测量转化底物的吸光度。

本实例中测试的三种构建体均显示出对IL-6信号传导和IL-1信号传导的抑制活性。图3B和3C。另一方面，含有Ab2/Ab9双特异性抗体的构建体显示出针对GM-CSF信号传导的显著阻断活性。图3A。

实施例4：CRISPR技术对GM-CSF的破坏

用抗CD3/28珠(Thermo scientific)激活来自健康供体的原代T细胞(PPAresearch)。四天后，激活的T细胞用Cas9蛋白(Thermo scientific)和如下所示的靶向GM-CSF的第一外显子的不同gRNA电穿孔，而用Cas9蛋白电穿孔的T细胞仅作为阴性对照。

用于靶向人类GM-CSF外显子1的示例性引导RNA模板序列(PAM基序前的间隔序列以粗体显示)：

gRNA1(SEQ ID NO:30):

gRNA2(SEQ ID NO:31):

gRNA3(SEQ ID NO:32):

gRNA4(SEQ ID NO:33):

gRNA5(SEQ ID NO:34):

gRNA6(SEQ ID NO:35):

gRNA7(SEQ ID NO:36):

gRNA8(SEQ ID NO:37):

电穿孔后四天，使用CellTiterAQueous One Solution Cell ProliferationAssay(MTS)(Promega)评估T细胞增殖。结果表明，在外源性IL2的存在下，针对GM-CSF的基因编辑不会显著改变电穿孔后的T细胞增殖。图4A。

还用PMA/Ionomycin激活T细胞，以使用胞内染色试剂盒(Biolegend and BDBioscience)分析细胞因子(GM-CSF、IL-2、IFNγ和TNFα)的表达。结果表明GM-CSF基因编辑显著降低了GM-CSF表达，但对IL2、IFNγ或TNFα表达未显示显著影响。图4B。

实施例5：CRISPR技术对IL-2的破坏

用抗CD3/28珠(Thermo scientific)激活来自健康供体的原代T细胞(PPAresearch)。四天后，激活的T细胞用Cas9蛋白(Thermo scientific)和如下所示的靶向IL2的第一外显子的不同gRNA电穿孔，而用Cas9蛋白电穿孔的T细胞仅作为阴性对照。

用于靶向人IL2外显子1的示例性gRNA模板序列(PAM基序前的间隔序列以粗体显示)：

gRNA1(SEQ ID NO:38):

gRNA2(SEQ ID NO:39):

gRNA3(SEQ ID NO:40):

gRNA4(SEQ ID NO:41):

gRNA5(SEQ ID NO:42):

电穿孔后四天，使用CellTiterAQueous One Solution Cell ProliferationAssay(MTS)(Promega)评估T细胞增殖。结果表明，在外源性IL2的存在下，敲除IL2不会显著改变电穿孔后的T细胞增殖。图5A。

用PMA/Ionomycin激活T细胞，以通过胞内染色试剂盒(Biolegend and BDBioscience)分析细胞因子表达(GM-CSF、IL-2、IFNγ和TNFα)。结果表明IL2基因编辑显著降低了IL2表达，但对GM-CSF、IFNγ或TNFA表达没有显著影响。图5B。

实施例6：CRISPR技术对TNFα的破坏

用抗CD3/28珠(Thermo scientific)激活来自健康供体的原代T细胞(PPAresearch)。三天后，激活的T细胞用Cas9蛋白(Thermo scientific)和如下所示的靶向TNFα的第一外显子的不同gRNA电穿孔，而用Cas9电穿孔的T细胞仅用作阴性对照。

用于靶向人TNFα外显子1的示例性gRNA模板序列(PAM基序前的间隔序列以粗体显示)：

sgRNA 1(SEQ ID NO:43):

sgRNA 2(SEQ ID NO:44):

sgRNA 3(SEQ ID NO:45):

sgRNA 4(SEQ ID NO:46):

sgRNA 5(SEQ ID NO:47):

sgRNA 6(SEQ ID NO:48):

sgRNA 7(SEQ ID NO:49):

sgRNA 8(SEQ ID NO:50):

电穿孔后五天，使用CellTiterAQueous One Solution Cell ProliferationAssay(MTS)(Promega)评估T细胞增殖。结果表明，在外源性IL2的存在下，针对TNFA的基因编辑不会显著改变电穿孔后的T细胞增殖。图6A。

用PMA/Ionomycin激活T细胞，以通过胞内染色试剂盒(Biolegend and BDBioscience)分析细胞因子表达(GM-CSF、IL-2、IFNγ和TNFα)。结果表明TNFA基因编辑显著降低TNFα表达但对GM-CSF、IFNγ或IL2表达没有显示出显著影响。图6B。

实施例7：GM-CSF敲除且分泌IL6阻断剂/IL-1阻断剂的抗CD19 CART细胞发挥有效的细胞毒性和IL6和IL1B抑制作用

用抗CD3/CD28珠(Thermo scientific)激活来自健康供体的原代T细胞(PPAresearch)。一天后，用编码(i)抗CD19 CAR和(ii)抗IL6 scFv多肽(SEQ ID NO:14)，其具有SEQ ID NO:3的V_H序列和SEQ ID NO:4的V_L序列，和(iii)IL1RA的慢病毒载体转导T细胞。

抗CD19 CAR从N端到C端含有CD8前导序列、抗CD19 scFv片段、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ结构域。这些结构域的示例性氨基酸序列提供如下：

CD8前导序列(SEQIDNO:51)：

MALPVTALLLPLALLLHAARP

抗CD19 scFv(SEQ ID NO:52)：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS

CD8铰链结构域(SEQ ID NO:53)：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

CD8跨膜结构域(SEQ ID NO:54)：

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:55)：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

CD3z(SEQ ID NO:56)：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

CD8前导序列位于抗IL6 scFv之前。编码T2A肽的核苷酸序列位于(i)和(ii)的编码序列之间，并且编码P2A肽的核苷酸序列位于(ii)和(iii)的编码序列之间。在P2A和(iii)之间存在人类生长激素信号序列。得到的工程化T细胞表达抗CD19CAR并分泌抗IL6scFv抗体和IL-1RA(抗CD19/IL6/IL1)。两天后，用Cas9蛋白(Thermo scientific)连同靶向GM-CSF的第一外显子的gRNA和任选地靶向TCRβ链恒定区的gRNA对T细胞进行电穿孔。得到的抗CD19 CART细胞是抗CD19/IL6/IL1 TCR^-或抗CD19/IL6/IL1 TCR^-/GM-CSF^-。将这些细胞扩增并通过FACS分析测试CD3表达。

通过主要生物素化山羊抗小鼠IgG-F(ab’)2片段分析抗CD19 CAR的表达，然后使用与R-藻红蛋白偶联的链霉亲和素进行二次染色。81.7％的抗CD19/IL6/IL1 TCR^-细胞为CD45+/CD3-，并且78.9％的抗CD19/IL6/IL1 TCR^-/GM-CSF^-细胞为CD45+/CD3-。然后分析CD45+/CD3-细胞群的CD4和抗CD19 CAR表达。CD45+/CD3-aCD19-61 TCR-细胞中有大约10.7％的抗CD19 CART细胞，并且CD45+/CD3-aCD19-61 TCR-/GM-CSF-细胞中有13.1％的抗CD19 CART细胞。最后，分析CART细胞的CD4/CD8表达。在抗CD19/IL6/IL1 TCR^-细胞中，有大约12.1％的CD8+T细胞和85.3％的CD4+T细胞。在抗CD19/IL6/IL1 TCR^-/GM-CSF^-细胞中，有13.3％的CD8+T细胞和81.2％的CD4+T细胞。

将抗CD19/IL6/IL1 TCR-细胞和抗CD19/IL6/IL1 TCR^-/GM-CSF^-细胞与Nalm6-GFP细胞以1:1E:T比培养2天。从两种共培养物中收集上清液，并在1ng/ml人IL-6或HEK-BlueIL1R报告细胞存在下在5pg/ml人IL1B存在下加入HEK-Blue IL-6报告细胞(Invivogen)中。过夜孵育后，收集HEK-Blue IL-6细胞或HEK-Blue IL1R细胞的上清液，并与Quant-Blue底物溶液一起孵育。通过分光光度计在650nm波长处测量转化底物Quant Blue(Invivogen)的吸光度来量化SEAP产生。如图7A所示，来自抗CD19/IL6/IL1 TCR^-细胞和抗CD19/IL6/IL1TCR^-/GM-CSF^-细胞二者的上清液能够在高于0.1的稀释度下抑制IL6信号传导。如图7B所示，来自抗CD19/IL6/IL1TCR-细胞和抗CD19/IL6/IL1 TCR^-/GM-CSF^-细胞二者的上清液能够在高于0.1稀释度下抑制IL1B信号传导。

然后通过PMA/Ionomycin激活抗CD19/IL6/IL1 TCR^-和抗-CD19/IL6/IL1TCR^-/GM-CSF^-细胞并测试它们的细胞因子表达(IL2、GM-CSF、IFNγ和TNFA)。图7C显示可分泌IL2、IFNγ和TNFα的T细胞百分比在两种细胞群中相似，而与抗CD19/IL6/IL1 TCR^-细胞相比在抗CD19/IL6/IL1 TCR^-/GM-CSF^-细胞群中分泌GM-CSF的T细胞少得多。

评价了抗CD19/IL6/IL1 TCR^-细胞和抗CD19/IL6/IL1 TCR^-/GM-CSF^-细胞杀死CD19+Nalm6细胞的能力。共培养后，通过BD turcount珠分析剩余的肿瘤细胞数，并且在图7D中绘制细胞毒性百分比。抗CD19/IL6/IL1 TCR^-细胞和抗CD19/IL6/IL1TCR^-/GM-CSF^-细胞均对Nalm6细胞显示出高于90％的细胞毒性。

实施例8：GM-CSF敲除且分泌IL6阻断剂/IL-1阻断剂的抗BCMA CAR-T细胞发挥有效的细胞毒性和IL6和IL1B抑制作用

用抗CD3/CD28珠(Thermo scientific)激活来自健康供体的原代T细胞(PPAresearch)。一天后，用编码(i)抗BCMA CAR和(ii)抗IL6 scFv多肽(SEQ ID NO：14)，其具有SEQ ID NO:3的V_H序列和SEQ ID NO:4的V_L序列，和(iii)IL1RA的慢病毒载体转导T细胞。

抗BCMA CAR从N端到C端含有CD8前导序列、抗BCMA scFv片段、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ结构域。CD8前导序列、CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ的序列在上述的实施例7中提供。抗BCMA scFv的氨基酸序列提供如下(SEQ ID NO:57)：

DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS

CD8前导序列位于抗IL6 scFv之前。编码T2A肽的核苷酸序列位于(i)和(ii)的编码序列之间，并且编码P2A肽的核苷酸序列位于(ii)和(iii)的编码序列之间。在P2A和(iii)之间存在人类生长激素信号序列。两天后，用Cas9蛋白(Thermo scientific)和靶向GM-CSF的第一外显子的gRNA对T细胞进行电穿孔。将这些细胞扩增并通过FACS分析测试CD3表达，并对CD3+群体进行门控以进行进一步分析。通过主要生物素化山羊抗小鼠IgG-F(ab’)2片段分析抗BCMA CAR的表达，然后使用与R-藻红蛋白偶联的链霉亲和素进行二次染色。有98.9％的CD3+细胞。然后分析CD3+细胞群的CD4和抗BCMA CAR表达。CD3+细胞群中有大约5.78％的抗BCMA CAR-T细胞。最后，分析CAR-T细胞的CD4/CD8表达。有大约23.8％的CD8+T细胞和73.6％的CD4+T细胞。

将抗BCMA/IL6/IL1 GM-CSF^-细胞与RPMI-8226细胞以1:1E:T比培养2天。从共培养物中收集上清液，并在1ng/ml人IL-6或HEK-Blue IL1R报告细胞的存在下在5pg/ml人IL1B的存在下加入HEK-Blue IL-6报告细胞(Invivogen)中。过夜孵育后，收集HEK-Blue IL-6细胞或HEK-Blue IL1R细胞的上清液，并与Quant-Blue底物溶液一起孵育。通过分光光度计在650nm波长处测量转化底物QuantBlue(Invivogen)的吸光度来量化SEAP产生。如图8A所示，来自两种抗BCMA/IL6/IL1GM-CSF^-细胞的上清液能够在高于0.1的稀释度下抑制IL6信号传导。如图8B所示，来自抗BCMA/IL6/IL1 GM-CSF^-细胞的上清液能够在高于0.1的稀释度下抑制IL1B信号传导。

然后测试有或没有被破坏的GM-CSF的抗BCMA/IL6/IL1细胞的细胞因子表达(IL2、GM-CSF和IFNγ)，图8C显示了可以分泌IL2和IFNγ的T细胞的百分比在两种细胞群中相似，而与GM-CSF WT细胞相比，GM-CSF敲除细胞中分泌GM-CSF的T细胞少得多。

评价了抗BCMA/IL6/IL1/GM-CSF KO细胞杀死BCMA+RMPI-8226细胞的能力。共培养后，剩余的肿瘤细胞数通过BD turcount珠进行分析，并且在图8D中绘制细胞毒性百分比。抗BCMA/IL6/IL1/GM-CSF KO细胞对RPMI-8226细胞显示出高于40％的细胞毒性。

实施例9：抗CD19/IL6/IL1/GM-CSF KO或抗CD19/IL6/IL1 CAR-T细胞在人类癌症患者中的治疗效果

一名诊断为成淋巴细胞性白血病(BCR/ABL1融合基因和具有T315I和E255K突变的ABL1基因)的人类患者接受了以下描述的两轮抗CD19/IL6/IL1/GM-CSF CAR-T细胞治疗。如图9A所示，与野生型对应物相比，CAR-T细胞中GM-CSF的表达显著降低。

第一次治疗

人类患者首先用化学疗法治疗以降低肿瘤负荷，然后进行氟达拉滨/环磷酰胺预治疗以消耗内源性淋巴细胞，从而使患者处于进行CAR-T细胞移植的条件下。化学疗法和预治疗后，总淋巴细胞计数(反映肿瘤负荷)降至0.03X10⁹/L。之后，患者接受1X10⁸个抗CD19/IL6/IL1/GM-CSF KO CAR-T细胞，该细胞如本文所公开的(例如，上述实施例7和8，不同之处在于本实例中使用的CAR-T细胞是TCR阳性的)。与化学疗法前95％的CD19+细胞相比，CAR-T细胞输注后5天，患者外周血中检测到46.8％的CD19+细胞。在CAR-T细胞输注后7天，CD19+细胞总数迅速增加至约12.4X10⁹/L，表明对CAR-T治疗仅有部分响应。

由于高烧，在CAR-T细胞输注后约8小时向患者注射托珠单抗——患者表现出2至3级CRS(发烧、低血压和缺氧)。CRS的迹象发生非常早，即在CAR-T细胞输注后约4小时，这表明CAR-T治疗(第1次)开始时的肿瘤负荷较重。通过ELISA对患者中细胞因子水平进行的分析显示显著降低的GM-CSF水平(图9B)，以及中等水平的IL1/IL1R阻断剂(图9D)。这些结果证实了CAR-T细胞中GM-CSF基因的成功敲除以及CAR-T细胞成功表达了IL1/IL1R阻断剂。患者的最高每日体温(Tmax，℃)如图9H所示。

通过qPCR对CAR载体拷贝进行的量化表明CAR-T细胞在体内的扩增有限。图9E。这可能是患者中CD19+肿瘤细胞快速复发的原因。CAR-T细胞输注后C反应蛋白(CRP)水平升高，并在输注两天后达到峰值。图9F。在输注后第2天还观察到高水平的IFNγ。IL6的水平也降低(图9C)，这可能是由于CAR-T和/或IFNγ活性的降低。

第二次治疗

然后用非常强的化学疗法治疗患者以降低肿瘤负荷，然后进行氟达拉滨/环磷酰胺预治疗以消耗淋巴细胞。化学疗法和预治疗后，总淋巴细胞计数(反映肿瘤负荷)降低到几乎无法通过基于流式细胞术的分析检测到的水平。之后，患者接受了两个连续剂量的0.3X10⁸(在D0)和1X10⁸(在D1)个抗CD19/IL6/IL1 CAR-T细胞(带有野生型GM-CSF基因)。在疗法期间，还给予患者一次或多次IL-2。在CART输注后第7天和第33天，在外周血中检测到B细胞发育不全，表明对CAR-T治疗的完全响应。

细胞因子水平分析显示，T细胞输注后患者中的IL-6显著降低(图10A)，D5-D10期间IL1/IL1R阻断剂、GM-CSF和IFNγ的水平高(分别为图10C，图10D和图10H)。

患者在淋巴耗竭预治疗后和T细胞输注前被诊断为感染。潜在的感染可能是输注后高水平IL6的原因。然而，IL6的水平随时间显著下降，并在IL1/IL1R阻断剂的分泌达到最高峰的同时达到最低点(图10A和图10C)。IL1/IL1R阻断剂与IL6/IL6R阻断剂按比例共表达，两种阻断剂的编码序列通过编码P2A肽接头的核苷酸序列连接。最高每日体温(Tmax，℃)如图10B所示。

通过qPCR对CAR载体拷贝进行的量化和通过流式细胞术对CAR+T细胞进行的分析显示CAR-T细胞在体内的扩增最大，导致在CART治疗后完全根除CD19+肿瘤细胞。图10F和图10H。图10E显示了T细胞输注后的CRP水平。

从D0到D21，患者未接受托珠单抗，并且仅用布洛芬、鼻套管治疗。患者仅表现出1至2级CRS(发烧和缺氧)。在患者中未观察到神经毒性症状。

总之，这些结果表明最大的CAR-T细胞扩增，最大的细胞因子分泌(IFNγ和GM-CSF)水平，但在CRS峰值期间IL6水平极低，并且细胞因子相关毒性症状总体上很小甚至可以忽略不计。CRS分级见下表1。

实施例10：抗BCMA/IL6/IL1/GM-CSF/TCR KO CAR-T细胞在人难治性多发性骨髓瘤患者中的治疗效果

用化学疗法治疗一名难治性多发性骨髓瘤(MM)患者以降低肿瘤负荷，然后进行氟达拉滨/环磷酰胺预治疗以消耗淋巴细胞。之后，患者接受了两个连续剂量的2X10⁶(D0)和3X10⁶(D1)个本文公开的抗BCMA CART细胞，其分泌IL6和IL1阻断剂并敲除GM-CSF和TCR基因。该患者还注射了人重组IL-2。图11A显示了通过CRISPR/Cas9技术敲除GM-CSF基因的效率。TCR的Crispr/Cas9基因编辑导致产生约80％的CD3-T细胞，其中对CD8 T细胞进行门控以通过胞内细胞因子染色分析分泌GM-CSF的细胞。GM-CSF敲除细胞群含有少于20％的GM-CSF阳性细胞。

在CAR-T细胞输注之前，患者的外周血中有大约13.9％的BCMA⁺浆细胞。CAR-T输注后第15天外周血中BCMA⁺浆细胞水平下降至0.074％，表明患者对CAR-T治疗完全响应。此外，IgA的异常水平从治疗前的38.6g/L下降到CAR-T治疗后第41天的1.25g/L，表明恶性浆细胞被根除。图11B。

以例行操作诸如ELISA分析患者中各种细胞因子的血清水平。结果显示高水平的IFNγ分泌和IL1/IL1R阻断剂，但低水平的GM-CSF分泌。图11F、11I和11J。然而，IL6水平在IL1/IL1R阻断剂分泌的峰值时间点极低，其合成通过P2A接头与IL6/IL6R阻断剂成比例地共表达。图11C、图11F和图11K。通过qPCR对CAR载体拷贝进行的量化和通过流式细胞术对CAR+T细胞进行的分析表明CAR-T细胞在体内的扩增最大，导致在CART治疗后完全根除BCMA⁺肿瘤细胞。图11G。CAR-T输注后外周血中CAR-T细胞的数量如图11H所示。

从第0天到第15天，患者未接受托珠单抗，并且仅用布洛芬、鼻套管治疗。患者仅表现出1至2级CRS(发烧和轻度缺氧)，如表1所示。未观察到神经毒性。

表1.用抗BCMA CAR-T细胞治疗的患者的CRS

总之，这些结果表明，在患有难治性多发性骨髓瘤的患者中的抗BCMA CAR-T细胞最大扩增，最大的细胞因子分泌(IFNγ)水平，但在CRS峰值期间(从D9到D11)IL6水平极低，细胞因子释放综合征的症状总体上很小甚至可以忽略不计，并且没有神经毒性。有趣的是，当IL6/IL6R阻断剂的浓度在峰值D11后逐渐降低时，IL6水平在D13时短暂升高到非常高的水平，这并没有引起任何发烧或其他毒性。

实施例11：具有或不具有GM-CSF敲除的抗CD19/IL6/IL1TCR敲除CAR-T细胞在异种移植小鼠中的治疗效果

给6至8周龄NSG小鼠静脉内注射1X10⁶个经修饰以稳定表达GFP的Nalm6白血病细胞。6天后，给小鼠静脉内注射2X10⁶个TCR KO抗CD19 CAR-T细胞，该细胞也表达IL6/IL6R阻断剂和具有GM-CSF WT(图中表示为“1”，n＝5)或KO(图中表示为“2”，n＝6)的IL1/IL1R阻断剂。包含未接受CAR-T细胞的小鼠作为对照(图中表示为“CTRL”，n＝4)。T细胞输注后，通过Trucount珠(BD Biosciences)监测小鼠的体重、存活以及血液中GFP+Nalm6白血病细胞和CD45+CD3-T细胞的数量。

在CAR-T细胞治疗之前和之后监测治疗小鼠的体重。用有或没有GM-CSF KO的抗CD19 CAR-T细胞治疗的小鼠都表现出体重随时间增加，而对照小鼠的体重则显著下降。图12A。与对照小鼠相比，有或没有GM-CSF KO的抗CD19 CAR-T细胞都显著延长治疗小鼠的存活率并降低白血病细胞的水平。图12B和12C。最后，用CAR-T细胞治疗的小鼠中T细胞的数量随时间减少。图12D。

总体而言，CAR-T细胞有效地根除了小鼠的白血病细胞，维持了长期存活。此外，治疗小鼠中的细胞因子KO T细胞逐渐减少并且没有转化为肿瘤样细胞，表明本文公开的CAR-T细胞的安全性。

实施例12：抗CD19/IL6/IL1/GM-CSF/TCR KO CAR-T细胞在人非霍奇金淋巴瘤患者中的治疗效果

诊断为非霍奇金淋巴瘤的人类患者接受用本文如下公开的抗-CD19/IL6/IL1/TCR/GM-CSF KO CAR-T细胞进行的治疗。用化学疗法治疗人类患者以降低肿瘤负荷，然后进行氟达拉滨/环磷酰胺预治疗以消耗内源性淋巴细胞，从而使患者处于进行CAR-T细胞移植的条件下。之后，患者接受了0.2X10⁸(在第0天，D0)和0.3X10⁸(在第1天，D1)个本文公开的抗CD19/IL6/IL1 CAR-T细胞(已敲除GM-CSF和TCR基因)。如图13A所示，大部分T细胞已敲除GM-CSF。结果显示了GM-CSF KO的Crispr/Cas9基因编辑效率(图13A)。在疗法期间给患者注射重组IL2。在CART输注后第7天，通过流式细胞术分析检测到B细胞发育不全，表明对CAR-T疗法的完全响应。

细胞因子水平分析显示，T细胞输注后患者中IL-6水平低(图13B和图13D)，并且IL1/IL1R阻断剂、GM-CSF和IFNG略有增加(分别为图13E、图13F和图13C)。通过qPCR对CAR载体拷贝进行的量化显示CAR-T细胞在体内显著扩增(图13G)，这导致在CAR-T治疗后完全根除CD19⁺肿瘤细胞。图13I显示了T细胞输注后的CRP水平。从第0天到第9天，患者未接受托珠单抗，并且未显示发烧、缺氧或低血压症状。此外，在治疗期间未检测到神经毒性。

实施例13：抗CD19/IL6/IL1 CAR-T细胞在人类急性成淋巴细胞性白血病患者中的治疗效果

诊断为急性成淋巴细胞性白血病的人类患者接受用本文如下公开的抗CD19/IL6/IL1 CAR-T细胞进行的治疗。用化学疗法治疗人类患者以降低肿瘤负荷，然后进行氟达拉滨/环磷酰胺预治疗以消耗内源性淋巴细胞，从而使患者处于进行CAR-T细胞移植的条件下。之后，患者接受了本文公开的0.35x10⁸个抗CD19/IL6/IL1CAR-T细胞(具有野生型GM-CSF和TCR基因)。在疗法期间给患者注射重组IL2。在CAR-T细胞输注后第14天，患者被诊断为最小残留疾病阴性(MRD-)，表明对CAR-T疗法的完全响应。

细胞因子水平分析显示，T细胞输注后患者中IL-6水平低(图14A和图14C)，IL1/IL1R阻断剂、GM-CSF和IFNG水平高(分别为图14D、图14E和图14B)。通过qPCR对CAR载体拷贝进行的量化显示CAR-T细胞在体内的扩增最大(图14G)，导致在CAR-T治疗后完全根除CD19⁺肿瘤细胞。图14H显示了T细胞输注后的CRP水平。从第0天到第15天，患者未接受托珠单抗，并且仅显示1级CRS(发烧)(图14F)，无缺氧或低血压症状。此外，在治疗期间未检测到神经毒性。

总之，这些结果表明CAR-T细胞最大扩增，最大的细胞因子分泌(IFNG)水平，但在CRS峰值期间IL6水平极低，并且细胞因子相关毒性症状总体上很小甚至可以忽略不计，并且没有神经毒性。

实施例14：抗BCMA/IL6/IL1 CAR-T细胞在人多发性骨髓瘤患者中的治疗效果

用化学疗法治疗多发性骨髓瘤(MM)患者以降低肿瘤负荷，然后进行氟达拉滨/环磷酰胺预治疗以消耗淋巴细胞。然后，患者接受单剂量的4×10⁷(D0)个分泌IL6/IL1阻断剂且具有野生型GM-CSF和TCR基因的抗BCMA CART细胞，而也给患者注射人重组IL2。在整个治疗过程中，患者没有接受托珠单抗。

温度监测(图15A)指示从第1天至第6天发烧，以及CRP、铁蛋白和IFNG水平增加(图15A至图15D)。然而，从第1天至第6天，IL6水平保持在低水平(<100pg/ml，图15E)，以及只有1级CRS(发烧)(没有缺氧和低血压)，并且没有观察到神经毒性。在治疗期间检测到IL1RA的显著增加(图15H)，与CART扩增(图15G)一致。比较IL6水平与IFNG和IL1RA水平(图15F、15H和15I)表明IL6分泌在CAR-T细胞扩增期间最初被抑制。然而，IL6在第9天急剧增加，并从第9天至第23天保持在高水平。仅在第13天至第17天期间观察到轻度神经毒性，在此期间没有观察到发烧、缺氧或低血压。细胞因子的分析显示从第13天至第17天IFNG、IL1B、IL2、IL4、IL10、IL17A、TNFA和GM-CSF的低水平，表明单独的IL6高水平可能导致神经毒性(图15D和图15J至图15P)。

总之，仅在第1天至第6天期间观察到发烧，并且仅在第13天至第17天期间在患者中观察到轻度神经毒性。在CART治疗期间没有观察到缺氧或低血压。上述结果表明，患者从第1天至第6天经历了典型的CRS，其由CAR-T细胞产生的IL6阻断剂有效地减少。之后，IL6在第9天急剧增加，并且从第13天至第17天的高水平IL6的存在可能是由于CAR-T细胞产生的IL6阻断剂的下调，这导致轻度神经毒性，而没有发烧、缺氧或低血压。IL6相关的神经毒性进一步支持了IL6不仅是减少CRS严重程度的重要靶标，而且是减少神经毒性的重要靶标。

其他实施例

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等同或类似目的的替代特征替换。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征是仅是一系列等同或类似特征的实例。

根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以进行本发明的各种改变和修改，以使其适应各种用法和条件。因此，其他实施例也在权利要求中。

等同物

虽然本文已经描述和说明了若干本发明实施例，但是本领域普通技术人员将容易设想用于执行功能和/或获得结果和/或本文所述的一个或多个优点的各种其他方式和/或结构，并且每个此类变型和/或修改被认为在本文所述的本发明实施例的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置都意图是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于特定的应用或使用本发明的教导的应用。本领域技术人员将使用不超过常规实验认识到或能够确定本文所述的特定本发明实施例的许多等同物。因此，应当理解，前述实施例仅作为实例呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，可以以与具体描述和要求保护的方式不同的方式实施本发明实施例。本公开的本发明实施例涉及本文所述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，两个或更多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合，如果此类特征、系统、物品、材料、套件和/或方法不相互矛盾，则包含在本公开的发明范围内。

本文定义和使用的所有定义应理解为控制字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或定义术语的普通含义。

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请通过参照各自被引用的主题并入，其中在某些情况下可以包括整个文件。

在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个”，除非有相反的明确指示，应理解为“至少一个”。

说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为是指如此结合的元素中的“一个或两个”，即在某些情况下结合存在而在其它情况下分离存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应该以相同的方式解释，即如此连接的“一个或多个”元素。除了由“和/或”从句具体识别的元素之外，其他元素可以任选地存在，无论与那些具体识别的元素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与诸如“包括”的开放式语言结合使用时，提及“A和/或B”在一个实施例中可以仅指A(任选地包含除了B之外的元素)；在另一实施例中仅指B(任选地包含除了A之外的元素)；在又一实施例中，指A和B二者(任选地包含其他元素)；等等。

如本文所用，在说明书和权利要求中，“或”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当在列表中分离项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含许多元素或元素列表中的至少一个而且还包含多于一个，并且任选地包含额外未列出的项目。只有清楚地指示相反的术语，诸如“仅一个”或“恰好一个”，或者在权利要求中使用的“由……组成”将是指包含许多元素或元素列表中的恰好一个元素。通常，如本文所用的术语“或”在排他性术语诸如“或者”、“之一”、“仅一个”或“恰好一个”之前时只能被解释为表示专用替代方案(即“一个或另一个，而不是两个”)。“基本上由……组成”在权利要求中使用时应具有其在专利法领域中使用的普通含义。

如本文所使用的说明书和权利要求中，提及一个或多个元素的列表的短语“至少一个”应该被理解为意指选自元素列表中任一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包含在元素列表中专门列出的每一个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中的任何元素组合。该定义还允许元素可以任选地存在，除了元素列表内短语“至少一个”指出的具体识别的元素之外，无论与那些具体识别的元素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或，等同地，“A或B中的至少一个”或等同地“A和/或B中的至少一个)在一个实施例中可以指至少一个(任选地包含多于一个)A，而不存在B(并且任选地包含除了B之外的元素)；在另一实施例中可以指至少一个(任选地包含多于一个)B，而不存在A(并且任选地包含除了A之外的元素)；在又一实施例中，可以指至少一个(任选地包含多于一个)A和至少一个(任选地包含多于一个)B(并且任选地包含其他元素)；等等。

还应该理解，除非明确指示相反，在本文要求保护的包含多于一个步骤或行为的任何方法中，该方法的步骤或行为的顺序不必须限于记载该方法的步骤或行为的顺序。

序列表

<110> CELLEDT LLC

<120> 用于降低毒性的共表达嵌合抗原受体和IL-6拮抗剂的修饰免疫细胞及其在过继细胞疗法中的用途

<130> 103168-643327-70001WO00

<150> 62/789,311

<151> 2019-01-07

<150> 62/855,250

<151> 2019-05-31

<150> 62/928,720

<151> 2019-10-31

<160> 60

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Arg Asp Ser Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Lys Leu Leu Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 6

Gln Ile Val Leu Ile Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

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Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr

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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Gly Ser Asp Glu Thr Ala Tyr Ala Thr Ser Ala Ile

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Asp Ser Ser Asp Trp Asp Ala Lys Phe Asn Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 10

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Glu

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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Leu Arg Asn

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Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

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Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Tyr Tyr Gly Phe Thr Ser Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<220>

<223> 合成多肽

<400> 12

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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Asn Ala Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 13

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1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 14

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Met

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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

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65 70 75 80

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

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<220>

<223> 合成多肽

<400> 15

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

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Gly Gly Lys Leu Leu Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala

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Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly

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<220>

<223> 合成多肽

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180 185 190

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr

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115

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 18

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Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile

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Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His

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Trp Met His Trp Leu Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Pro Val Trp Val

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Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

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<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

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Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Glu Asn Lys Tyr Ala Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Gly Thr Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu

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Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 22

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

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Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

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Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser

50 55 60

Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu Asp Glu

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Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Gly Asp Lys Gly Met Val Phe Gly

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Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105

<210> 23

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

130 135 140

Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser

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Gln Asn Ile Arg Asn Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys

165 170 175

Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val

180 185 190

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

195 200 205

Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Ser Tyr Ser Met Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225 230 235 240

Lys

<210> 24

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His

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Ser Arg Ile Asn Gly Ala Gly Thr Ser Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val

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Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

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Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu

165 170 175

Gly Gln Gly Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

180 185 190

Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Glu Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Asp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Ile Lys

<210> 25

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Gly Ile Glu Asn Lys Tyr Ala Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala

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65 70 75 80

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Ser Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val

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Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly

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Lys Lys Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val

165 170 175

Leu Val Ile Tyr Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln

195 200 205

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Gly Asp Lys Gly

210 215 220

Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

225 230 235

<210> 26

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 26

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly

165 170 175

Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr

210 215 220

Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

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260 265 270

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275 280 285

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Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp

325 330 335

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Thr Leu Ile Ser Val Tyr Phe

340 345 350

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355 360 365

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met

370 375 380

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

385 390 395 400

Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile Leu Asn Trp Tyr

405 410 415

Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser

420 425 430

Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

435 440 445

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

450 455 460

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg Thr Phe Gly Gly

465 470 475 480

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

485

<210> 27

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 27

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

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Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

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Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln

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Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly

165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

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Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

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Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ile

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Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Asn Leu Ala

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485

<210> 28

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 28

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

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50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly

165 170 175

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180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

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210 215 220

Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

260 265 270

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

275 280 285

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Glu Asn Lys Tyr Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

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Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

325 330 335

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Gly Thr Asp Phe

340 345 350

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

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Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln

370 375 380

Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Ser Cys

385 390 395 400

Ser Gly Asp Ser Ile Gly Lys Lys Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys

405 410 415

Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Lys Lys Arg Pro Ser Gly

420 425 430

Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu

435 440 445

Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser

450 455 460

Ala Trp Gly Asp Lys Gly Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

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Val Leu Gly Gln

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 29

Met Ala Leu Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys

1 5 10 15

Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu

20 25 30

Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn

35 40 45

Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe

50 55 60

Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly

65 70 75 80

Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser

85 90 95

Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser

100 105 110

Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu

115 120 125

Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro

130 135 140

Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu

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<210> 30

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 30

gctgcagagc ctgctgctct gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

<210> 31

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 31

ggagcatgtg aatgccatcc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 32

gcatgtgaat gccatccagg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 33

gagacgccgg gcctcctgga gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 34

gatggcattc acatgctccc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 35

gctcccaggg ctgcgtgctg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 36

gcgtgctggg gctgggcgag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 37

gctggggctg ggcgagcggg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成寡核苷酸

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gacttagtgc aatgcaagac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 39

gatttacaga tgattttgaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成寡核苷酸

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aagaaaacac agctacaacg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 60

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgctttt 99

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成寡核苷酸

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caactggagc atttactgcg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 60

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgctttt 99

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<212> DNA

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<220>

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<400> 42

tctttgtaga acttgaagtg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 60

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgctttt 99

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<220>

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gagcactgaa agcatgatcc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<220>

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ggacgtggag ctggccgagg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 45

gaggcgctcc ccaagaagac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<220>

<223> 合成寡核苷酸

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gggggcccca gggctccagg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

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<220>

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<400> 47

gctgaggaac aagcaccgcc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成寡核苷酸

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ggcgcctgcc acgatcagga gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 49

gtgcagcagg cagaagagcg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 50

ggagtgatcg gcccccagag ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 60

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgctttt 99

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<220>

<223> 合成多肽

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Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 52

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1 5 10 15

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

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Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

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Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 53

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Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

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Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 54

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Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 55

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 56

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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

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<220>

<223> 合成多肽

<400> 57

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Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

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65 70 75 80

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85 90 95

Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

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Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly

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Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp

180 185 190

Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala

195 200 205

Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

210 215 220

Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Ser Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 58

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 58

Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp

1 5 10 15

Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala

20 25 30

Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val

35 40 45

Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys

50 55 60

Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu

65 70 75 80

Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys

85 90 95

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 59

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 60

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu

1 5 10 15

Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Arg Pro Ser Gly Arg Lys

20 25 30

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50 55 60

Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His

65 70 75 80

Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val

85 90 95

Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr

100 105 110

Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg

115 120 125

Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly

130 135 140

Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr

145 150 155 160

Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu

165 170 175

Asp Glu