具体实施方式

本发明涉及提供用于预防和治疗癌症的新的治疗组合。

除非另外限定，本文所使用的所有技术术语都具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

针对本发明的一个方面公开的所有实施方案均适用于其他方面。

本发明的组合和药物组合物

在此以及在本发明的每个其他方面提供的定义同样适用于整个发明。

本发明的作者已经证明，将Omomyc经鼻内和全身给药可以将T细胞募集到肿瘤部位(图1和2)。因此，Omomyc与肿瘤免疫剂的组合可以用于治疗癌症。此外，已经发现Omomyc和肿瘤免疫剂的组合在治疗癌症中具有协同作用。例如，与载体和仅抗PD-1处理组相比，Omomyc和抗PD-1疗法的组合显著增加了表达PD-1但不表达Tim-3的CD4⁺ T细胞向肿瘤部位的募集(图3)。此外，Omomyc和抗PD-1疗法的组合与它们的载体对照相比，显著诱导了通过CD4⁺辅助细胞和CD8+细胞毒性肿瘤内T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)(图4)，这一事实在Omomyc或抗PD-1处理组中都没有观察到。当患有肺癌的受试者接受治疗时，T细胞向肿瘤部位的募集转化为健康肺部的比例的协同增加(图5)。无论给药途径、剂量和方案如何，这种协同效应都得以保持(图7和图8)。还发现Omomyc和抗CTLA-4疗法的组合协同降低肿瘤生长并将抗肿瘤T细胞募集到肿瘤部位(图6)。

因此，在第一方面，本发明涉及一种组合，其包括：

i)第一组分，选自由以下组成的组：

a)包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体，

b)缀合物，包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体；以及和促进细胞摄取所述多肽或所述其功能等效变体的化学部分，以及

c)多核苷酸，编码a)的所述多肽或b)的所述缀合物，

d)载体，包含根据c)的所述多核苷酸，以及

e)细胞，能够将根据a)的所述多肽或根据b)的所述缀合物分泌至培养基中；

以及

ii)第二组分，其是肿瘤免疫剂。

根据本发明，表述“组合”代表化合物(i)和(ii)的各种组合，例如配制为单一制剂的组合物，由每种组分的分开的制剂构成的组合混合物(例如，可以组合作为组合制剂联合使用的“桶混剂(tank-mix)”)，以及以依序方式给药(即在相当短的时间(例如几个小时或几天)内一个接一个地)或以同时给药的方式的单个活性成分的组合使用。在本发明中，化合物(i)指治疗有效量的包含序列SEQ ID NO:1的多肽或其功能等效变体；或指包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体、以及促进细胞摄取所述多肽或所述其功能等效变体的化学部分的缀合物；或指编码所述多肽或所述缀合物的多核苷酸；或指包含该多核苷酸的载体；或指能够将所述多肽或所述缀合物分泌至培养基中的细胞。在本发明中，化合物(ii)是指治疗有效量的肿瘤免疫剂。优选地，应用化合物(i)和(ii)的顺序对于实施本发明不是必需的。

所述组合可以是组成套组(kit-of-parts)，其中每种组分均单独配制和包装。

可以配制化合物(i)和(ii)的组合用于其同时、分开或依序给药。特别地，如果给药不是同时的，则在彼此接近的时间内给药化合物。此外，化合物以相同或不同的剂型给药或通过相同或不同的给药途径给药，例如，一种化合物可以经口服给药，而另一种化合物可以经静脉给药。优选地，化合物(i)经鼻内给药，并且化合物(ii)经全身给药，更优选地经肠胃外给药，甚至更优选地经腹膜内给药。在另一个实施方案中，化合物(i)经静脉给药，并且化合物(ii)经肠胃外给药，甚至更优选经腹膜内给药。

可以将两种化合物(i)和(ii)的组合以如下方式给药：

-作为一个组合，其是同一药物制剂的组成部分，两种化合物则总是被同时给药；

-作为两个单位的组合，每个单位具有引起同时、依序或分开给药的可能性的物质之一。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合的化合物(i)可以独立于化合物(ii)给药，但在相同的时间，即以两个单位给药。

在另一个具体的实施方案中，首先本发明的组合的化合物(i)被给药，然后化合物(ii)被给药，即化合物(ii)被分开或依序给药。

在又一个具体的实施方案中，首先本发明的组合的化合物(ii)首先被给药，然后化合物(i)被给药，即如定义的那样分开或依序给药化合物(i)。如果分开给药，则本发明的组合的化合物(i)和(ii)可以彼此间隔一段时间给药，例如彼此间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时内。在另一个实施方案中，本发明的组合的化合物(i)和(ii)可以彼此间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24天内给药，优选彼此间隔1天内给药，更优选彼此间隔10天内给药。在一个优选的实施方案中，在第一次给药化合物(i)的10天后给药化合物(ii)。在一个实施方案中，在开始给药第二化合物之前停止给药第一化合物。

在另一方面，本发明涉及一种组合或药物组合物，其包含协同有效量的根据本发明的第一方面的第一组分和肿瘤免疫剂。

在一个优选的实施方案中，本发明的化合物(i)是包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体。

术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。本发明的多肽可以包含经修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。在一个优选的实施方案中，所述多肽仅由氨基酸形成。优选地，形成所述组合的项(i)的多肽的长度为80至500个氨基酸、更优选为80至300个氨基酸、更优选为80至250个氨基酸、更优选为80至150个氨基酸、甚至更优选为80至130个氨基酸、优选为90至130个氨基酸、优选不超过125个氨基酸、更优选不超过100个氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述多肽的长度为90至98个氨基酸、优选为90至95个氨基酸、更优选为91个氨基酸。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。此外，术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸(立体异构体)。优选地，氨基酸是L-氨基酸。

术语“天然氨基酸”或“天然存在的氨基酸”包括20个天然存在的氨基酸；通常在体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。

如本文所用，术语“非天然氨基酸”或“合成氨基酸”是指在位置“a”被胺基取代并且在结构上与天然氨基酸相关的羧酸或其衍生物。修饰的或不常见的氨基酸的示例性非限制性实例包括：2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、锁链素(desmosine)、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸(alio hydroxy lysine)、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸等。

本发明的多肽还可以包含非氨基酸部分，例如与肽连接的疏水性部分(各种直链、带支链的、环状、多环或杂环的烃和烃衍生物)；连接至化合物末端以减少降解的各种保护性基团。合适的保护性官能团在Green和Wuts的“Protecting Groups in OrganicSynthesis”，John Wiley and Sons，1991，第5章和第7章中有描述。

可以包括多肽中存在的化学(非氨基酸)基团，以改善各种生理学特性，例如降低降解或清除，减少各种细胞泵的排斥，改善各种给药方式，增加特异性，提高亲和力，增加稳定性、生物利用度、溶解度，降低毒性等。

“仿真物”包括仿真肽结构的化学结构并保留肽结构的功能特性的分子。设计肽类似物、衍生物和模拟物的方法是本领域已知的。

在一个实施方案中，本发明的多肽是由序列SEQ ID NO：1组成的多肽或由SEQ IDNO：1的功能等效变体组成的多肽，优选地是由序列SEQ ID NO：1组成的多肽。SEQ ID NO:1对应于：TEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCA(SEQ ID NO:1)。

序列SEQ ID NO：1的多肽对应于Omomyc蛋白序列。如本文所用，术语“Omomyc”是指由带有E61T、E68I、R74Q和R75N突变的Myc的bHLHZip结构域的突变形式组成的多肽(其中，突变位置的编号相对于与NCBI数据库中的登记号NP_002458所定义的多肽(2015年3月15日发布)的氨基酸365-454相对应的Myc区的序列)。下面显示了NCBI数据库中以登记号NP_002458提供的c-Myc序列(SEQ ID NO：2)，其中Omomyc衍生的区域以下划线示出：

Omomyc还包含c-Myc的M2结构域，所述M2结构域具有序列RQRRNELKRSF(SEQ IDNO：3)(参见Dang and Lee,Mol.Cell.Biol.,1988,8:4048-4054)(以上双下划线部分)，并对应于核定位信号。

Omomyc的特征在于，它对所有三种致瘤的Myc蛋白(c-Myc、N-Myc和L-Myc)显示出增强的二聚化能力。Omomyc可以衍生自本领域已知的任何Myc蛋白的bHLHZip结构域，条件是保留导致肿瘤抑制子作用的突变。因此，可以用于本发明的Omomyc可以衍生自任何哺乳动物，包括但不限于家畜和农场动物(牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物)、灵长类动物和人类。优选地，Omomyc蛋白衍生自人Myc蛋白(登记号NP_002458，2019年3月12日发布)。

如本文所用，术语“Myc”是指转录因子家族，其包括c-Myc、N-Myc和L-Myc。Myc蛋白通过结合共有序列CACGTG(增强子盒序列或E-盒和募集组蛋白乙酰转移酶或HAT)来启动许多基因的表达。但是，Myc也可以充当转录阻遏物。通过结合Miz-1转录因子并置换p300辅助活化剂，它可以抑制Miz-1靶基因的表达。Myc还在控制DNA复制中起直接作用。

Myc b-HLH-LZ或Myc基本区域螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构域是指确定Myc与Max蛋白二聚化和与Myc靶基因结合的区域。该区域对应于人Myc的第365-454位氨基酸，其特征是通过环连接的两个α螺旋(Nair，S.K.，&Burley，S.K.，2003，Cell，112：193-205)。

在优选的实施方案中，本发明的多肽是包含如下所示的SEQ ID NO:4、由如下所示的SEQ ID NO:4组成、或基本上由如下所示的SEQ ID NO:4组成的多肽：

MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCA(SEQ ID NO:4)

在本文中，“基本上由……组成”是指指定分子将不包含任何将改变SEQ ID NO：4活性的其他序列。

优选地，多肽由SEQ ID NO：4组成。

术语“功能等效变体”是指相对于SEQ ID NO：1的多肽由一个或多个氨基酸的插入或添加和/或由一个或多个氨基酸的缺失和/或由一个或多个氨基酸的保守置换而得到的任何多肽，和/或指由对SEQ ID NO：1的多肽的化学修饰得到的并且其基本上保留了SEQ IDNO：1的肿瘤抑制活性的任何多肽。优选地，功能等效变体是指相对于SEQ ID NO：1的多肽由一个或多个氨基酸的插入或添加和/或由一个或多个氨基酸的缺失和/或由一个或多个氨基酸的保守置换而产生的并且基本上保留了SEQ ID NO：1的肿瘤抑制活性的任何多肽；更优选地是相对于SEQ ID NO：1的多肽由一个或多个氨基酸的插入或添加而产生的任何多肽。

技术人员将理解，肿瘤抑制活性的保留要求变体可以与Myc和/或其专属配偶体p21/p22Max二聚并抑制Myc活性，其能够跨细胞膜易位并且能够易位穿过核被膜。在一些实施方案中，与Omomyc相比，本发明的多肽的功能等效变体较少同源二聚化，或不通过形成二硫桥而被迫形成同源二聚体。特别地，本发明多肽的某些实施方案的同源二聚体形式中的二硫桥形成少于多肽OmoMyc中。

如本文所用，“较少的同源二聚化”涉及甚至在还原条件下形成本发明的多肽的专属同源二聚体的能力较低。在一个优选的实施方案中，该能力比形成Omomyc的同源二聚体的能力低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％。

如本文所用，还原条件涉及还原剂的存在，还原剂是在氧化还原化学反应中向另一化学物质提供电子的化合物。还原剂的示例性但非限制性实例是DTT(二硫苏糖醇)、β-巯基乙醇、或TCEP(三(2-羧乙基)膦)。同源二聚体的量在体外可能是相同的，并且功能等效变体与Omomyc之间的差异仅存在于异质二聚体配偶体存在的细胞中，其中不存在二硫化物使得有可能更多地形成异质二聚体。

几种测定法可以用于确定肽的同源二聚化，例如但非限制性的，通过圆二色性监测的热变性，因此通过折迭和热稳定性可以定量检测二聚化。

合适的功能等效变体包括基本上由SEQ ID NO：1的多肽组成的多肽。在本文中，“基本上由……组成”是指指定分子不包含任何将改变SEQ ID NO：1的活性的其他序列。

在一个优选的实施方案中，SEQ ID NO：1的功能等效变体是相对于SEQ ID NO：1的多肽由插入或添加一个或多个氨基酸而得到的多肽。在一个实施方案中，功能等效变体是由于插入少于10个氨基酸、更优选插入少于5个氨基酸、更优选由于插入一个氨基酸而得到的。在一个优选的实施方案中，由于插入一个氨基酸即甲硫氨酸而得到。

在另一个实施方案中，SEQ ID NO：1的功能等效变体是相对于SEQ ID NO：1的多肽由一个或多个氨基酸的缺失而得到的多肽。在一个实施方案中，功能等效变体是由于缺失少于10个氨基酸、更优选缺失少于5个氨基酸、更优选由于缺失一个氨基酸而得到的。

靶向肽的合适的功能变体是显示出相对于SEQ ID NO：1的肽具有约大于25％的氨基酸序列同一性例如25％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性程度的那些功能变体。使用本领域技术人员众所周知的计算机算法和方法确定两个多肽之间的同一性程度。优选地，通过使用如前所述的BLASTP算法来确定两个氨基酸序列之间的同一性(BLAST Manual,Altschul,S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.等人，J.Mol.Biol.1990；215:403-410)。在一个优选的实施方案中，在SEQ ID NO：1的多肽的整个长度上、或在变体的整个长度上、或两者上确定序列同一性。

本发明多肽的功能等效变体还可以包括翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、异戊二烯化、豆蔻酰化、蛋白质水解加工等。

在另一个实施方案中，靶向肽的合适的功能变体是其中本发明的多肽中的一个或多个位置包含以下氨基酸的那些功能变体，所述氨基酸是上述蛋白质中存在的氨基酸的保守置换。“氨基酸的保守置换”是将一个氨基酸替换为具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸。例如，以下六个组均包含彼此为保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。这样的氨基酸的保守置换的选择在本领域普通技术人员的能力范围内，并且例如由Dordo等人(J.Mol.Biol，1999，217；721-739)和Taylor等人(J.Theor.Biol.,1986,119:205-218)描述。

应当理解，Omomyc的功能等效变体在与源自人c-Myc的Omomyc中存在的突变E61T、E68I、R74Q和R75N相对应的位置处包含突变。在功能等效变体中必须发生的突变位置可以通过不同Myc序列的多序列比对来确定，并且可以通过与衍生自人c-Myc的Omomyc序列中位置61、68、74和75对应的那些位置的比对来确定。在一个实施方案中，Omomyc的功能等效变体在对应于在源自人c-Myc的Omomyc中存在的突变E61T、E68I、R74Q和R75N的位置处含有突变。

在另一个实施方案中，Omomyc的功能等效变体在对应于Omomyc序列中的E61、E68、R74和R75的位置处包含突变，其中E61已被突变为E61A或E61S；E68已被突变为E68L、E68M或E68V；R74已被突变为R74N；并且R75已被突变为R75Q。

多序列比对是成对比对的扩展以一次合并多于两个序列。多比对方法比对给定查询集中的所有序列。优选的多序列比对程序(及其算法)是ClustalW、Clusal2W或ClustalWXXL(参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res 22：4673-4680)。一旦如本文所述比较了来自不同生物体的c-Myc和变体的序列(比对)，本领域技术人员可以容易地确定每个序列内对应于在Omomyc中存在的位置E61T、E68I、R74Q和R75N的位置，并在Omomyc变体突变中对应于衍生自人c-Myc的Omomyc中出现的E61T、E68I、R74Q和R75N突变引入。

用于确定多肽是否可以被视为Omomyc的功能等效变体的合适测定法包括但不限于：

-测量多肽与Max和Myc形成二聚体复合物的能力的测定法，例如基于Soucek等人(Oncogene，1998，17：2463-2472)描述的报告基因的表达以及PLA(蛋白质连接测定法)或免疫共沉淀的测定法。

-测量多肽结合DNA内的Myc/Max识别位点(CACGTG位点)的能力的测定法，例如Soucek等人(同上)所述的电泳迁移率变动测定法(EMSA)。

-测量抑制Myc诱导的反式激活的能力的测定法，例如基于Soucek等人(同上)所述的在Myc/Max特异性的DNA结合位点控制下的报导基因表达的测定法。

-基于多肽抑制表达myc癌基因的细胞的生长的能力的测定法，如Soucek等人所述(同上)。

-测量多肽增强myc诱导的凋亡的能力的测定法，例如Soucek等人(Oncogene,1998:17,2463–2472)所述的测定法。此外，可以使用本领域中公知的用于评估细胞凋亡的任何测定法，例如Hoechst染色、碘化丙啶(PI)或膜联蛋白V染色、台盼蓝、DNA梯化/片段化和TUNEL。

在一个优选的实施方案中，如果多肽在一种或多种上述测定中显示出天然Omomyc的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的活性，则认为该多肽是Omomyc的功能等效变体。

在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO：1的多肽的功能等效变体包含其中SEQ IDNO：1的位置89处的残基X不是半胱氨酸的SEQ ID NO：1的多肽。优选地，SEQ ID NO：1的位置89处的残基X是脂族氨基酸、或硫代氨基酸、或二羧酸氨基酸或其酰胺、或具有两个碱性基团的氨基酸、或芳族氨基酸、或环状氨基酸、或羟基化氨基酸。更优选地，氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸，优选地选自丝氨酸和丙氨酸。

下表中公开了合适的SEQ ID NO：1的功能等效变体，其在SEQ ID NO：1的位置89处具有残基X而不是半胱氨酸。

因此，在优选的实施方案中，SEQ ID NO:1的功能等效变体选自由以下组成的组：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQID NO:10。

另外，Omomyc的功能等效变体也能够在变体与所述细胞接触后转导细胞。应当理解，Omomyc的功能等效变体包含在天然Omomyc中存在的蛋白质转导结构域或另一功能性蛋白质转导结构域。

在一个优选的实施方案中，如果多肽能够以SEQ ID NO：1的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的效率转导靶细胞，则认为该多肽是SEQ ID NO：1的功能等效变体。

另外，SEQ ID NO：1的功能等效变体也能够易位至靶肿瘤细胞的细胞核。

在一个优选的实施方案中，如果多肽能够以SEQ ID NO：1的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的效率易位至靶肿瘤细胞的细胞核，则认为该多肽是SEQ ID NO：1的功能等效变体。

就多肽在穿过细胞膜并易位至细胞核内的能力而言，用于确定多肽是否为SEQ IDNO：1的功能等效变体的合适测定法包括用对多肽具有特异性的试剂和特异性标记细胞核的染料(例如DAPI或Hoechst染料)对细胞进行双重标记。本发明的多肽的检测可以通过共聚焦显微镜或荧光显微镜进行。

在另一个优选的实施方案中，本发明的化合物(i)是缀合物，包含：包含序列SEQID NO：1的多肽或其功能等效变体，以及促进细胞摄取多肽或其功能等效变体的化学部分，

如本文所用，术语“缀合物”是指两个或更多个化合物共价连接在一起，使得每个化合物的功能保留在缀合物中。

术语“化学部分”是指包含至少一个碳原子的任何化合物。化学部分的实例包括但不限于任何富含疏水性氨基酸和疏水性化学部分的肽链。

在优选的实施方案中，根据本发明的缀合物包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个，至少9个、至少10个、或更多个促进细胞摄取多肽或所述多肽的功能等效变体的化学部分。

在一个实施方案中，促进细胞摄取多肽的化学部分是脂质或脂肪酸。

脂肪酸通常是包含在链的末端具有酸性部分(例如，羧酸)的碳链的分子。脂肪酸的碳链可以具有任何长度，但是，优选地，碳链的长度为至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16、17个、18个、19个、20个或更多个碳原子数，以及其中可推出的任何范围。在某些实施方案中，在脂肪酸的链部分中碳链的长度为4至18个碳原子。在某些实施方案中，脂肪酸碳链可以包含奇数个碳原子，然而，在某些实施方案中，链中有偶数个碳原子可能是优选的。在其碳链中仅包含单键的脂肪酸称为饱和的，而在其链中包含至少一个双键的脂肪酸称为不饱和的。脂肪酸可以是支链的，尽管在本发明的优选实施方案中，它是非支链的。具体的脂肪酸包括但不限于亚油酸、油酸、棕榈酸、亚麻酸、硬脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、花生酸、棕榈油酸、花生四烯酸。

在一个优选的实施方案中，促进细胞摄取包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体的化学部分是细胞穿透肽序列，在这种情况下，缀合物将包含融合蛋白，所述融合蛋白包括：包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体和细胞穿透肽序列。

术语“融合蛋白”涉及通过基因技术产生的蛋白，其由两个或更多个衍生自不同蛋白质的功能结构域组成。融合蛋白可以通过常规方式获得，例如，通过在合适的细胞中基因表达编码所述融合蛋白的核苷酸序列。应当理解，细胞穿透肽是指与形成包含SEQ ID NO：1的多肽或SEQ ID NO：1的功能等效变体的一部分的细胞穿透肽不同的细胞穿透肽。

术语“细胞穿透肽序列”在本说明书中与“CPP”、“蛋白质转导结构域”或“PTD”互换使用。它是指可变长度的肽链，其指导蛋白质在细胞内运输。向细胞内的递送过程通常是通过内吞作用发生的，但也可以通过直接的膜易位将肽内化到细胞中。CPP具有的氨基酸组成通常包含高相对丰度的带正电荷的氨基酸(如赖氨酸或精氨酸)，或具有包含交替模式的极性/带电荷氨基酸和非极性疏水性氨基酸的序列。

可以在本发明中使用的CPP的实例包括但不限于：在果蝇触角足蛋白中存在的CPP(RQIKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO:13)；在单纯疱疹病毒1(HSV-1)VP22 DNA-结合蛋白中存在的CPP(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE；SEQ ID NO:14)；Bac-7的CPP(RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG；SEQ ID NO:15)；由氨基酸49-57(RKKRRQRRR；SEQ ID NO:16)、氨基酸48-60(GRKKRRQRRRTPQ；SEQ ID NO:17)、氨基酸47-57(YGRKKRRQRRR；SEQ IDNO:18)组成的HIV-1 TAT蛋白的CPP；S413-PV肽的CPP(ALWKTLLKKVLKAPKKKRKV；SEQ ID NO:19)；穿透素(penetratin)的CPP(RQIKWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO:20)；SynB1的CPP(RGGRLSYSRRRFSTSTGR；SEQ ID NO:21)；SynB3的CPP(RRLSYSRRRF；SEQ ID NO:22)；PTD-4的CPP(PIRRRKKLRRLK；SEQ ID NO:23)；PTD-5的CPP(RRQRRTSKLMKR；SEQ ID NO:24)；FHVCoat-(35-49)的CPP(RRRRNRTRRNRRRVR；SEQ ID NO:25)；BMV Gag-(7-25)的CPP(KMTRAQRRAAARRNRWTAR；SEQ ID NO:26)；HTLV-II Rex-(4-16)的CPP(TRRQRTRRARRNR；SEQID NO:27)；D-Tat的CPP(GRKKRRQRRRPPQ；SEQ ID NO:28)；CPP R9-Tat(GRRRRRRRRRPPQ；SEQID NO:29)；MAP的CPP(KLALKLALKLALALKLA；SEQ ID NO:30)；SBP的CPP(MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV；SEQ ID NO:31)；FBP的CPP(GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV；SEQ ID NO:32)；MPG的CPP(ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya；SEQ ID NO:33)；MPG(ENLS)的CPP(ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya；SEQ ID NO:34)；Pep-1的CPP(ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya；SEQ ID NO:35)；Pep-2的CPP(ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya；SEQ ID NO:36)；具有结构RN(其中N为4至17)的多聚精氨酸序列；GRKKRRQRRR序列(SEQID NO:37)；RRRRRRLR序列(SEQ ID NO:38)；RRQRRTS KLMKR序列(SEQ ID NO:39)；运输蛋白(Transportan)GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:40)；KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(SEQ ID NO:41)；RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:42)；YGRKKRRQRRR序列(SEQID NO:43)；RKKRRQRR序列(SEQ ID NO:44)；YARAAARQARA序列(SEQ ID NO:45)；THRLPRRRRRR序列(SEQ ID NO:46)；GGRRARRRRRR序列(SEQ ID NO:47)。

在一个优选的实施方案中，所述穿透细胞肽不是SEQ ID NO：1中包含的内源性肽。

在一个优选的实施方案中，CPP是HIV-1 TAT蛋白的CPP，其由氨基酸49-57(RKKRRQRRR，SEQ ID NO：16)组成。在另一个优选的实施方案中，CPP是GRKKRRQRRR序列(SEQID NO：37)或RRRRRRLR(SEQ ID NO：38)。在另一个实施方案中，CPP是GRKKRRQRRR序列(SEQID NO：37)或RRRRRRRR(SEQ ID NO：65)。

在一些实施方案中，CPP是如WO2019/018898中所述的CPP，WO2019/018898的全部内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，细胞穿透肽序列在本发明的多肽或所述多肽的功能等效变体的N-端处融合。在另一个实施方案中，所述细胞穿透肽在本发明的多肽或所述多肽的功能等效变体的C-端处融合。

在优选的实施方案中，除了在SEQ ID NO：1的多肽或所述多肽的功能等效变体中存在的自身细胞穿透肽外，根据本发明的组合的缀合物或融合蛋白还包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、或更多种其他细胞穿透肽。

本发明的合适的融合蛋白包括如下定义的多肽Omomyc*TAT和Omomyc*LZArg：

因此，在一个优选的实施方案中，融合蛋白是选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的多肽。

用于确定缀合物是否保留Omomyc的细胞膜易位能力的合适测定法包括但不限于测量缀合物转导培养中细胞的能力的测定法。该测定法基于使缀合物与培养细胞接触并检测在细胞内位置中缀合物的存在。

在另一个优选的实施方案中，本发明的组合的缀合物还包含另外的核定位信号。

如本文所用，术语“核定位信号”(NLS)是指长度为约4至20个氨基酸残基的氨基酸序列，其用于将蛋白质引导至核。核定位序列富含碱性氨基酸，示例性的序列是本领域熟知的(Gorlich D.(1998)EMBO5.17:2721-7)。在一些实施方案中，NLS选自由以下组成的组：SV40大T抗原NLS(PKKKRKV,SEQ ID NO:48)；核质蛋白NLS(KRPAATKKAGQAKKKK，SEQ ID NO:49)；CBP80 NLS(RRRHSDENDGGQPHKRRK,SEQ ID NO:50)；HIV-I Rev蛋白NLS(RQARRNRRRWE，SEQ ID NO:51)；HTLV-I Rex(MPKTRRRPRRSQRKRPPT，SEQ ID NO:52)；hnRNP A NLS(NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFKPRNQGGY，SEQ ID NO:53)；rpL23a NLS(VHSHKKKKIRTSPTFTTPKTLRLRRQPKYPRKSAPRRNKLDHY,SEQ ID NO:54)。在本发明的一个实施方案中，核定位信号包含基序K(K/R)X(K/R)(SEQ ID NO:55)。

在甚至更优选的实施方案中，核定位信号选自由以下组成的组：PKKKRKV(SEQ IDNO:48)、PAAKRVKLD(SEQ ID NO:56)和KRPAATKKAGQ AKKKK(SEQ ID NO:49)。

在另一个优选的实施方案中，NLS可以是包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体的缀合物或融合蛋白的N-端或C-端。

技术人员将理解，可以期望本发明的缀合物还包含一个或多个柔性肽，其连接包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体、细胞穿透肽序列和/或NLS。因此，在一个具体实施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体直接连接至细胞穿透肽序列。在另一个具体实施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体通过柔性肽连接至细胞穿透肽序列。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能变体直接连接至NLS。在另一个实施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体通过柔性肽连接至NLS。

在一个具体实施方案中，根据本发明的缀合物的多肽直接连接至细胞穿透肽序列和NLS。

在一个实施方案中，NLS是在Myc序列中内源性出现的NLS之一，例如M1肽(PAAKRVKLD，SEQ ID NO：56)或M2肽(RQRRNELKRSF，SEQ ID NO：57)。

在另一个实施方案中，另外的NLS是指与包含SEQ ID NO：1的多肽中或SEQ ID NO：1的功能等效变体中存在的内源性NLS不同的NLS。

在优选的实施方案中，除了在本发明的多肽或其功能等效变体中存在的内源性NLS外，根据本发明的缀合物或融合蛋白还包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种NLS。

在另一个具体实施方案中，根据本发明之用途的缀合物的多肽通过第一柔性肽接头连接至细胞穿透肽序列，并通过第二柔性肽接头连接至NLS。

如本文所用，术语“柔性肽”、“间隔肽”或“接头肽”是指共价结合两个蛋白质或部分但其不是任一多肽的一部分的肽，这允许一个相对于另一个移动，但不会对蛋白质或部分的功能产生实质性的有害影响。因此，柔性接头不影响多肽序列的肿瘤追踪活性、细胞穿透肽的细胞穿透活性或NLS的核定位能力。

柔性肽包含至少一个氨基酸、至少两个氨基酸、至少三个氨基酸、至少四个氨基酸、至少五个氨基酸、至少六个氨基酸、至少七个氨基酸、至少八个氨基酸酸、至少九个氨基酸、至少10个氨基酸、至少12个氨基酸、至少14个氨基酸、至少16个氨基酸、至少18个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、或约100个氨基酸。在一些实施方案中，柔性肽将允许一种蛋白质相对于另一种蛋白质运动，以增加蛋白质的溶解性和/或改善其活性。合适的接头区域包括聚甘氨酸区域，甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸残基的组合的GPRRRR序列(SEQ ID NO：58)。

在一个具体实施方案中，根据本发明的缀合物包含与所述缀合物或与所述多肽或融合蛋白或其变体的C-端或N-端结构域结合的标签。所述标签通常是可以用于所述融合蛋白的分离或纯化的肽或氨基酸序列。因此，所述标签能够以高亲和力结合一种或多种配体，例如亲和基质(例如，色谱支持物或珠)的一种或多种配体。所述标签的实例是组氨酸标签(His标签或HT)，例如包含6个组氨酸残基(His6或H6)的标签，其可以以高亲和力结合至镍(Ni²⁺)柱或钴(Co²⁺)柱。His标签具有期望的特性，即其可以在使大多数蛋白质变性且破坏大多数蛋白质-蛋白质相互作用的条件下结合其配体。因此，在诱饵参与的蛋白质-蛋白质相互作用被破坏后，它可以用于除去用H6标记的诱饵蛋白质。

用于分离或纯化缀合物或包含SEQ ID NO：1的多肽或其变体或融合蛋白的标签的其他示例性的非限制性实例包括Arg-标签、FLAG-标签(DYKDDDDK；SEQ ID NO：59)、Strep-标签(WSHPQFEK，SEQ ID NO：60)、能够被抗体识别的表位如c-myc-标签(被抗c-myc抗体识别)、HA标签(YPYDVPDYA，SEQ ID NO：61)、V5标签(GKPIPNPLLGLDST，SEQ ID NO：62)、SBP-标签、S-标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、谷胱甘肽S-转移酶-标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi-tag等(Terpe K.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2003,60:523-525)、氨基酸序列如AHGHRP(SEQ ID NO：63)或PIHDHDHPHLVIHSGMTCXXC(SEQ ID NO：64)、β-半乳糖苷酶等。

如果需要，可以将标签用于所述融合蛋白的分离或纯化。

在另一个优选的实施方案中，本发明的化合物(i)是编码上述多肽或融合蛋白的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，本发明的化合物(i)是编码包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的化合物(i)是编码缀合物的多核苷酸，所述缀合物包括包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体以及促进细胞摄取该多肽或其功能等效变体的化学部分；更优选地是编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白是包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体与细胞穿透肽序列之间的融合蛋白。

术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，是指任何长度的聚合形式的核苷酸。多核苷酸可以包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以实施任何已知或未知的功能。术语“多核苷酸”包括例如，单链、双链和三螺旋分子，基因或基因片段，外显子，内含子，mRNA，tRNA，rRNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，带分支的多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。除天然核酸分子外，本发明的核酸分子还可以包含修饰的核酸分子。如本文所用，mRNA是指可以在细胞中翻译的RNA。

在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸是mRNA。

mRNA可以是化学合成的，可以通过体外转录获得，或者可以在靶细胞中体内合成。形成编码本发明的缀合物或融合蛋白的多核苷酸的核苷酸序列在用于其表达的相同的正确阅读框中。

在一个优选的实施方案中，本发明的组合的组分(i)是编码由序列SEQ ID NO：1组成的多肽、或由SEQ ID NO：1的功能等效变体组成的多肽、或由SEQ ID NO：4组成的多肽的mRNA。

在另一个实施方案中，本发明的组合的组分(i)是包含本发明的多核苷酸的载体。

如本文所用，术语“载体”是指下述的核酸序列，其包含必需序列，从而使得在细胞中转录和翻译所述序列后，会产生由本发明的多核苷酸编码的多肽。所述序列可操作地连接至允许其在感兴趣的宿主细胞中自主复制的其他区段。优选地，载体是表达载体，其被定义为除在宿主细胞中自主复制的区域外，还包含与本发明的核酸可操作地连接的区域并且能够增强根据本发明的核酸的产物的表达的载体。本发明的载体可以通过本领域广泛已知的技术获得。

载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体、以及某些真核细胞，例如生产者细胞。包含本发明的多核苷酸的合适载体是衍生自以下的载体：原核生物中的表达载体(例如pUC18、pUC19、pBluescript及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4)，噬菌体和“穿梭”载体(例如pSA3和pAT28)，酵母中的表达载体(例如2-微米质粒类型的载体、整合质粒，YEP载体、着丝粒质粒和类似物)，昆虫细胞中的表达载体(例如pAC系列和pVL系列的载体)，植物中的表达载体(例如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE和类似物)，以及基于病毒载体(腺病毒、与腺病毒相关的病毒以及逆转录酶病毒和特别是慢病毒)的高等真核生物细胞中的表达载体，以及非病毒载体，例如pSilencer 4.1-CMV(Ambion)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、plND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL、pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDT1。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含在选自由pEGFP、或pBabe逆转录酶病毒载体和pTRIPZ、或pSLIK慢病毒载体组成的组的载体中。

本发明的载体可以用于转化、转染或感染能够被所述载体转化、转染或感染的细胞。所述细胞可以是原核的或真核的。

载体优选包含本发明的多核苷酸，其可操作地结合至调节本发明的多核苷酸表达的序列。在本发明中使用的调节序列可以是核启动子，或者是增强子序列和/或增加异源核酸序列表达的其他调节序列。原则上，任何启动子都可以用于本发明，只要所述启动子与待表达的多核苷酸的细胞相容即可。因此，适用于实现本发明的启动子包括但不必限于组成型启动子，例如真核病毒基因组的衍生物(例如多瘤病毒、腺病毒、SV40、CMV、禽肉瘤病毒、乙型肝炎病毒)，金属硫蛋白基因启动子，单纯疱疹病毒胸苷激酶基因启动子，逆转录酶病毒的LTR区，免疫球蛋白基因启动子，肌动蛋白基因启动子，EF-1α基因启动子，以及其中蛋白质表达取决于分子或外源信号的添加的诱导型启动子(例如四环素系统、NFκB/UV光系统、Cre/Lox系统和热休克基因启动子)，WO/2006/135436中所述的可调节RNA聚合酶Ⅱ激活子和组织特异性激活子。

在另一个实施方案中，本发明的组合的组分(i)是能够将本发明的多肽或本发明的缀合物、优选本发明的多肽或本发明的融合蛋白分泌到培养基中的细胞。

能够分泌本发明的多肽的合适细胞包括但不限于心肌细胞、脂肪细胞、内皮细胞、上皮细胞、淋巴细胞(B细胞和T细胞)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、血管内膜细胞、不同器官的分离细胞的原代培养物(优选分离自胰岛的细胞)、肝细胞、白细胞(包括单核白细胞)、间充质干细胞、脐带或成年(的皮肤、肺、肾和肝)、破骨细胞、软骨细胞和其他结缔组织细胞。建立的细胞系如Jurkat T细胞、NIH-3T3、CHO、Cos、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3细胞、C2C12成肌细胞和W138细胞也是合适的。本领域技术人员将理解，可以发现能够将本发明的多肽分泌到培养基中的细胞形成微粒或微囊，从而使这些细胞在患者中具有更长的使用寿命。适用于形成本发明的微粒物体的材料包括允许连续分泌治疗性产物并充当细胞的支持物的任何生物兼容性聚合物材料。因此，所述生物兼容性聚合物材料可以是例如热塑性聚合物或氢聚合物。在热塑性聚合物中，有丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、聚(四氟乙烯-共六氟丙烯)、甲基丙烯酸-(7-cumaroxy)乙酯酸、N-异丙基丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚酰胺-胺、聚(氨基)-对-二甲苯、聚(氯乙基乙烯基醚)、聚己酸内酯、聚(碳酸己内酯-共-三亚甲基)、聚(碳酸尿素)氨基甲酸乙酯、聚(碳酸盐)氨基甲酸乙酯、聚乙烯、聚乙烯和丙烯酰胺共聚物、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸乙二醇酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚(丙烯酸4-羟基丁酯)、聚(甲基丙烯酸羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸N-2-羟基丙基酯)、聚(乳酸乙醇酸)、聚(L-乳酸)、聚(γ-甲基，L-谷氨酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯富马酸酯)、聚(氧化丙烯)、聚吡咯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚氨酯、聚乙烯醇、超高分子量聚乙烯、6-(对乙烯基苯甲酰胺)-己酸，N-对乙烯基苄基-D-麦芽糖酰胺、以及含有多于一种所述聚合物的共聚物。在水凝胶型的聚合物中，有天然材料的海藻酸盐、琼脂糖、胶原蛋白、淀粉、透明质酸、牛血清白蛋白、纤维素及其衍生物、果胶、硫酸软骨素、纤维蛋白和丝蛋白、以及合成水凝胶(例如和)。

本发明的组合的化合物(ii)是肿瘤免疫剂。

如本文所用，术语“肿瘤免疫剂”是指有效增强、刺激和/或上调受试者免疫反应的试剂。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂与本发明的组合的化合物(i)的给药对治疗癌症具有协同作用。

肿瘤免疫剂可以是例如小分子药物、抗体、或生物分子、或小分子。生物肿瘤免疫剂的实例包括但不限于癌症疫苗、抗体和细胞因子。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是人源化的或人的。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是细胞因子。

“细胞因子”被理解为具有不同尺寸和分子量的肽，这些肽为了调节免疫反应的目的而合成免疫系统的细胞，它们可以是激素、生长因子、坏死因子、趋化因子等。它们可以是天然来源或来源于重组细胞培养物以及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。示例性细胞因子可以是抑制T细胞活化的细胞因子，例如IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF和其他免疫抑制性细胞因子；或刺激T细胞活化的细胞因子，以刺激免疫反应。它们与抗体的结合产生免疫细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是重组人白介素15(rhIL-15)、重组人白介素12(rhIL-12)(例如，NM-IL-12(Neumedicines,Inc.)、或异质二聚体IL-15(hetIL-15，Novartis/Admune)、由与可溶性IL-15结合蛋白IL-15受体α链(IL15：sIL-15RA)复合的内源性IL-15的合成形式构成的融合复合物。

在另一个实施方案中，细胞因子选自由以下组成的组：IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、II、10、ILII、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、11,31、1L32、IL33、11、35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-lFl、IL-1β/IL-lF2、IL-12p70、IL-12/IL-35p35、IL-13、IL-17/1L-17A、IL-17A/F异质二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、1L-23、IL-24、IL-32、TL-32β、IL-32γ、iL-33、LAP(TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β,TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSFl l/RANK L及其任意组合。

在优选的实施方案中，肿瘤免疫剂不是细胞因子。因此，在优选的实施方式中，细胞因子被排除在本发明的范围之外。优选地，本发明排除的细胞因子是TNF因子α、INF-γ、GM-GSF因子和IL-2。

在另一个优选的实施方案中，仅当组合的组分(i)是组分(i)(a)或(i)(b)时，细胞因子才排除在本发明的范围之外。因此，在一个实施方案中，如果组合的组分(i)是包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体，或包括包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效变体以及促进细胞摄取多肽或其功能等效变体的化学部分的缀合物，那么肿瘤免疫剂不是细胞因子，优选地不是选自由TNF因子α、INF-γGM-GSF因子和IL-2组成的组的细胞因子。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是(i)刺激性(包括共刺激性)受体的激动剂，或(ii)T细胞上抑制性(包括共抑制性)信号的拮抗剂，两者均导致放大抗原特异性T细胞反应。

某些刺激性和抑制性分子是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。与共刺激性或共抑制性受体结合的一个重要的膜结合配体家族是B7家族，包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)和B7-H6。

另一个与共刺激性或共抑制性受体结合的膜结合配体家族是与同源TNF受体家族成员结合的TNF分子家族，其包括CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137(4-1BB)、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR。

在一些实施方案中，本发明的化合物(i)和肿瘤免疫剂的组合可以刺激T细胞应答。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是：(i)抑制T细胞活化的蛋白质(例如免疫检查点抑制剂)的拮抗剂，所述蛋白质例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、和TIM-4；(ii)刺激T细胞活化的蛋白质的激动剂，所述蛋白质例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是NK细胞上的抑制性受体的拮抗剂或NK细胞上激活性受体的激动剂。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是KIR的拮抗剂，例如lirilumab。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是抑制或消耗巨噬细胞或单核细胞的剂，包括但不限于CSF-1R拮抗剂，例如CSF-1R拮抗剂抗体，包括RG7155(WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、WO13/87699、WO13/119716、WO13/132044)或FPA-008(WO11/140249、WO13169264、WO14/036357)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂选自连接(ligate)阳性共刺激性受体的激动剂，通过抑制性受体减弱信号传导的阻断剂，拮抗剂，以及全身性增加抗肿瘤T细胞频率的一种或多种剂，克服肿瘤微环境中不同的免疫抑制路径(例如，阻断抑制性受体参与(例如，PD-L1/PD-1相互作用)、消耗或抑制Treg(例如，使用抗CD25单克隆抗体(例如，daclizumab)或通过体外抗CD25珠耗尽)、抑制代谢酶如IDO、或逆转/预防T细胞能量或耗尽)的剂，以及在肿瘤部位触发先天性免疫活化和/或炎症的剂。

如本文所用，术语“细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4”(缩写为“CTLA-4”，也称为分化簇152(CD152))是指作为免疫检查点起作用的蛋白质受体。CTLA-4是免疫球蛋白超家族的成员，其由活化的T细胞表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA-4与T细胞共刺激性蛋白CD28同源，并且两个分子均结合至抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也被分别称为B7-1和B7-2)。与CD28相比，CTLA-4以更大的亲和力和亲合力结合CD80和CD86，从而使其能够竞争超过CD28以结合其配体。CTLA-4向T细胞传递抑制信号，而CD28则传递刺激信号。CTLA-4还存在于调节性T细胞(Treg)中，并有助于其抑制功能。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化使得CTLA-4表达增加。CTLA-4蛋白是由人的CTLA-4基因编码的(数据库索引：ENSG00000163599)。通常，在T细胞活化后，CTLA-4在质膜上被上调，在这里它通过多种机制下调T细胞功能，包括通过竞争超过CD28结合其配体B7以及通过诱导T细胞周期阻滞而阻止共刺激(Postow等人(2015)J.Clinical oncology,Vol.33,第1974-1983页；Pardoll,D.等人(2012),NatureReviews Cancer 12,252-264)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是CTLA-4拮抗剂。如本文所用，术语“CTLA-4拮抗剂”是指但不限于阻断CTLA-4与其配体B7-1和/或B7-2结合的任何化合物或剂或生物分子。在本发明的上下文中，应理解，当用CTLA-4拮抗剂(例如，CTLA-4抗体)治疗受试者(例如人类个体)时，CTLA-4拮抗剂阻断(人)CTLA-4与(人)B7-1和/或B7-2的结合。

当前考虑用于临床使用治疗癌症的CTLA-4拮抗剂化合物的非限制性实例包括针对CTLA-4的拮抗性抗体。

在一些实施方案中，CTLA-4拮抗剂是拮抗性CTLA-4抗体。在一些实施方案中，拮抗性CTLA-4抗体是YERVOY(ipilimumab)或tremelimumab。

CTLA-4拮抗剂的其他非限制性实例包括免疫粘附素(也称为融合蛋白)，它们是能够特异性结合CTLA-4并阻断其结合至B7-1和/或B7-2的化合物。

如本文所用，术语“程序性死亡1(PD-1)”受体是指属于CD28家族的免疫抑制性受体。在人类中，PD-1由PDCD1基因编码。PD-1主要在体内先前活化的T细胞上表达，并与两个配体PD-L1和PD-L2结合。如本文所用的，术语“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)，hPD-1的变体、亚型(isoform)和种同源物，以及具有至少一个与hPD-1共同的表位的类似物。完整的hPD-1序列可以在GENBANK登记号No.U64863下找到。PD-1在免疫细胞上表达，所述免疫细胞例如活化的T细胞(包括效应T细胞)、B细胞、骨髓细胞、胸腺细胞、以及自然杀伤(NK)细胞(SuyaDai等人(2014)Cellular Immunology,Vol:290,第72-79页；Gianchecchi等人(2013),Autoimmun.Rev.12 1091-1 100)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是PD-1拮抗剂。如本文所用，术语“PD-1拮抗剂”是指但不限于阻断在癌细胞上表达的PD-L1与在免疫细胞(T细胞，B细胞或NKT细胞)上表达的PD-1的结合的任何化合物或剂或生物分子(例如抗体)，和/或阻断在癌细胞上表达的PD-L2与在免疫细胞表达的PD-1的结合的任何化合物或剂或生物分子(例如抗体)。在本发明的上下文中，应理解，当用PD-1拮抗剂(例如，PD-1抗体)治疗受试者(例如，人类个体)时，PD-1拮抗剂阻断(人)PD-L1与(人)PD-1的结合，或阻断(人)PD-L2与(人)PD-1的结合，并且优选地阻断(人)PD-L1和PD-L2二者与(人)PD-1的结合。人PD-1氨基酸序列可以在NCBI位点No.:NP_005009中找到。人PD-L1和PD-L2氨基酸序列可以分别在NCBI位点No.:NP_054862和NP_079515中找到。

PD-1拮抗剂的非限制性实例是针对PD-1的抗体(也称为PD-1抗体或抗PD-1抗体)，例如PD-1单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，其特异性结合PD-1，并且优选地特异性地结合人PD-1。mAb可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，并且可以包括人恒定区。PD-1拮抗剂化合物的非限制性实例包括PD-1抗体，例如纳武单抗(nivolumab)(Bristol-Myers Squibb)、派姆单抗(pembrolizumab)(Merck)、BGB-A317、和其他抗体，例如PDR001(Novartis)。PD-1拮抗剂的其他非限制性实例包括皮地利珠单抗(pidilizumab)(Cure Tech)、AMP-224(GlaxoSmithKline)、AMP-514(GlaxoSmithKline)、PDR001(Novartis)和cemiplimab(Regeneron和Sanofi)。其他PD-1拮抗剂还包括在US8008449、US7521051和US8354509中描述的任何抗PD-1抗体。

PD-1拮抗剂的其他非限制性实例包括免疫粘附素(immunoadhesin,也称为融合蛋白)，其是能够特异性结合PD-1并阻断其与PD-L1结合的化合物。特异性结合PD-1的免疫粘附分子的实例描述于WO2010/027827、US2016/0304969和WO2011/066342中。例如，可以在本发明中用作PD-1拮抗剂的融合蛋白的非限制性实例是AMP-224(其是由PD-1配体程序性细胞死亡配体2(PD-L2，B7-DC)的胞外域和人免疫球蛋白(Ig)G1的Fc区构成的重组B7-DC Fc融合蛋白)。

如本文所用，术语“抗体”(例如PD-1抗体和CTLA-4抗体)是指表现出期望的生物学活性或结合活性(例如，如上所述，阻断PD-1与其配体的结合或阻断CTLA-4与其配体的结合)的任何形式的抗体及其片段。因此，其以最广泛的意义使用，并且具体覆盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)及其片段，多克隆抗体及其片段，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其片段，人源化抗体、完全人抗体、及其片段，嵌合抗体及其片段，以及骆驼化(camelized)的单结构域抗体及其片段。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是特异性结合至程序性死亡-1(PD-1)受体并抑制PD-1活性的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是拮抗性的PD-1抗体。在一些实施方案中，拮抗性的PD-1抗体是OPDIVO(nivolumab)、KEYTRUDA(pembrolizumab)、或MEDI-0680(AMP-514；WO2012/145493)。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂可以是皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是由融合至IgG1的Fc部分的PD-L2的胞外结构域(B7-DC)构成的重组蛋白，被称为AMP-224。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是PD-L1拮抗剂。在一些实施方案中，PD-L1拮抗剂是拮抗性PD-L1抗体。在一些实施方案中，PD-L1抗体是MPDL3280A(RG7446；WO2010/077634)、durvalumab(MEDI4736)、BMS-936559(WO2007/005874)、和MSB0010718C(WO2013/79174)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是LAG-3拮抗剂。在一些实施方案中，LAG-3拮抗剂是拮抗性LAG-3抗体。在一些实施方案中，LAG3抗体是BMS-986016(WO10/19570、WO14/08218)或IMP-731或IMP-321(WO08/132601、WO009/44273)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是CD137(4-1BB)激动剂。在一些实施方案中，CD137(4-1BB)激动剂是激动性CD137抗体。在一些实施方案中，CD137抗体是urelumab或PF-05082566(WO12/32433)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是GITR激动剂。在一些实施方案中，GITR激动剂是激动性GITR抗体。在一些实施方案中，GITR抗体是BMS-986153、BMS-986156、TRX-518(WO006/105021、WO009/009116)或MK-4166(WO11/028683)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)拮抗剂。在一些实施方案中，IDO拮抗剂选自艾卡哚司他(epacadostat)(INCB024360,Incyte)；indoximod(NLG-8189,NewLink Genetics Corporation)；卡马替尼(capmanitib)(INC280,Novartis)；GDC-0919(Genentech/Roche)；PF-06840003(Pfizer)；BMS:F001287(Bristol-Myers Squibb)；Phy906/KD108(Phytoceutica)；分解犬尿氨酸(kynurenine)的酶(Kynase,Kyn Therapeutics)；以及NLG-919(WO09/73620、WO009/1156652、WO11/56652、WO12/142237)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是OX40激动剂。在一些实施方案中，OX40激动剂是激动性OX40抗体。在一些实施方案中，OX40抗体是MEDI-6383或MEDI-6469。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是OX40L拮抗剂。在一些实施方案中，OX40L拮抗剂是拮抗性OX40L抗体。在一些实施方案中，OX40L拮抗剂是RG-7888(WO06/029879)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是CD40激动剂。在一些实施方案中，CD40激动剂是激动性CD40抗体。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是CD40拮抗剂。在一些实施方案中，CD40拮抗剂是拮抗性CD40抗体。在一些实施方案中，CD40抗体是鲁卡木单抗(lucatumumab)或达西珠单抗(dacetuzumab)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是CD27激动剂。在一些实施方案中，CD27激动剂是激动性CD27抗体。在一些实施方案中，CD27抗体是varlilumab。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是MGA271(针对B7H3)(WO11/109400)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠(afutuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、麻安莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿泊珠单抗(apolizumab)、atezolimab、阿维鲁单抗(avelumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、BMS-936559、卡妥索单抗(catumaxomab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、艾卡哚司他(epacadostat)、依帕珠单抗(epratuzumab)、indoximod、伊珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)、英妥木单抗(intelumumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、isatuximab、拉姆布罗力珠单抗(lambrolizumab)、MED14736、MPDL3280A、纳武单抗(nivolumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥卡拉珠单抗(ofatumumab)、奥拉图单抗(olatatumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、替西木单抗(ticilimumab)、沙玛立珠单抗(samalizumab)或曲美木单抗(tremelimumab)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是免疫刺激剂。例如，阻断PD-1和PD-L1抑制性轴的抗体可以释放活化的肿瘤反应性T细胞，并且在临床试验中已显示在越来越多的肿瘤组织学中诱导持久的抗肿瘤反应，包括传统上尚未被认为对免疫疗法敏感的某些肿瘤类型。抗PD-1抗体nivolumab(Bristol-Myers Squibb，也称为ONO-4538、MDX1106和BMS-936558)已显示出改善患有RCC的患者的总存活率的潜力，患有RCC的患者是在先前的抗血管生成的疗法期间或之后经历了疾病进展。

在一些实施方案中，免疫调节治疗剂特异性地诱导肿瘤细胞的凋亡。经批准的可以用于本发明的免疫调节治疗剂包括泊马度胺(pomalidomide)(Celgene)；和来那度胺(lenalidomide)(Celgene)；巨大戟醇甲基丁烯酸酯(LEO Pharma)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是癌症疫苗。在一些实施方案中，所述癌症疫苗选自sipuleucel-T(Dendreon/Valeant Pharmaceuticals)和talimogenelaherparepvec(BioVex/Amgen，以前称为T-VEC)。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂选自溶瘤病毒疗法，例如pexastimogene devacirepvec(PexaVec/JX-594,SillaJen/formerly Jennerex Biotherapeutics)、pelareorep(OncolyticsBiotech)、enadenotucirev(NG-348,PsiOxus,formerly known as ColoAd1)、ONCOS-102(Targovax/formerly Oncos)、工程化以表达β-半乳糖苷酶(β-gal)/β-葡萄糖醛酸酶和/或β-gal/人钠碘转运体(hNIS)的痘苗病毒如GL-ONC1(GLV-1h68/GLV-1h153,Genelux GmbH)、以及工程化以表达GM-CSF的腺病毒如CG0070(Cold Genesys)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂选自JX-929(SillaJen/以前的JennerexBiotherapeutics)、TG01和TG02(Targovax/以前的Oncos)、TILT-123(TILTBiotherapeutics)和VSV-GP(ViraTherapeutics)。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是工程化以表达嵌合抗原受体或CAR的T细胞。工程化以表达这种嵌合抗原受体的T细胞被称为CAR-T细胞。已经构建了由结合结构域组成的CAR，所述结合结构域可以衍生自天然配体、衍生自对细胞表面抗原具有特异性的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)，可以融合至作为T细胞受体(TCR)的功能末端的胞内结构域，例如TCR的CD3-ζ(zeta)信号结构域，其能够在T淋巴细胞中产生活化信号。抗原一旦结合，此类CAR连接至效应细胞中的内源性信号通路，并产生类似于由TCR复合物引发的那些活化信号的活化信号。

例如，在一些实施方案中，CAR-T细胞是美国专利8,906,682(June；通过引用整体并入本文)中描述的那些，其公开了CAR-T细胞被工程化以包含具有抗原结合结构域(例如与CD19结合的结构域)的胞外结构域，融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(例如CD3ζ)的胞内信号结构域。当在T细胞中表达时，CAR能够基于抗原结合特异性来复位向抗原识别。对于CD19的情况，抗原在恶性B细胞上表达。目前正在进行200多个在各种适应症中使用CAR-T的临床试验。[https://clinicaltrials.gov/ct2/results？term＝chimeric+antigen+receptors&pg＝1]。

在一些实施方案中，免疫刺激剂是视黄酸受体相关的孤儿受体γ(RORγt)的活化剂。RORγt是一种转录因子，在CD4⁺(Th17)和CD8⁺(Tc17)T细胞的17型效应物子集的分化和维持以及表达IL-17的先天免疫细胞亚群如NK细胞的分化中起关键作用。在一些实施方案中，RORγt的活化剂是LYC-55716(Lycera)，其目前正在用于治疗实体瘤的临床试验中评估(NCT02929862)。

在一些实施方案中，免疫刺激剂是toll样受体(TLR)的激动剂或活化剂。TLR的合适活化剂包括TLR9的激动剂或活化剂，例如SD-101(Dynavax)。可以用于本发明的TLR8的激动剂或活化剂包括motolimod(VTX-2337，VentiRx Pharmaceuticals)。

可以在本发明中使用的其他肿瘤免疫剂包括：urelumab(BMS-663513,Bristol-Myers Squibb)、抗CD137单克隆抗体、varlilumab(CDX-1127，Celldex Therapeutics)、抗CD27单克隆抗体、BMS-986178(Bristol-Myers Squibb)、抗OX40单克隆抗体、lirilumab(IPH2102/BMS-986015，Innate Pharma，Bristol-Myers Squibb)、抗KIR单克隆抗体、monalizumab(IPH2201，Innate Pharma，AstraZeneca)、抗NKG2A单克隆抗体、andecaliximab(GS-5745，Gilead Sciences)、抗MMP9抗体、MK-4166(Merck&Co.)、抗GITR单克隆抗体。

在一些实施方案中，免疫刺激剂选自艾洛珠单抗(elotuzumab)、米伐木肽(mifamurtide)、toll样受体的激动剂或活化剂、以及RORγt的活化剂。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂选自Jerry L.Adams等人，“Big opportunitiesfor small molecules in immuno-oncology,”Cancer Therapy 2015,Vol.14，第603-622页描述的那些，其全部内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂选自Jerry L.Adams等人的表1中描述的实例。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是靶向选自JerryL.Adams等人的表2中列出的肿瘤免疫靶目标小分子。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是选自Jerry L.Adams等人的表2中列出的那些小分子剂。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂选自Peter L.Toogood,“Small moleculeimmuno-oncology therapeutic agents,”Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters2018,Vol.28，第319-329页所描述的小分子肿瘤免疫剂，其全部内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是靶向如Peter L.Toogood所描述的通路的试剂。

在一些实施方案中，肿瘤免疫剂选自Sandra L.Ross等人，“Bispecific T cellengagerantibody constructs can mediate bystander tumor cellkilling”,PLoS ONE 12(8):e0183390所描述的那些，其全部内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是双特异性T细胞衔接抗体构建体。在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接抗体构建体是CD19/CD3双特异性抗体构建体。在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接抗体构建体是EGFR/CD3双特异性抗体构建体。在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接抗体构建体活化T细胞。在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接抗体构建体活化T细胞，其释放细胞因子，诱导旁观者细胞上的细胞间粘附分子1(ICAM-1)和FAS上调。在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接抗体构建体活化T细胞，其导致诱导的旁观者细胞裂解。在一些实施方案中，旁观者细胞是实体瘤。在一些实施方案中，裂解的旁观者细胞与-活化的T细胞邻近。在一些实施方案中，旁观者细胞包含肿瘤相关抗原(TAA)阴性癌细胞。在一些实施方案中，旁观者细胞包括EGFR阴性癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是阻断PD-L1/PD1轴和/或CTLA4的抗体。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是离体(ex-vivo)扩增的肿瘤浸润T细胞。在一些实施方案中，肿瘤免疫剂是将T细胞与肿瘤相关表面抗原(TAA)直接连接的双特异性抗体构建体或嵌合抗原受体(CAR)。

在另一个实施方案中，本发明的组合的肿瘤免疫剂是抑制T细胞活化的蛋白质的拮抗剂或免疫检查点抑制剂。

如本文所用，术语“检查点抑制剂”涉及可用于防止癌细胞避开患者免疫系统的剂。抗肿瘤免疫力破坏的主要机制之一是“T细胞衰竭”，它是由于长期暴露于导致抑制性受体上调的抗原所致。这些抑制性受体充当免疫检查点，以防止不受控的免疫反应。

PD-1和共抑制性受体，例如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA、CD272)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(Tim-3)、淋巴细胞活化基因-3(Lag-3、CD223)等等通常称为检查点调节子。它们充当分子“守门者(gatekeeper)”，使细胞外信息能够指示细胞周期进程和其他细胞内信号传导过程是否应该继续进行。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是针对PD-1的抗体。PD-1与程序性细胞死亡1受体(PD-1)结合，以防止该受体与抑制性配体PDL-1结合，从而抑制(overriding)了肿瘤抑制宿主抗肿瘤免疫反应的能力。

一方面，检查点抑制剂是生物治疗剂或小分子。另一方面，检查点抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、完全人抗体、融合蛋白、或其组合。在其他方面，检查点抑制剂抑制选自以下的检查点蛋白：CTLA-4、PDLl、PDL2、PDl、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合物。在其他方面，检查点抑制剂与选自以下的检查点蛋白的配体相互作用：CTLA-4、PDLl、PDL2、PDl、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合物。在一方面，检查点抑制剂是免疫刺激剂、T细胞生长因子、白介素、抗体、疫苗或其组合。在另一方面，白介素是IL-7或IL-15。在一个具体方面，白介素是糖基化的IL-7。在另一方面，疫苗是树突细胞(DC)疫苗。

检查点抑制剂包括以统计学上显著性的方式阻断或抑制免疫系统的抑制性通路的任何剂。这样的抑制剂可以包括小分子抑制剂，或者可以包括结合并阻断或抑制免疫检查点受体的抗体或其抗原结合片段，或者结合并阻断或抑制免疫检查点受体配体的抗体。可以被靶向以阻断或抑制的示例性检查点分子包括但不限于CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、LAG3、TIM3、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族，并在所有NK、γδ和记忆性CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR、以及各种B7家族配体。B7家族配体包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7。检查点抑制剂包括下述的抗体、或其抗原结合片段、其他结合蛋白、生物治疗剂、或小分子，它们结合至CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD 160和CGEN-15049中的一个或多个并阻断或抑制其活性。示例性的免疫检查点抑制剂包括Tremelimumab(CTLA-4阻断抗体)、抗OX40、PD-L1单克隆抗体(抗B7-Hl；MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、Nivolumab(抗PD1抗体)、CT-011(抗PD1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PDL1抗体)、BMS-936559(抗PDL1抗体)、MPLDL3280A(抗PDL1抗体)、MSB0010718C(抗PDL1抗体)和伊匹单抗(ipilimumab)(抗CTLA-4检查点抑制剂)。检查点蛋白配体包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD28、CD86和TIM-3。

在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂和CTLA-4拮抗剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂选自由纳武单抗(nivolumab)伊匹单抗(ipilimumab)和派姆单抗(pembrolizumab)组成的组。在一些实施方案中，检查点抑制剂选自纳武单抗(nivolumab)(抗PD-1抗体，Bristol-Myers Squibb)；派姆单抗(pembrolizumab)(抗PD-1抗体，Merck)；伊匹单抗(ipilimumab)(抗CTLA-4抗体，Bristol-Myers Squibb)；德瓦鲁单抗(durvalumab)(抗PD-L1抗体，AstraZeneca)；和阿特朱单抗(atezolizumab)(抗PD-L1抗体，Genentech)。

在一些实施方案中，检查点抑制剂选自由以下组成的组：lambrolizumab(MK-3475)、纳武单抗(nivolumab)(BMS-936558)、皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、AMP-224、MDX-1105、MEDI4736、MPDL3280A、BMS-936559、伊匹单抗(ipilimumab)、lirlumab、IPH2101、pembrolizumab和tremelimumab。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是REGN2810(Regeneron)，其是一种在患有基底细胞癌(NCT03132636)、NSCLC(NCT03088540)、皮肤鳞状细胞癌(NCT02760498)、淋巴瘤(NCT02651662)、和黑色素瘤(NCT03002376)的患者中测试的抗PD-1抗体(NCT03132636)；皮地利珠单抗(pidilizumab)(CureTech)，也称为CT-011，其是一种在用于弥散性大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的临床试验中的与PD-1结合的抗体；avelumab(Pfizer/Merck KGaA)，也称为MSB0010718C，其是一种在用于非小细胞肺癌、梅克尔细胞癌、间皮瘤、实体瘤、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌和胃癌的临床试验中的完全人IgG1抗PD-L1抗体；或PDR001(Novartis)，其是一种在用于非小细胞肺癌、黑色素瘤、三阴性乳腺癌和晚期或转移性实体瘤的临床试验中与PD-1结合的抑制性抗体。Tremelimumab(CP-675,206；Astrazeneca)是针对CTLA-4的完全人单克隆抗体，其已经在临床试验中针对多种适应症进行了研究，所述适应症包括：间皮瘤、结直肠癌、肾癌、乳腺癌、肺癌和非小细胞肺癌、胰腺导管腺癌、胰腺癌、生殖细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肝脏转移癌、肝癌、大B细胞淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌、转移性间变性甲状腺癌、尿路上皮癌、输卵管癌、多发性骨髓瘤、膀胱癌、软组织肉瘤和黑色素瘤。AGEN-1884(Agenus)是抗CTLA4抗体，其正在针对晚期实体瘤进行第一阶段的临床试验(NCT02694822)。

在一些实施方案中，检查点抑制剂是含T细胞免疫球蛋白粘蛋白的蛋白-3(TIM-3)的抑制剂。可以用于本发明的TIM-3抑制剂包括TSR-022、LY3321367和MBG453。TSR-022(Tesaro)是抗TIM-3抗体，其正在实体瘤中进行研究(NCT02817633)。LY3321367(EliLilly)是抗TIM-3抗体，其正在实体瘤中进行研究(NCT03099109)。MBG453(Novartis)是抗TIM-3抗体，其正在晚期恶性肿瘤中进行研究(NCT02608268)。

在一些实施方案中，检查点抑制剂是具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体的抑制剂、或TIGIT(某些T细胞和NK细胞上的免疫受体)的抑制剂。可以用于本发明的TIGIT抑制剂包括BMS-986207(Bristol-Myers Squibb)，其是一种抗TIGIT单克隆抗体(NCT02913313)；OMP-313M32(Oncomed)；以及抗TIGIT单克隆抗体(NCT03119428)。

在一些实施方案中，检查点抑制剂是淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)的抑制剂。可以用于本发明的LAG-3抑制剂包括BMS-986016和REGN3767和IMP321。BMS-986016(Bristol-Myers Squibb)是一种抗LAG-3抗体，其正在成胶质细胞瘤和神经胶质肉瘤中研究(NCT02658981)。REGN3767(Regeneron)也是一种抗LAG-3抗体，其正在恶性肿瘤中研究(NCT03005782)。IMP321(Immutep S.A.)是一种LAG-3-Ig融合蛋白，其正在黑色素瘤(NCT02676869)、腺癌(NCT02614833)、和转移性乳腺癌(NCT00349934)中研究。

可以用于本发明的检查点抑制剂包括OX40激动剂。临床试验中正在研究的OX40激动剂包括以下：在转移性肾癌(NCT03092856)和晚期癌症和肿瘤(NCT02554812；NCT05082566)中的激动性的抗OX40抗体PF-04518600/PF-8600(Pfizer)；第一阶段癌症试验(NCT02528357)中的激动性的抗OX40抗体GSK3174998(Merck)；晚期实体瘤(NCT02318394和NCT02705482)中的激动性的抗OX40抗体MEDI0562(Medimmune/AstraZeneca)；患有结直肠癌(NCT02559024)、乳腺癌(NCT01862900)、头颈癌(NCT02274155)和转移性前列腺癌(NCT01303705)的患者中的激动性的抗OX40抗体MEDI6469(Medimmune/AstraZeneca)；以及晚期癌症(NCT02737475)中的激动性的抗OX40抗体BMS-986178(Bristol-Myers Squibb)。

可以用于本发明的检查点抑制剂包括CD137(也称为4-1BB)激动剂。临床试验中正在研究的CD137激动剂包括：弥散性大B细胞淋巴瘤(NCT02951156)和晚期癌症和肿瘤(NCT02554812和NCT05082566)中的激动性的抗CD137抗体utomilumab(PF-05082566，Pfizer)；黑色素瘤和皮肤癌(NCT02652455)和成胶质细胞瘤和神经胶质肉瘤(NCT02658981)中的激动性的抗CD137抗体urelumab(BMS-663513，Bristol-MyersSquibb)。

可以用于本发明的检查点抑制剂包括CD27激动剂。在临床试验中正在研究的CD27激动剂包括：鳞状细胞头颈癌、卵巢癌、结直肠癌、肾细胞癌和成胶质细胞瘤(NCT02335918)；淋巴瘤(NCT01460134)；以及胶质瘤和星形细胞瘤(NCT02924038)中的激动性抗CD27抗体varlilumab(CDX-1127，Celldex Therapeutics)。

可以用于本发明的检查点抑制剂包括糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)激动剂。在临床试验中正在研究的GITR激动剂包括：在恶性黑素瘤和其他恶性实体瘤(NCT01239134和NCT02628574)中的激动性抗GITR抗体TRX518(Leap Therapeutics)；在实体瘤和淋巴瘤(NCT 02740270)中的激动性抗GITR抗体GWN323(Novartis)；在晚期癌症(NCT02697591和NCT03126110)中的激动性的抗GITR抗体INCAGN01876(Incyte/Agenus)；在实体瘤(NCT02132754)中的激动性抗GITR抗体MK-4166(Merck)和在晚期实体瘤(NCT02583165)中的具有人IgG1 Fc结构域的激动性六聚GITR-配体分子MEDI1873(Medimmune/AstraZeneca)。

可以用于本发明的检查点抑制剂包括可诱导的T细胞共刺激因子(ICOS，也称为CD278)激动剂。在临床试验中正在研究的ICOS激动剂包括：淋巴瘤(NCT02520791)中的激动性抗ICOS抗体MEDI-570(Medimmune)；处于第1阶段(NCT02723955)的激动性抗ICOS抗体GSK3359609(Merck)；处于第1阶段(NCT02904226)的激动性抗ICOS抗体JTX-2011(JounceTherapeutics)。

可以用于本发明的检查点抑制剂包括杀伤性IgG样受体(KIR)抑制剂。在临床试验中正在研究的KIR抑制剂包括：白血病(NCT01687387、NCT02399917、NCT02481297、NCT02599649)、多发性骨髓瘤(NCT02252263)、和淋巴瘤(NCT01592370)中的抗KIR抗体lirilumab(IPH2102/BMS-986015，Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb)；骨髓瘤(NCT01222286和NCT01217203)中的IPH2101(1-7F9，Innate Pharma)；淋巴瘤(NCT02593045)中的与长胞质尾区(KIR3DL2)的三个结构域结合的抗KIR抗体IPH4102(Innate Pharma)。

可以用于本发明的检查点抑制剂包括CD47和信号调节蛋白α(SIRPa)之间相互作用的CD47抑制剂。在临床试验中正在研究的CD47/SIRPa抑制剂包括：处于第一阶段(NCT03013218)的与CD47结合并阻止CD47/SIRPa介导的信号传导的(SIRPa)的拮抗性变体ALX-148(Alexo Therapeutics)；处于临床试验第一阶段(NCT02890368和NCT02663518)的可溶性重组融合蛋白TTI-621(SIRPa-Fc，Trillium Therapeutics)，其通过将SIRPa的N端CD47结合结构域与人IgG1的Fc结构域连接而产生，通过结合人CD47发挥作用并阻止其向巨噬细胞递送“不要吃”的信号；白血病中(NCT02641002)中的抗CD47抗体CC-90002(Celgene)；以及在结直肠肿瘤和实体瘤(NCT02953782)、急性髓性白血病(NCT02678338)和淋巴瘤(NCT02953509)中的Hu5F9-G4(Forty Seven,Inc.)。在一个优选的实施方案中，检查点抑制剂是CD47抑制剂。

可以用于本发明的检查点抑制剂包括CD73抑制剂。在临床试验中正在研究的CD73抑制剂包括：实体瘤(NCT02503774)中的抗CD73抗体MEDI9447(Medimmune)；和实体瘤(NCT02754141)中的抗CD73抗体BMS-986179(Bristol-Myers Squibb)。

可以用于本发明的检查点抑制剂包括干扰素基因蛋白(STING，也称为跨膜蛋白173或TMEM173)的刺激剂的激动剂。在临床试验中正在研究的STING激动剂包括：淋巴瘤(NCT03010176)中的激动性合成环状二核苷酸MK-1454(Merck)；以及处于第1阶段(NCT02675439和NCT03172936)中的激动性合成环状二核苷酸ADU-S100(MIW815，AduroBiotech/Novartis)。

可以用于本发明的检查点抑制剂包括CSF1R抑制剂。在临床试验中正在研究的CSF1R抑制剂包括：在结直肠癌、胰腺癌、转移性和晚期癌症(NCT02777710)和黑色素瘤、非小细胞肺癌、鳞状细胞头颈癌、胃肠道间质瘤(GIST)和卵巢癌(NCT02452424)中的CSF1R小分子抑制剂pexidartinib(PLX3397，Plexxikon)；以及胰腺腺癌(NCT03153410)、黑色素瘤(NCT03101254)和实体瘤(NCT02718911)中的抗CSF-1R抗体IMC-CS4(LY3022855，Lilly)；以及在晚期实体瘤(NCT02829723)中的口服获得的CSF1R抑制剂BLZ945(4-[2((1R，2R)-2-羟基环己基氨基)-苯并噻唑-6-基氧基]-吡啶-2-羧酸甲基酰胺，Novartis)。

可以用于本发明的检查点抑制剂包括NKG2A受体抑制剂。在临床试验中正在研究的NKG2A受体抑制剂包括：头颈部肿瘤(NCT02643550)和慢性淋巴细胞性白血病(NCT02557516)中的抗NKG2A抗体monalizumab(IPH2201，Innate Pharma)。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)或皮地利珠单抗(pidilizumab)。

在一个优选的实施方案中，抑制T细胞活化的蛋白质的拮抗剂选自抗PD-1和抗CTLA-4。

在一个优选的实施方案中，肿瘤免疫剂是CTLA-4拮抗剂，优选为CTLA-4抗体，更优选为伊匹单抗(ipilimumab)或tremelimumab。

在一个更优选的实施方案中，抑制T细胞活化的蛋白质的拮抗剂是抗PD-1。在一个优选的实施方案中，抗PD-1是抗体或其抗原结合部分，优选的抗体选自由OPDIVO(nivolumab)、KEYTRUDA(pembrolizumab)、MEDI-0680(AMP-514；WO2012/145493)和皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)组成的组。在另一个优选的实施方案中，抗PD-1是重组蛋白，其由PD-L2的胞外结构域(B7-DC)融合至IgG1的Fc部分组成，被称为AMP-224。

在一个实施方案中，本发明的组合是本发明的组合的组分(i)和组分(ii)之间的缀合物，特别是在包含序列SEQ ID No：1的多肽或其功能等效变体与肿瘤免疫剂之间的缀合物。

在一些实施方案中，组分(i)和(ii)之间的缀合是经由不可切割的接头。在一些实施方案中，组分(i)和(ii)之间的缀合是经由可切割的接头。示例性不可切割的接头和可切割的接头描述于US8088387、US8142784、WO2013075048、US6630579、US8512707、US9120854、US9023351、US20160095938、US9446146、WO2005009369、US5773001、US6214345、US10111954、US8153768、US7829531、US20160082119、WO2018218004、US8568728、WO2015057699、US20170182181、US9198979中,其各自的内容通过引用整体并入本文。

在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含药学有效量的本发明的组合以及药学上可接受的赋形剂。

如在本发明中所使用的，表述“药物组合物”涉及一种适于将预定剂量的一种或几种治疗有用的试剂给药于其中细胞分裂不受控制的细胞、细胞群组、器官、组织或动物(例如癌症)的制剂。

本发明的药物组合物包含药学有效量的本发明的组合和药物活性载体。本发明的药物组合物包括包含序列SEQ ID NO：1的多肽、其功能等效变体、根据本发明的缀合物、编码该多肽或缀合物的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体、或能够将多肽或缀合物分泌到培养基中的细胞，以及肿瘤免疫剂。用于本发明的药物组合物中的SEQ ID NO：1的多肽的合适的功能等效变体、合适的缀合物、融合蛋白、多核苷酸、载体或细胞如上文所定义。

如本文所用，表述“药学有效量”应理解为能够提供治疗效果的量，并且其可以由本领域技术人员通过常用手段来确定。可以组合在根据本发明的药物组合物中的Omomyc多肽、其功能等效变体、缀合物、融合蛋白、多核苷酸、载体、细胞或肿瘤免疫剂的量会根据给药受试者和特定的给药模式而变化。本领域技术人员将理解，剂量还可以在Goodman和Goldman的“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第九版(1996)，附录II，第1707-1711页以及Goodman和Goldman的“The Pharmacological Basis of Therapeutics”第十版(2001)，附录II，第475-493页的指导下确定。

药物组合物中一种或多种活性成分的合适剂量将取决于待治疗的癌症类型、疾病的严重程度和进程、该组合物是否出于预防或治疗目的给药、先前的疗法、患者的临床病史和对肽或多肽的反应，以及主治医师的诊断。

包含序列SEQ ID NO：1的多肽、其功能等效变体、融合蛋白、缀合物、多核苷酸、载体或细胞的量适合一次地或通过一系列治疗给药于患者。根据疾病的类型和严重程度，合适的剂量水平通常为约0.01mg/kg患者体重/天至500mg/kg患者体重/天，其可以单剂量或多剂量给药。优选地，剂量水平为约0.1mg/kg/天至约250mg/kg/天、更优选为约0.5mg/kg/天至约100mg/kg/天。

在一个优选的实施方案中，第一组分的量为约3.75mg/kg受试者体重/天，优选每周给药四次，优选经鼻内给药。在一个优选的实施方案中，第一组分的量为约8mg/m²/天至15mg/m²/天，优选为10mg/m²/天至12mg/m²/天，更优选为11.25mg/m²/天，优选每周给药四次，优选经鼻内给药。

在一个优选的实施方案中，第一组分的量为约50mg/kg受试者体重/天，优选每周给药两次，优选地经静脉给药。在一个优选的实施方案中，第一组分的量为约100mg/m²/天至200mg/m²/天，优选为125mg/m²/天至175mg/m²/天，优选为140mg/m²/天至160mg/m²/天，更优选为150mg/m²/天，优选每周给药两次，优选地经静脉注射。

合适的剂量水平可以是约0.01mg/kg/天至250mg/kg/天、约0.05mg/kg/天至100mg/kg/天、或约0.1mg/kg/天至50mg/kg/天。在该范围内，剂量可以是0.05mg/kg/天至0.5mg/kg/天、0.5mg/kg/天至5mg/kg/天、或5mg/kg/天至50mg/kg/天。对于口服给药，优选地以包含1.0至1000毫克活性成分，特别是1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克活性成分的片剂形式提供组合物，用于对待治疗的患者的剂量进行对症调整。化合物可以每天一至四次、优选每天一次或两次的方案给药。

在一个实施方案中，可以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、或每周七次给药所述组合或组合物。在一个实施方案中，组合或组合物可以每周给药一次。在另一个实施方案中，组合或组合物可以每周给药两次。在另一个实施方案中，组合或组合物可以每周给药四次。在另一个优选的实施方案中，组合或组合物的第一组分每周给药四次，并且组合或组合物的第二组分每周给药一次。在另一个实施方案中，组合或组合物的第一组分每周给药两次，并且组合或组合物的第二组分每周给药一次。两种化合物可以同时给药或依序给药。当依序给药化合物时，在开始给药第二化合物之前停止给药第一化合物。

治疗的持续时间可以是至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少九周、至少十周、或更长时间。优选地，治疗的持续时间至少为四周。在另一个实施方案中，治疗的持续时间至少为三周。

肿瘤免疫剂的量取决于所用的具体试剂，并且可以是约0.01mg/kg受试者体重/天至约50mg/kg受试者体重/天，优选为约1mg/kg受试者体重/天至约25mg/kg受试者体重/天，一天一次或多次以获得所需的治疗效果。在一个优选的实施方案中，肿瘤免疫剂的量为约2.5mg/kg受试者体重/天或7.5mg/m²/天，优选每周给药一次，更优选经肠胃外给药，甚至更优选经腹膜内给药。在一个优选的实施方案中，肿瘤免疫剂的量为约5mg/kg受试者体重/天或15mg/m²/天，优选每周给药一次，更优选经肠胃外给药，甚至更优选经腹膜内给药。在另一个优选的实施方案中，肿瘤免疫剂的量为约10mg/kg受试者体重/天，或30mg/m²/天，优选每周给药一次，更优选经肠胃外给药，甚至更优选腹膜内给药。

根据本发明的药物组合物，其包含第一组分(i)，所述第一组分选自根据本发明的包含SEQ ID NO：1的多肽、其功能等效变体、融合蛋白、缀合物、多核苷酸、载体或细胞，以及和作为肿瘤免疫剂的第二组分(ii)，其可以以单一制剂的形式(例如，以包含定量的每种组分的片剂或胶囊剂的形式)，或另一方面可以以单独的制剂形式出现，其后可以组合用于联合、依序或单独给药。本发明的组合物还包括作为套组的一部分的制剂，其中组分被分别配制但包装在同一容器中。本领域技术人员将理解，根据本发明的药物组合物中的不同组分的制剂可以是相似的，换句话说，是类似地配制的(以片剂或丸剂形式)，这允许它们通过相同途径给药。在分别配制本发明的不同组分的情况下，两种组分可以泡罩(blister)形式存在。每个泡罩包含白天必须服用的药物。如果药物必须每天给药数次，则可以将与每次给药相对应的药物放在泡罩的不同部分，优选地在泡罩的每个部分中记录每天应给药的时间。或者，可以不同地配制本发明的组合物的组分，使得不同的组分被不同地给药。因此，有可能将第一组分配制为用于口服给药的片剂或胶囊剂，并且将第二组分配制为用于经静脉给药，反之亦然。技术人员可以根据在每种具体情况下使用的抗肿瘤剂以及期望的适应症来调节作为根据本发明的组合或药物组合物的一部分的组分之间的比例。因此，本发明设想了这样的组合物，其中组分(i)和组分(ii)的量之间的比例可以为50：1至1：50，特别是20：1至1：20、1：10至10：1，或5：1至1：5。在一个更具体的实施方案中，量之间的比例范围为1：1至1：5，优选为1：1至1：3。在更优选的实施方案中，该比例范围为1：1至1：1.5，优选为1：1.3至1：1.4，更优选为1：1.34。在另一个优选的实施方案中，该比例范围为1：1至1：2.8，优选为1：2.6至1：2.7，更优选为1：2.67。在另一个具体实施方案中，量之间的比例为30：1至5：1，优选为30：1至8：1，更优选为25：1至15：1，更优选为20：1至10：1。在一个实施方案中，该比例是20：1。在另一个实施方案中，该比例是10∶1。优选地，这些比例是重量/重量比例。

药物组合物的组分或本发明的组合可以同时给药。“同时给药”包括两种治疗剂的共同给药，而不管各个治疗剂给药的相对频率或时间。因此，同时给药包括两种治疗剂在相同时间和相同给药频率下的共同给药。另外，同时给药是指两种治疗剂的共同给药，其中一种治疗剂比另一种治疗剂更频繁地给药。另外，同时给药是指两种治疗剂的共同给药，其中一种治疗在另一种治疗的给药期间仅给药一次。

在一个实施方案中，组分(i)经鼻内给药，在另一个实施方案中，组分(i)经静脉给药。在另一个实施方案中，组分(ii)经肠胃外给药，特别是经腹膜内给药。

在一个优选的实施方案中，本发明的组合或药物组合物的组分(i)经鼻内给药，而肿瘤免疫剂经肠胃外给药，特别是经腹膜内或静脉给药。对于鼻内给药本发明的组合或组合物的组分(i)的优选剂量，优选多肽或其功能等效变体、融合蛋白、或缀合物的优选剂量范围为0.01mg/kg/天至250mg/kg/天(其可以以单剂量或多剂量给药)，更优选为0.1mg/kg/天至约100mg/kg/天。用于经腹膜内给药的肿瘤免疫剂的优选剂量为0.01mg/kg至150mg/kg，更优选为0.1mg/kg至100mg/kg。

在另一个实施方案中，本发明的组合或药物组合物的组分(i)是经静脉给药的，而肿瘤免疫剂是经肠胃外给药的，特别是经腹膜内或静脉给药。

本发明的药物组合物还可以包含一种或几种另外的化合物，用于预防和/或治疗其中细胞分裂不受控制的病状，例如癌症。所述另外的化合物，例如抗肿瘤剂可以作为独立实体形成药物组合物的一部分。在一个优选的实施方案中，本发明的组合或药物组合物包含一种或多种抗肿瘤剂，其选自由细胞毒性剂、抗血管生成剂、抗转移剂和抗增殖剂组成的组。

本发明的药物组合物还包含一种或几种另外的药学上可接受的赋形剂。“药学上可接受的赋形剂”应理解为表示用于并入活性成分的疗效上无活性的物质，并且从药理学/毒理学的角度来看对于患者是可接受的，以及从物理/化学的角度来看在组成、制剂、稳定性、患者接受程度和生物利用度方面对于制造它的药物化学家来说是可接受的。赋形剂可以是载体。如本文所用，“载体”是指用于改善药物组合物中活性成分的递送和有效性的任何物质。在一个优选的实施方案中，载体不能够将组分(i)和/或(ii)直接递送至细胞的细胞质，即载体不能与靶细胞的质膜融合。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，在组合或组合物中优选地包含等张剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。药学上可接受的载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其延长了形成本发明的组合或组合物一部分的组分的货架期或有效性。合适的载体的实例在文献中是众所周知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版，Mack PublishingCompany，Easton，PA，1995)。载体的实例不受限制地为一系列糖，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇和麦芽糖醇；一系列淀粉，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉；一系列纤维素，例如纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素；以及一系列填充剂，例如明胶和聚乙烯吡咯烷酮。在一些情况下，可以添加崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或藻酸钠。

药物上可接受的赋形剂的数量和性质取决于期望的剂型。药物上可接受的赋形剂是本领域技术人员已知的(Faulíy Trillo C.(1993)“Tratado de Farmacia Galénica”,Luzán 5,S.A.Ediciones,Madrid)。所述组合物可以通过现有技术已知的传统方法制备(“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”,20th edition(2003)GenaroA.R.,ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,US)。

对于包含作为核酸分子的试剂的药物组合物，核酸分子可以存在于本领域普通技术人员已知的多种递送系统中的任何一种中，包括核酸、细菌、病毒、和哺乳动物表达系统，如本文提供的重组表达构建体。将DNA并入这种表达系统的技术是本领域普通技术人员众所周知的。所述DNA也可以是“裸的”，例如在Ulmer等人，Science 259：1745-49，1993中所述，和由Cohen，Science 259：1691-1692，1993所综述。通过将DNA包被到被有效地转运到细胞中的生物可降解的珠上来增加裸DNA的摄取。

核酸分子可以根据本领域中所述的几种方法中的任何一种被递送到细胞中(参见例如Akhtar等人，Trends Cell Bio.2:139(1992)；Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotide Therapeutics,ed.Akhtar,1995,Maurer等人，Mol.Membr.Biol.16:129-40(1999)；Hofland和Huang,Handb.Exp.Pharmacol.137:165-92(1999)；Lee等人，ACSSymp.Ser.752:184-92(2000)；美国专利No.6,395,713；国际专利申请公开No.WO94/02595)；Selbo等人，Int.J.Cancer 87:853-59(2000)；Selbo等人，Tumour Biol.23:103-12(2002)；美国专利申请公开No.2001/0007666,以及No.2003/077829)。本领域技术人员已知的此类递送方法包括但不限于：包封在脂质体内、通过离子电渗疗法、或通过并入其他载体例如生物可降解的聚合物、水凝胶、环糊精(参见，例如Gonzalez等人，Bioconjug.Chem.10:1068-74(1999)；Wang等人，国际专利公布No.WO03/47518和No.WO03/46185)；聚(乳酸-共-乙醇酸)酸(PLGA)和PLCA微球(也可用于递送肽和多肽以及其他物质)(参见，例如，美国专利No.6,447,796；美国专利申请公布No.2002/130430)；生物可降解的纳米胶囊；和生物粘附微球、或通过蛋白质载体(国际申请公布No.WO00/53722)。在另一个实施方案中，核酸分子也可以与聚乙烯亚胺及其衍生物(例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物)配制或复合(也参见例如美国专利申请公开No.2003/0077829)。

在一个具体的实施方案中，当根据本发明的化合物包含核酸时，可以将药物组合物配制成旨在用于基因疗法的组合物；示例性而非限制地，药物组合物可以包含病毒或非病毒载体，其包含合适的多核苷酸或基因构建体。示例性而非限制地，所述载体可以是病毒的(例如基于逆转录病毒、腺病毒等)，或非病毒的(例如ADN-脂质体、ADN-聚合物、ADN-聚合物-脂质体复合物等)[参见“Nonviral Vectors for Gene Therapy”,由Huang,Hung和Wagner编辑,Academic Press(1999)]。所述载体含有相应的多核苷酸或基因构建体，可以通过常规方法直接给药到受试者。或者，所述载体可以用于离体转化、或转染、或感染细胞，例如哺乳动物细胞，包括人，随后将其植入人体或动物中以获得期望的治疗效果。为了向人体或动物给药，将所述细胞配制成对细胞活性没有不利影响的合适培养基。

本发明的组合或药物组合物可以通过任何类型的合适途径给药，例如通过口服途径、局部途径、通过吸入、或肠胃外途径，从而配制期望剂型所需的药学上可接受的赋形剂将被包括。其他给药途径可以是经直肠、经脑池内、或经阴道内。所述组合或药物组合物的优选给药途径是静脉途径。

“口服途径”应理解为药物组合物在吞咽后并入生物体中。在一个具体的实施方案中，本发明的药物组合物可以是适合通过口服途径给药的剂型，无论是固体还是液体。适于通过口服途径给药的剂型可以是片剂、胶囊剂、糖浆剂或溶液，并且可以包含本领域已知的任何常规赋形剂，例如粘结剂，例如糖浆剂、阿拉伯胶、明胶、山梨醇或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；压制的润滑剂，例如硬脂酸镁；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉的乙醇酸钠或微晶纤维素；或药学上可接受的润湿剂，例如十二烷基硫酸钠。固体的口服组合物可以通过常规的混合、填充或压制方法制备。重复的混合操作可以用于将活性剂完全分散在使用大量填充剂的那些组合物中。所述操作是本领域常规的。可以例如通过湿法或干法制粒来制备片剂，并任选地根据常规药学实践中已知的方法将其包衣，特别是用肠溶衣。

另一方面，“局部途径”应理解为通过非全身途径给药，并且包括将本发明的药物组合物施用于表皮的外部、口腔中，以及将所述组合物滴入耳朵、眼睛和鼻子中，并且不会显著地进入血液。用于本发明的化合物的局部或透皮给药的剂型包括软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。

眼科制剂、滴耳剂和滴眼剂也被认为在本发明的范围内。另外，本发明考虑了透皮贴剂的使用，透皮贴剂具有提供化合物向身体的可控递送的附加优点。这种剂型可以通过将化合物溶解或分散在适当的介质中来制备。吸收促进剂也可用于增加化合物穿过皮肤的流量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。

在一个实施方案中，所述组合或药物组合物经全身给药。

“全身给药”理解为通过口服途径、静脉途径、腹膜内途径和肌内途径给药。治疗或预防作用所需的组分(i)和(ii)的量自然会根据所选化合物、待治疗的疾病的性质和严重性、以及患者而变化。

在另一个实施方案中，所述组合或药物组合物经鼻内给药。在一个优选的实施方案中，鼻内给药通过滴注或鼻吸入进行。

“吸入”应理解为通过鼻内途径和口服吸入给药。可以通过常规技术制备适用于所述给药的剂型，例如气雾剂或计量吸入器中的制剂。在一个实施方案中，给药途径是鼻内途径。

如本文所用，术语“肠胃外”包括通过静脉途径、腹膜内途径、肌内途径、或皮下途径给药。肠胃外给药的皮下、肌内和静脉剂型通常是优选的。

在一个实施方案中，本发明的组合或药物组合物可以适合于其肠胃外给药，例如合适剂量单位形式的无菌溶液、混悬液或冻干产品。适合于其可注射使用的组合或药物组合物包括无菌水溶液(当它们溶于水中)、或分散体、以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌散剂。对于其通过静脉途径给药，一些合适的载体包括用磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS)。在所有情况下，组合或组合物必须是无菌的，并且必须是流体，以到达易于注射的点。它必须在制备和储存条件下稳定，并且必须受到保护以免受诸如细菌和真菌等微生物的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、药学上可接受的多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂、通过保持分散情况下所需的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，在组合物中优选地包含等张剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

注射用无菌溶液可以根据需要通过将所需量的活性化合物与上述成分中的一种或组合一起并入合适的溶剂中，然后通过无菌膜过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物并入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体包含基础分散介质和来自先前列出的那些所需的其余成分。在用于制备注射用无菌溶液的无菌散剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冻干，这产生了来自先前过滤的无菌溶液的具有活性成分加上任何所需的附加成分的散剂。

本发明的组合或药物组合物可以适当地通过脉冲输注来给药，使用例如递减剂量的组合物。优选地，剂量是通过注射，更优选地是通过静脉注射或皮下注射来给药的，部分地取决于给药是急性还是慢性。在一个优选的实施方案中，PD-1拮抗剂通过输注给药。

或者，如上所述，组合物的不同组分被不同地给药。

因此，在一个实施方案，本发明的组合或组合物的组分(i)，优选为多肽或功能等效变体或缀合物，经鼻内给药，而肿瘤免疫剂经全身给药。

在另一个优选的实施方案中，组合或组合物的组分(i)，优选多肽或其功能等效变体，或组合物的缀合物，经鼻内给药或通过吸入给药。

用于鼻内给药和肺内给药的组合物的剂型优选为液体、混悬液或固体。混悬液是含有分散在液体载剂中的固体颗粒的液体制剂。剂型优选是计量的。例如，计量的滴剂/喷雾剂是指包括滴剂/喷雾剂的分配器递送包含计量的剂量(预定量)的根据本发明的用途的组合物的滴剂/喷雾剂。

在鼻内给药途径的背景下，一种优选的剂型包括滴鼻剂。滴剂大部分沉积在鼻子的后部，因此迅速移入鼻咽部。关于滴剂的问题通常是如何精确地控制药物的剂量，这对于组合物的给药特别重要。

可以给药本发明的药物组合物的另一种鼻内剂型是鼻喷雾剂。鼻喷雾剂通常在不加压的分配器中包含溶解或悬浮在溶液中或赋形剂(例如防腐剂、粘度调节剂、乳化剂、缓冲剂)的混合物中的缀合物。鼻喷雾剂具有数个优点，包括递送设备的简洁性、便利性、使用的简便性、以及25pL至200pL的输送剂量的准确性。它们沉积在鼻子的前部，并通过粘膜纤毛清除而缓慢进入鼻咽部。本文所用的鼻喷雾剂可以是液体或混悬液。

另一种鼻内剂型是鼻气雾剂。鼻气雾剂与鼻喷雾剂的组合物分配方法不同：在气雾剂中，由于压力过量而分配化合物，并通过阀门释放。在喷雾剂中，化合物由微型泵桶推动而被分配，而小瓶中的压力类似于大气压。气雾剂具有与喷雾剂相似的优点。

替代地，根据本发明的组合物可以优选地通过鼻乳剂、软膏剂、凝胶剂、糊剂或霜剂给药。这些是应用于鼻粘膜的高粘度溶液或混悬液。

由于可以有效递送至鼻粘膜的组合物的体积有限，液体鼻内剂型如相应的静脉剂型通常具有较高的浓度。当物质变得难溶或以液体形式不稳定时，可以使用散剂来给药本发明的组合物。散剂的其他优点是它们不需要防腐剂，并且与液体制剂相比通常具有更高的稳定性。鼻内散剂的主要局限性在于其对鼻粘膜的刺激作用。

在肺内给药的上下文中的一种剂型是吸入气雾剂。吸入气雾剂通常在压力下包装，并且包含根据本发明的组合物，该组合物在阀系统被启动时被释放进入呼吸道，特别是肺。释放的气溶胶是空气或其他气体中的细小固体颗粒(混悬液)或液滴(溶液)的胶状体。因此，气雾剂可以是溶液或混悬气雾剂。液滴或固体颗粒的直径优选地小于100pm、更优选小于10pm、最优选小于1pm。

肺内给药的另一种剂型是吸入喷雾剂。吸入喷雾剂通常是水基的，并且不含任何推进剂。通过口服吸入来将缀合物递送至肺部。

雾化吸入溶液和混悬液也可以用于通过肺内途径递送缀合物。雾化吸入溶液和混悬液通常是含有根据本发明的组合物的水基制剂。雾化吸入溶液和混悬液通过口服吸入将所述组合物递送到肺部，以产生全身效果，并与雾化器一起使用。

干粉吸入是气雾剂吸入的替代。组合物通常包括在用于手动装载的胶囊中或吸入器中。干粉通常通过吸入器经口服吸入递送至肺部。这里使用的干粉可以未搀水(neat)配制的。未搀水的制剂中仅包含药物或几乎仅包含药物，如作为喷雾(spry)的干粉。本文所用的干粉还可以与载体例如乳糖一起配制。

肺内剂型优选是计量的，即以预定量递送至肺部。

在本发明的上下文中，用于鼻内递送的装置包括喷雾泵系统、用于递送滴剂的吸液管、定量喷雾泵，鼻加压定量吸入器、喷粉系统、呼吸致动的粉末吸入器和鼻粉吹入器。鼻内递送装置可以填充有单一剂量或多剂量的鼻内制剂。

使用肺内途径，可以用定量吸入器给药缀合物。定量吸入器(MDI)可以提供缀合物的细雾，其空气动力学粒径通常小于5pm。

干粉吸入器可以替代地用于将组合物递送至肺内。干粉吸入器将散剂制成单剂量或多剂量散剂。

用于肺内递送的另一装置是包括超声的雾化器和喷气雾化器。在超声雾化器中，超声波是在超声波雾化器室中通过在电激发时振动的陶瓷压晶体管形成的。这会在溶液表面生成气雾剂云。当压缩空气被迫通过孔口时，会产生由喷气雾化器产生的气雾剂。液体可以从垂直喷嘴中抽出(伯努利效应)以与使用挡板雾化的空气喷射流混合，以促进气雾剂云的形成。

在一个实施方案中，本发明的组合或药物组合物的每种组分均与载体一起制备，所述载体会保护组分，特别是组分(i)，免于从体内快速清除(例如控释制剂)，包括植入物和微胶囊化的给药系统。可以使用生物可降解的生物兼容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备所述制剂的方法对本领域技术人员而言是清楚的。该材料也可以在Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商业获得。

持续释放组合物还包括悬浮在合适制剂中的晶体的制备，所述合适制剂可以使晶体保持悬浮。当通过皮下或腹膜内途径注射这些制剂时，可以产生持续释放作用。其他组合物还包括捕获在脂质体中的组分(i)和/或(ii)。含有此类组分的脂质体是通过已知方法制备的，例如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1985)82:3688-3692；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1980)77:4030-4034；EP 52,322；EP36,676；EP 88,046；EP143,949。在一个优选的实施方案中，组分(i)和/或(ii)包含在脂质体内，优选两种组分都包含在脂质体内，更优选在同一脂质体内。

尽管事实上本发明的Omomyc、其功能等效变体、缀合物和融合蛋白能够跨生物膜易位，但将Omomyc、其功能等效变体、缀合物、多核苷酸、载体或细胞中的任何一种配制在纳米颗粒中是可能的。纳米颗粒可以有助于保持生物流体中组分的完整性，直到其到达靶器官为止。此外，在包含组分(ii)或其他抗肿瘤剂的组合物的情况下，组合物的包封可以减少由抗肿瘤剂引起的次级反应。另外，纳米颗粒也可以被修饰以便包括允许纳米颗粒能够靶向感兴趣器官的部分。以此方式，本发明的组合或组合物的组分(i)将在靶器官附近递送，从而促进组分(i)进入需要其生物活性的细胞内部。

因此，在另一个实施方案中，提供本发明的组合或组合物的组分(i)形成纳米颗粒的一部分。在另一个实施方案中，提供本发明的组合或组合物的两个组分形成纳米颗粒的一部分，优选将两个组分提供在同一纳米颗粒内部。

如本文所用，术语“纳米颗粒”是指尺寸范围为1nm至1000nm的任何材料。在一些实施方案中，纳米颗粒的尺寸范围为2nm至200nm，优选范围为2nm至150nm，甚至更优选范围为2nm至100nm。可以用于本发明的纳米颗粒包括以下纳米颗粒：诸如脂质基的纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、纳米壳、半导体纳米晶体、量子点、聚合物基的纳米颗粒、硅基的纳米颗粒、二氧化硅基的纳米颗粒、金属基纳米颗粒、富勒烯和纳米管。分子可以包埋在纳米颗粒基质中，或可以吸附在其表面上，优选分子包埋在纳米颗粒中。

在一个优选的实施方案中，纳米颗粒是脂质体。

靶向递送可以通过添加配体来实现，而不会损害纳米颗粒递送其内容物的能力。预期这将使得其能够递送至特定的细胞、组织和器官。基于配体的递送系统的靶向特异性基于配体受体在不同细胞类型上的分布。靶向配体可以与纳米颗粒非共价或共价结合，并且可以通过本文讨论的多种方法与纳米颗粒缀合。

可以用于靶向纳米颗粒的蛋白质或肽的实例包括转铁蛋白、乳铁蛋白、TGF-β、神经生长因子、白蛋白、HIV Tat肽、RGD肽、和胰岛素，以及其他。

将理解的是，纳米颗粒中的本发明制剂不旨在或不仅仅地旨在促进组分(i)和/或(ii)进入细胞内部，而且为了保护组分(i)和/或(ii)避免降解和/或用于促进纳米颗粒靶向目标器官。

在一个实例中，纳米颗粒可以由生物可降解的聚合物例如聚(氰基丙烯酸丁酯)(PBCA)制成。元素纳米颗粒的实例包括碳纳米颗粒和氧化铁纳米颗粒，其然后可以用油酸(OA)-普朗尼克(R)包被。在这种方法中，将药物(例如，疏水性或不溶于水的药物)载入到纳米颗粒中。其他纳米颗粒由二氧化硅制成。

纳米颗粒可以由任何有用的聚合物形成。聚合物的实例包括：生物可降解的聚合物，例如，聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚-s-己内酯、聚(丁丁二酸丁二醇酯)、聚(己二酸丁二醇酯)和聚(对二氧环己酮)；聚(乙二醇)；聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯(聚(HEMA))；共聚物，例如，聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯)-聚(乙二醇)、聚(聚(乙二醇)氰基丙烯酸酯-共十六烷基氰基丙烯酸酯)、和聚[HEMA-共-甲基丙烯酸]；蛋白质，例如，纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶和弹性蛋白；以及多糖，如支链淀粉、直链淀粉和壳聚糖。

其他纳米颗粒包括固体脂质纳米颗粒(SLN)。用于固体脂质纳米颗粒的脂质分子的实例包括硬脂酸和改性的硬脂酸，例如硬脂酸-PEG 2000；大豆卵磷脂；以及乳化蜡。固体脂质纳米颗粒可以任选地包含其他组分，包括表面活性剂，例如Epicuron(R)200、poloxamer 188(Pluronic(R)F68)、Brij 72、Brij 78、聚山梨酯80(Tween 80)；和盐，例如牛磺胆酸钠。可以通过针对脂质体讨论的许多方法将试剂引入到固体脂质纳米颗粒中，其中这些方法还可以包括高压均质化和微乳液的分散。

纳米颗粒还可以包括纳米尺寸的微胶粒。微胶粒可以由本文所述的任何聚合物形成。用于形成微胶粒的示例性聚合物包括嵌段共聚物，例如聚(乙二醇)和聚(ε-己内酯)。(例如，包括ε-己内酯和α-甲氧基-ω-羟基-聚(乙二醇)的PEO-b-PCL嵌段共聚物)。

在某些实施方案中，纳米颗粒的性质通过用表面活性剂包被而改变。可以使用任何生物兼容性表面活性剂，例如，聚山梨酯表面活性剂，例如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80(Tween 80)；Epicuron(R)200；泊洛沙姆(poloxamer)表面活性剂，例如188(Pluronic(R)F68)泊洛沙姆poloxamer 908和1508；和Brij表面活性剂，例如Brij 72和Brij 78。

纳米颗粒可以任选地被改性为包括亲水性聚合物基团(例如，聚(乙二醇)或聚(丙二醇))，例如，通过将亲水性聚合物基团共价附接于表面，或通过使用包含这种亲水性聚合物基团的聚合物(例如，聚[甲氧基聚(乙二醇)氰基丙烯酸酯-共-十六烷基氰基丙烯酸酯])。纳米颗粒可以任选地交联，这对于蛋白质基的纳米颗粒可以特别有用。

在另一个实施方案中，本发明的药物组合物是纳米乳剂。如本文所用，“纳米乳剂”是指液滴(或颗粒)的胶态分散体，其至少一些液滴的直径为纳米尺寸范围。纳米乳剂由水相中富含omega-3、omega-6或omega-9脂肪酸的油组成，并通过两亲性表面活性剂进行热力学稳定化，该两亲性表面活性剂构成介面膜，使用高剪切微流化工艺生产，通常液滴的直径范围为约80nm至220nm。

本发明的治疗用途

在一个方面，本发明涉及本发明的组合或药物组合物，其用于药物。

在另一个方面，本发明涉及本发明的组合或药物组合物，其用于预防和/或治疗癌症。

在另一个方面，本发明涉及用于制备预防和/或治疗癌症的药物的本发明的组合或药物组合物。

在另一方面，本发明还涉及预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者给药治疗有效量的本发明的组合或药物组合物。

在另一方面，本发明还涉及通过将T细胞募集到肿瘤部位来预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的本发明的组合或药物组合物。在一个实施方案中，募集到肿瘤部位的T细胞是活化的CD4 T细胞，更具体是CD4⁺PD-1⁺ T细胞，甚至更具体的是CD4⁺PD-1⁺Tim-3^- T细胞。在另一个实施方案中，募集到肿瘤部位的T细胞是CD4⁺PD-1+Tim-3⁺ T细胞。在另一个实施方案中，募集到肿瘤部位的T细胞是CD8 T细胞，更具体是CD8⁺PD-1⁺ T细胞。在另一个实施方案中，募集到肿瘤部位的T细胞是CD3⁺ T细胞。在另一个实施方案中，募集到肿瘤部位的T细胞是CD3⁺ CD4⁺ T细胞。在另一个实施方案中，募集到肿瘤部位的T细胞是Th1/Th17细胞，具体是Th1/Th17 PD-1⁺细胞，更具体是CD4⁺IFN⁺IL-17⁺ T细胞，甚至更具体是CD4⁺ PD-1⁺ IFN⁺ IL-17⁺ T细胞。在另一个实施方案中，募集到肿瘤部位的细胞是CD45⁺细胞。

在另一方面，本发明还涉及通过诱导T调节性细胞的扩增来预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的本发明的组合或药物组合物。

在另一方面，本发明还涉及通过肿瘤内CD4+和CD8+细胞诱导IFN-γ产生来预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的受试者给药治疗有效量的本发明的组合或药物组合物。

在优选的实施方案中，根据本发明的预防或治疗方法涉及直接使用包括包含Omomyc的多肽、其功能等效变体、缀合物、或融合蛋白的组合或组合物。因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的预防或治疗方法不涉及给药编码包含Omomyc的多肽、其功能等效变体、或融合蛋白的核酸，也不涉及给药编码所述核酸的载体或包含所述核酸的细胞。

“预防”应理解为在疾病的初期或早期给药本发明的组合或组合物，或也预防其发作。

术语“治疗”用于表示在临床症状出现之前或之后给药本发明的组合或组合物以控制疾病的进展。疾病进展的控制被理解为有益或预望的临床结果，包括但不限于症状的减轻、疾病持续时间的减少、病理病况的稳定(特别是避免额外的损害)、推迟疾病的进展、改善病理病况和缓解(部分和完全)。与不应用该治疗的预期生存相比，控制疾病进展还涉及生存期的延长。在一个优选的实施方案中，以健康的肺/胸体积比来测量疾病进展的控制。在另一个实施方案中，疾病进展的控制被测量为肿瘤体积的减少。

术语“癌症”是指由以下特征的疾病：不受控制的细胞分裂(或以增加的存活或凋亡抗性)、所述细胞侵入其他邻近组织(侵袭)或扩散至其中细胞通常不通过淋巴管和血管定位(转移)的人体的其他区域的能力。根据肿瘤是否可以通过侵袭和转移而扩散，将其分类为良性或恶性：良性肿瘤是不能通过侵袭或转移而扩散的肿瘤，即它们仅在局部生长；而恶性肿瘤是能够通过侵袭和转移扩散的肿瘤。根据本发明的方法可用于治疗局部和恶性肿瘤。

在一个实施方案中，癌症包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、毛细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏(Hodgkin)病或非霍奇金氏病)、AIDS相关的白血病、在华氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、重链疾病、以及实体瘤例如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤(mendotheliosarcoma)、淋巴管肉瘤、淋巴管内内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏(Ewing)瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、卡波西(Kaposi)肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、胆道癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、包括鳞状细胞癌的口腔癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、畸胎瘤、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威姆氏(Wilm)肿瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、包括鲍恩氏(Bowen)病和佩吉特氏(Paget)病在内的上皮内瘤、神经胶质瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤(GBM，也称为恶性胶质瘤)、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症是胶质瘤、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤(GBM，也称为恶性胶质瘤)、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

在某些实施方案中，癌症是听神经瘤、星形细胞瘤(例如，I级–毛细胞型星形细胞瘤、II级–低级星形细胞瘤、III级–间变型星形细胞瘤、或IV级–成胶质细胞瘤(GBM))、脊索瘤、CNS淋巴瘤、颅咽管瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、混合性胶质瘤、视神经胶质瘤、室管膜下瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、转移性脑瘤、少突胶质细胞瘤、垂体瘤、原始神经外胚层(PNET)瘤、或神经鞘瘤。在一些实施方案中，癌症是在儿童中比成人更常见的类型，例如脑干胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、青少年毛细胞型星形细胞瘤(JPA)、成神经管细胞瘤、视神经胶质瘤、松果体瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、或横纹肌样瘤。在一些实施方案中，患者是成年人。在一些实施方案中，患者是儿童或儿科患者。

在另一个实施方案中，癌症包括但不限于间皮瘤、肝胆癌(肝胆管)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、胃肠道癌(胃部、结肠直肠、和十二指肠)、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌、慢性或急性白血病、慢性粒细胞白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、非霍奇金氏淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、胆囊癌、多发性骨髓瘤、胆管癌、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、或上述一种或多种癌症的组合。

在一些实施方案中，所述癌症选自：肝细胞癌、卵巢癌、卵巢上皮癌或输卵管癌；乳头状浆液性囊腺癌或子宫乳头状浆液性癌(UPSC)；前列腺癌；睾丸癌；胆囊癌；肝胆管癌(hepatocholangiocarcinoma)；软组织和骨滑膜肉瘤；横纹肌肉瘤；骨肉瘤；软骨肉瘤；尤文氏(Ewing)肉瘤；间变型甲状腺癌；肾上腺皮质腺瘤；胰腺癌；胰腺导管癌或胰腺腺癌；胃肠道/胃癌(GIST)；淋巴瘤；头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)；唾液腺癌；胶质瘤或脑癌；神经纤维瘤-1相关的恶性外周神经鞘膜瘤(MPNST)；在华氏巨球蛋白血症；或成神经管细胞瘤。

在一些实施方案中，所述癌症选自：肝细胞癌(HCC)、肝母细胞瘤、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、输卵管癌、乳头状浆液性囊腺癌、子宫乳头状浆液性癌(UPSC)、肝胆管癌、软组织和骨滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、间变型甲状腺癌、肾上腺皮质腺瘤、胰腺癌、胰腺导管癌、胰腺腺癌、胶质瘤、神经纤维瘤-1相关的恶性外周神经鞘膜瘤(MPNST)、在华氏巨球蛋白血症、或成神经管细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症是实体瘤，例如肉瘤、癌或淋巴瘤。实体瘤通常包括异常的组织块，通常不包括囊肿或液体区域。在一些实施方案中，所述癌症选自：肾细胞癌或肾癌；肝细胞癌(HCC)、或肝母细胞瘤、或肝癌；黑色素瘤；乳腺癌；大肠癌、或结直肠癌；结肠癌；直肠癌；肛门癌；肺癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌(SCLC)；卵巢癌、卵巢上皮癌或输卵管癌；乳头状浆液性囊腺癌或子宫乳头状浆液性癌(UPSC)；前列腺癌；睾丸癌；胆囊癌；肝胆管癌(hepatocholangiocarcinoma)；软组织和骨滑膜肉瘤；横纹肌肉瘤；骨肉瘤；软骨肉瘤；尤文氏肉瘤；间变型甲状腺癌；肾上腺皮质瘤；胰腺癌；胰腺导管癌或胰腺腺癌；胃肠道/胃癌(GIST)；淋巴瘤；头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)；唾液腺癌；胶质瘤或脑癌；神经纤维瘤-1相关的恶性外周神经鞘膜瘤(MPNST)；在华氏巨球蛋白血症；或成神经管细胞瘤。

在一些实施方案中，所述癌症选自：肝细胞癌(HCC)、肝母细胞瘤、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢肿瘤、输卵管癌、乳头状浆液性囊腺癌、子宫乳头状浆液性癌(UPSC)、肝胆管癌、软组织和骨滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、间变型甲状腺癌、肾上腺皮质瘤、胰腺癌、胰腺导管癌、胰腺腺癌、胶质瘤、神经纤维瘤-1相关的恶性外周神经鞘膜瘤(MPNST)、在华氏巨球蛋白血症、或成神经管细胞瘤。

在一些实施方案中，所述癌症是肝细胞癌(HCC)。在一些实施方案中，所述癌症是肝母细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是结肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是直肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌，或卵巢肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢上皮癌。在一些实施方案中，所述癌症是输卵管癌。在一些实施方案中，所述癌症是乳头状浆液性囊腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是子宫乳头状浆液性癌(UPSC)。在一些实施方案中，所述癌症是胆管肝癌。在一些实施方案中，所述癌症是软组织和骨滑膜肉瘤。在一些实施方案中，所述癌症是横纹肌肉瘤。在一些实施方案中，所述癌症是骨肉瘤。在一些实施方案中，所述癌症是间变型甲状腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是肾上腺皮质癌。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌，或胰腺导管癌。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是胶质瘤。在一些实施方案中，所述癌症是恶性外周神经鞘膜瘤(MPNST)。在一些实施方案中，所述癌症是神经纤维瘤-1相关的MPNST。在一些实施方案中，所述癌症是在华氏巨球蛋白血症。在一些实施方案中，所述癌症是成神经管细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症是与病毒相关的癌症，包括人体免疫缺损病毒相关的实体瘤，人乳头瘤病毒(HPV)-16阳性不可治愈实体瘤，以及成人T细胞白血病，其是由人T细胞白血病病毒I型(HTLV-1)引起的，并且是CD4⁺ T细胞白血病的一种高度侵袭性形式，其特征在于HTLV-1在白血病细胞中的克隆整合(请参见https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT02631746)；以及胃癌、鼻咽癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、头颈部鳞状细胞癌、以及梅克尔细胞癌的病毒相关肿瘤。(参见https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT02488759；也参见https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT0240886；https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02426892)。

其他癌症是本领域普通技术人员已知的。

在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。

在另一个实施方案中，癌症是成胶质细胞瘤。

“成胶质细胞瘤”，也称为胶质母细胞瘤和IV级星形细胞瘤，是最常见和最具侵袭性的癌症，始于脑内。

在一个优选的实施方案中，所述癌症是肺癌。

术语“肺癌”或“肺肿瘤”是指哺乳动物中以肺组织中的细胞生长不受调节为特征的生理病况。术语肺癌是指肺部的任何癌症，包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌。在一个实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施方案中，肺癌是小细胞肺癌(SCLC)。

如本文所用，术语非小细胞肺癌(NSCLC)是指一组异质性疾病，因为它们的预后和管理方法大致相同，并且根据世界卫生组织(World Health Organization)/国际肺癌研究协会(International Association for the Study of Lung Cancer)的组织学分类(Travis WD等人，Histological typing of lung and pleural tumours，第三版，Berlin:Springer-Verlag,1999)包括：

(i)鳞状细胞癌(SCC)，占NSCLC的30％至40％，始于较大的呼吸管，但生长缓慢，这意味着这些肿瘤的尺寸在诊断时会有所不同。

(ii)腺癌是NSCLC最常见的亚型，占NSCLC的50％至60％，其始于肺的气体交换表面附近，并且其包括亚型支气管肺泡癌，其对治疗的反应可能不同。

(iii)大细胞癌是一种在肺表面附近生长的快速生长形式。它主要是排除性诊断，当进行更多研究时，通常将其重新分类为鳞状细胞癌或腺癌。

(iv)腺鳞癌是一种包含两种类型细胞的癌症：鳞状细胞(排列在某些器官内的细扁平细胞)和腺体样细胞。

(v)具有多形性、肉瘤性或肉瘤性成分的癌。这是一组罕见的肿瘤，反映了组织学异质性以及上皮和间充质分化的连续性。

(vi)类癌肿瘤是一种生长缓慢的神经内分泌性肺肿瘤，始于能够响应于由神经系统提供的刺激而释放激素的细胞。

(vii)唾液腺型癌始于位于肺大气道内的唾液腺细胞中。

(viii)未分类的癌症包括不属于上述任何肺癌类别的癌症。

在一个具体实施方案中，NSCLC选自肺部鳞状细胞癌、肺部大细胞癌和肺部腺癌。

如本文所用，术语小细胞肺癌(SCLC)是指具有独特且严格的形态学特征的小细胞的增殖，包含致密的神经分泌颗粒，其使得该肿瘤伴有内分泌/附肿瘤综合征。大多数病例发生在较大的气道(主支气管和次支气管)中。这些癌症生长迅速，并在疾病的早期扩散。

在一个甚至更优选的实施方案中，肺癌是腺癌，更优选是KRas驱动的肺腺癌，优选与KRAS基因突变相关的癌症。在一个实施方案中，KRAS基因中的突变是在位置12处的甘氨酸、在位置13处的甘氨酸或在位置61处的谷氨酰胺处的突变。在一个更优选的实施方案中，所述突变选自由G12S突变、G12V突变、G12D突变、G13D突变、G12C突变、G12R突变、G12F突变、G12I突变、G13C突变、G13R突变或Q61L突变组成的组。在一个优选的实施方案中，所述突变是G12D突变。在另一个实施方案中，肺癌是KRas^GD12/p53驱动的肺癌，优选是KRas^GD12/p53驱动的NSCLC。

在一个实施方案中，癌症是原发性肿瘤。如本文所用，术语“原发性肿瘤”是指起源于其存在的位置或器官并且没有从另一位置转移到该位置的肿瘤。

在另一个实施方案中，所述癌症是癌症转移。在本发明的上下文中，“转移”被理解为癌症从其开始的器官向不同器官的增殖。它通常通过血液或淋巴系统发生。当癌细胞扩散并形成新的肿瘤时，后者被称为继发性或转移性肿瘤。形成继发性肿瘤的癌细胞类似于原始肿瘤的癌细胞。例如，如果乳腺癌扩散(转移)到肺部，则继发性肿瘤由恶性乳腺癌细胞形成。肺部的疾病是转移性乳腺癌而不是肺癌。本发明的作者还观察到，本发明的组合或组合物能够减少细胞增殖，而不考虑癌症是否表现出Myc蛋白的表达或活性增加。在一个优选的实施方案中，待预防或治疗的癌症是Myc诱导的癌症。

在一个实施方案中，癌症是实体瘤。

本发明的化合物和癌症类型的所有组合都包括在本发明中。

在一些实施方案中，本发明的组合或组合物抑制了肿瘤的生长。在一些实施方案中，相对于治疗前肿瘤的尺寸(例如体积或块)，本发明的组合或组合物使得肿瘤尺寸减少至少5％、10％、25％、50％、75％、90％或99％。在一些实施方案中，相对于患者治疗前的肿瘤数量，本发明的组合或组合物使得肿瘤数量减少至少5％、10％、25％、50％、75％、90％或99％。

如本文所用，“受试者”包括患有癌症、或表现出癌症症状、或有患癌症或表现出癌症症状的风险的任何动物。合适的受试者(患者)包括实验室动物(例如小鼠、大鼠、兔子或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(例如猫或狗)。包括非人类灵长类动物，优选人类患者。优选地，受试者是哺乳动物，最优选地是人类。

用于预防和/或治疗癌症的组合或组合物可以使用有效治疗或减轻癌症的严重程度的任何量和任何给药途径来给药。所需的确切量因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般病况，疾病或病况的严重性、具体试剂、其给药方式等。本发明的化合物优选地配制成剂量单位形式，以易于给药和剂量均匀。如本文所用的表述“剂量单位形式”是指适用于待治疗患者的试剂的物理离散单位元。然而，应该理解，本发明化合物和组合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者或生物体的具体有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的病症和病症的严重程度；所用的特定化合物的活性；使用的具体组成；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和所用特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的特定化合物组合或同时使用的药物，以及医学领域众所周知的类似因素。

在一个优选的实施方案中，本发明的组分(i)，优选为多肽或其功能等效变体或缀合物，与组合或组合物的肿瘤免疫剂协同地相互作用以治疗癌症(以达到治疗效果)。

特别地，在一个更优选的实施方案中，用于预防和/或治疗癌症的组合或药物组合物是其中多肽或其功能等效变体或缀合物的量与肿瘤免疫剂在治疗癌症中协同地相互作用的组合或药物组合物。

术语“协同作用”或“协同地相互作用”可互换使用。协同作用大于通过将单个试剂在体外的实际作用相加所预测的累加作用。在体内，协同作用是生理作用，特别是治疗作用，其大于通过将单个试剂在体内的实际作用相加所预测的累加作用。

因此，如果给药两种试剂，则如果两种药剂一起的实际效果大于通过将单个试剂的实际治疗效果相加所预期的效果，则它们一起提供了可测量的生理效果，尤其是治疗效果。具体地，当单独的第一试剂提供一些可测量效果，单独的第二试剂提供一些可测量效果，并且两种试剂一起提供的可测量效果大于两种单独试剂的总和所提供的效果时，则提供了协同作用。更具体地，当单独的第一试剂没有提供可测量效果，单独的第二试剂提供一些可测量效果，并且两种试剂一起提供的可测量效果大于单独的第二试剂所提供的效果时，则提供了协同作用。更特别地，当单独的第一试剂和单独的第二试剂都不提供任何可测量的效果，但是两种试剂一起提供可测量的效果时，则提供了协同作用。由于组分(i)和(ii)协同作用，因此本发明的组合或组合物的组分(i)和/或(ii)的量可以少于仅使用其中一种作为治疗剂的单一疗法所需要的量。优选地，在这些组合或组合物中，一种或另一种治疗剂的给药剂量可以为0.01μg/kg体重/天至1.000μg/kg体重/天。

组合或组合物中存在的治疗剂的量可以不大于在包含该治疗剂作为唯一活性剂的组合物中通常给药的量。优选地，本发明组合物中治疗剂的量为正常存在于包含该试剂作为唯一治疗活性剂的组合物中的量的约50％至100％的范围。在一些实施方案中，一种治疗剂以该试剂的正常给药量的约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％给药。如本文所用，短语“正常给药”是指FDA批准的治疗剂的量是根据每个FDA标签插页批准的剂量。

本发明的组合或组合物也可以与已知的治疗方法组合使用，例如与化学疗法、放射疗法、免疫疗法、光疗、外科手术、激素、或它们的组合。

在一个优选的实施方案中，用于治疗和/或预防癌症的组合或药物组合物用于治疗肺癌，优选NSCLC，更优选Kras驱动的癌症，甚至更优选KRAS^G12D驱动的癌症，其中第一组分优选包含序列SEQ ID NO：1的多肽，更优选由SEQ ID NO：1组成的多肽，经鼻内给药；并且其中第二成分优选为抑制T细胞活化的蛋白的拮抗剂，更优选为抗PD-1或抗CTLA-4，甚至更优选为抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体，经全身给药，优选经肠胃外给药，甚至更优选腹膜内给药。在一个优选的实施方案中，第一组分每周给药四次。在一个优选的实施方案中，第二组分每周给药一次。在更优选的实施方案中，第一组分每周给药四次，并且第二组分每周给药一次。在一个实施方案中，第一组分和第二组分依序给药，即，在开始给药第二组分之前停止给药第一组分。在一个优选的实施方案中，治疗持续至少四个周。在一个优选的实施方案中，第一组分和第二组分在不同天给药。在一个优选的实施方案中，第一组分在第1、2、4和5天进行给药，而第二组分在第3天进行给药。在一个共同给药的优选实施方案中，第一组分和第二组分在不同天进行给药，优选地，第一组分在第1、2、4和5天进行给药，而第二组分在第3天进行给药。在一个优选的实施方案中，组分(i)和组分(ii)的量的比例范围可以为50：1至1：50，具体为20：1至1：20、1：10至10：1、或5：1至1：5，优选为1：1至1：5，更优选为1：1至1：3。在一个更优选的实施方案中，该比例范围可以为1：1至1：1.5，优选为1：1.3至1：1.4，更优选为1：1.34。在另一个优选的实施方案中，该比例范围为1：1至1：2.8，优选为1：2.6至1：2.7，更优选为1：2.67。这些比例优选为重量/重量比率。

在一个优选的实施方案中，用于治疗和/或预防癌症的组合或药物组合物用于治疗肺癌，优选NSCLC，更优选Kras驱动的癌症，甚至更优选KRAS^G12D驱动的癌症，优选KRAS^G12D/p53-驱动的癌症，其中第一组分优选包含序列SEQ ID NO：1的多肽，更优选由SEQ ID NO：1组成的多肽，经静脉给药；并且其中第二组分优选为抑制T细胞活化的蛋白质的拮抗剂，更优选为抗PD-1或抗CTLA-4，甚至更优选为抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体，甚至更优选为抗PD-1抗体，经全身给药，优选经肠胃外给药，甚至更优选经腹膜内给药。在一个优选的实施方案中，第一组分每周给药两次。在一个优选的实施方案中，第二组分每周给药一次。在更优选的实施方案中，第一组分每周给药两次，并且第二组分每周给药一次。在一个实施方案中，第一组分和第二组分依序给药，即在开始给药第二组分之前停止给药第一组分。在另一个实施方案中，第一组分和第二组分同时给药，优选每周一次。在一个优选的实施方案中，治疗至少持续三周，优选是至少四周。在一个优选的实施方案中，第一组分和第二组分在不同天给药。在一个优选的实施方案中，第一组分在第2天和第5天进行给药，第二组分在第3天进行给药。在一个共同给药的优选实施方案中，第一组分和第二组分在不同天进行给药，优选地，第一组分在第2天和第5天进行给药，第二组分在第3天进行给药。在更优选的实施方案中，第一组分在给药第二组分前的一段时间期间(优选地至少5天、至少10天、至少15天、更优选地10天)进行给药。在一个实施方案中，在开始给药第二组分之前停止给药第一组分。在一个优选的实施方案中，组分(i)和组分(ii)的量的比例范围可以为50：1至1：50，具体为20：1至1：20、1：10至10：1、或5：1至1：5。在另一个具体的实施方案中，量的比例范围为30：1至5：1，优选为30：1至8：1，更优选为25：1至15：1，更优选为20：1至10：1。在一个实施方案中，该比例为20：1。在另一个实施方案中，该比例为10：1。这些比例优选为重量/重量比率。

本发明组合的所有实施方案也适用于本发明的治疗方法。

制品和套组

本公开还提供了在一个或多个容器中的包含本文公开的组合或药物组合物中的任何一种的制品。在一些实施方案中，制品包括例如指导用户(例如，分销商或最终用户)组合和/或使用制品的组合物以预防和/或治疗癌症的手册、印刷说明书、标签或包装插页。

在一些实施方案中，制品包括例如瓶、小瓶，药筒、盒、注射器(syringe)、注射器(injector)、或其任何组合。在一些实施方案中，标签是指根据本文公开的方法使用或给药制品中的组合或药物组合物。在一些方面，标签建议例如使用方案，治疗、预防或改善癌症的方案。

在本申请中可能被引用的所有引用的参考文献(包括参考文献、专利、专利申请和网站)的内容以及其中引用的参考文献，出于任何目的，在此明确地以引用的方式整体并入本申请中。

除非另有说明，否则本文所用的所有术语应以本领域已知的普通含义来理解。在本申请中使用的某些术语的其他更具体的定义如下所述，并且旨在在整个说明书和发明申请专利范围中统一应用，除非另外明确列出的定义提供了更广泛的定义。在整个说明书和发明申请专利范围中，单词“包括”和单词的变体并不旨在排除其他技术特征、添加物、组分或步骤。此外，单词“包括”涵盖“由……组成”的情况。通过阅读说明书，本发明的其他目的、优点和特征对于本领域技术人员将变得显而易见，或者可以通过实施本发明而获悉。此外，本发明涵盖本文描述的具体和特定实施方案的所有可能的组合。

在本说明书和附随的发明申请专利范围中，单数形式的不定冠词术语("a","an")和定冠词术语(“the”)包括复数指示物。上下文另有明确指示除外。不定冠词术语"a"(或"an")以及术语“一个或多个”和“至少一个”在本文可以互换使用。此外，在本文使用的“和/或”应被视为明确公开两个指定的特征或组分中的每个具有或不具有另一个。因此，在本文中短语中所使用的术语“和/或”(例如，“A和/或B”)旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在短语中使用的术语“和/或”(例如，“A、B和/或C”)旨在涵盖以下方面中的每个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。在整个说明书和发明申请专利范围中结合数值使用的术语“约”表示本领域技术人员熟悉并可接受的精度区间。通常，这种精度区间为±15％。除非另外限定，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本公开涉及的技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)接受的形式表示。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左至右书写。本文提供的标题不是对本公开的各个方面或方面的限制，其可以通过参考整个说明书作为一个整体来获得。因此，通过参考整个说明书更完整地定义了下面直接定义的术语。

将通过以下实施例描述本发明，这些实施例应被认为仅仅是说明性的，而不是对本发明范围的限制。

实施例

Omomyc的生产和纯化

使用由J.-F.Naud等人，2003.J Mol Biol,326:1577-1595；F.-O.和Mcduff等人，2009.J Mol Recognit,22:261-269中描述的Max°纯化方案的改进方案，将在N末端包含甲硫氨酸的Omomyc肽序列SEQ ID NO：4进行逆转录，优化密码子以在大肠杆菌E.coli中表达，在pET3a表达载体(Novagen)中克隆，并由BL21(DE3)阿拉伯糖-可诱导型细菌菌株纯化。获得的纯化的构建体是SEQ ID NO：4的多肽。每个纯化的构建体的身份通过质谱和蛋白质印迹分析来确认。通过阳离子交换色谱法纯化Omomyc，并通过质谱分析、SDS-PAGE和UV光谱法确认纯度。对于体内给药，使用ToxinEraser^TM Endotoxin Removal Kit(Genscript)进行额外的纯化步骤以去除内毒素。使用LAL ChromogenicEndotoxin Quantification Kit(Thermo Scientific)定量内毒素浓度。缓冲液交换是在Amicon Ultra-15(MerckMillipore)中进行的，排阻限为3kDa。

Omomyc鼻内治疗增加了T淋巴细胞特异性向肿瘤部位的募集

通过Transnetyx对KRas^LSL-G12D/+小鼠进行基因分型，并按照先前的描述(Jackson,E.L.等人，Genes Dev,2001.15(24):第3243-8页)，在雄性和雌性中产生肺部肿瘤。使动物保持在混合的C57BL/6J×FVBN背景中。每个时间点和病况下至少5只小鼠被随机分组，并一旦这些小鼠出现通过micro-CT可检测到的肿瘤，在Adeno-Cre感染后14至16周开始治疗。在一周至四周期间，通过吸入异氟烷(AbbVie Farmaceutica S.L.U.)麻醉动物，并每周四次(1101100)经鼻内用30μL总体积的Omomyc多肽(2.4mg/kg)或载体(10mM乙酸钠，pH 6.5)处理动物。

在终点，对小鼠实施安乐死，切除肺部并通过气管灌注4％PFA，固定过夜，转移到70％乙醇中，包埋在石蜡中，并切成4μm的切片。对于CD3免疫荧光，通过在400W的微波中于0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中加热20分钟来进行抗原修复。在3％BSA加0.05％Tween20中封闭1小时后，将切片与用Dako即用型稀释剂(Dako S2022)以1/100稀释的抗CD3(DakoA0452)在4℃孵育过夜。PBS洗涤后，将切片与山羊抗兔IgG(H+L)–488缀合物(Thermo Fisher Scientific A-11008)一起孵育，并用1/10000稀释的DAPI(LifeTechnologies D1306)染色，用PBS洗涤，并用荧光封片剂(Dako S3023)固定。使用尼康C2+共聚焦显微镜和NIS-elements软件拍摄图像。每只小鼠拍摄五张代表性肿瘤的照片，并显示了每区域CD3⁺细胞的平均值。

用抗CD3进行免疫染色显示，Omomyc治疗最早在治疗开始后1周就增加了T淋巴细胞特异性向肿瘤部位的募集，并且在整个治疗过程中T细胞都保留在那里(图1A)，表明Omomyc多肽作用机制的一部分可能是免疫贡献。

Omomyc鼻内治疗将活化的CD4T细胞募集到肿瘤部位

实验模型和Omomyc处理与先前描述的相同。

在终点，对小鼠实施安乐死，并使用Mouse Tumor Dissociation Kit(Miltenyi)将肺部切除并分离，并用缀合抗体染色，以通过流式细胞术分析免疫细胞的含量。染色之前，按照制造商的说明，用Fixable Viability Stain 510(BD Biosciences 564406)对死亡细胞进行染色。然后，通过与抗CD16/32抗体在室温下孵育10分钟来封闭非特异性结合。对于表面染色，将细胞与抗体在黑暗中于4℃孵育20分钟。表1列出了使用的抗体。对于FoxP3的细胞内染色，按照制造商的说明使用FoxP3Transcription Buffer Set(eBioscience 00-5523-00)。使用CytoFlex cytometer(Beckman Coulter)采集细胞，并使用CytoExpert 2.0software(Beckman Coulter)分析数据。

图1B显示了FACS分析，表明Omomyc诱导CD4 T细胞募集至肿瘤并且被活化。实际上，这些细胞显示出更高水平的PD-1和PD-1Tim-3分子，这表明Omomyc诱导了抗肿瘤免疫反应。另外，Omomyc还诱导T调节细胞(Tregs)的扩增。

全身给药Omomyc将T细胞募集到肿瘤部位

对于使用Kras/p53同源模型进行的研究，将1×10⁶MuH-163细胞经皮下接种到7周龄雌性C57BL/6小鼠(JANVIER LABS)的背侧。一旦形成肿瘤并达到约100mm³的体积，将小鼠随机分为两组，每周一次用载体(PBS pH 7.0)或Omomyc(32mg/kg)经静脉处理。处理三周后，对小鼠实施安乐死，切除肿瘤并将其切成两部分。然后将一半的肿瘤用4％PFA固定过夜，转移到70％乙醇中，包埋在石蜡中，并切成4μm的切片。对于CD3免疫荧光，通过在400W的微波中于0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中加热20分钟来进行抗原修复。在3％BSA加0.05％Tween20中封闭1小时后，将切片与用Dako即用型稀释剂(Dako S2022)以1/100稀释的抗CD3(Dako A0452)在4℃孵育过夜。PBS洗涤后，将切片与山羊抗兔IgG(H+L)–488缀合物(Thermo Fisher Scientific A-11008)一起孵育，并用1/10000稀释的DAPI(Life Technologies D1306)染色，用PBS洗涤，并用荧光封片剂(Dako S3023)固定。使用机械的尼康Tie荧光显微镜和NIS-elements软件拍摄图像。每只小鼠拍摄四张肿瘤的代表性区域的照片，并显示了每领域CD3⁺细胞的平均值。

对于流式细胞术分析，使用Mouse Tumor Dissociation Kit(Miltenyi)分离另一半的肿瘤，并用缀合抗体染色，以通过流式细胞术分析免疫细胞的含量。染色之前，按照制造商的说明，用Fixable Viability Stain 510(BD Biosciences 564406)对死亡细胞进行染色。然后，通过与抗CD16/32抗体在室温下孵育10分钟来封闭非特异性结合。对于表面染色，将细胞与抗体在黑暗中于4℃孵育20分钟。表1列出了使用的抗体。使用CytoFlexcytometer(Beckman Coulter)采集细胞，并使用CytoExpert 2.0software(BeckmanCoulter)分析数据。

给药Omomyc诱导T细胞向肿瘤部位募集(图2A)。Omomyc将更多的CD8 T细胞募集到肿瘤部位，同时表达PD-1和Tim-3分子两者的CD4和CD8 T细胞明显增多(图2B)。

Omomyc与抗PD-1的组合将CD4⁺ PD-1⁺ Tim-3^- T细胞募集到肿瘤中

通过Transnetyx对KRas^LSL-G12D/+小鼠进行基因分型，并按照先前的描述(Jackson,E.L.等人，Genes Dev,2001.15(24):第3243-8页)，在雄性和雌性中产生肺部肿瘤。使动物保持在纯的C57BL/6背景中。每个时间点和病况下至少5只小鼠被随机分组，并一旦这些小鼠出现通过micro-CT可检测到的肿瘤，在Adeno-Cre感染后14-16周开始治疗。将小鼠随机分为4组：载体+同型大鼠IgG2a,k、Omomyc+同型大鼠IgG2a,k、载体+抗PD-1和Omomyc+抗PD-1。对于Omomyc处理，通过吸入异氟烷(AbbVie Farmaceutica S.L.U.)麻醉动物，并每周四次(1101100)经鼻内用30μL总体积的Omomyc多肽(2.4mg/kg)或载体(PBS，pH＝7)处理动物。在四周内，每周一次(0010000)经腹膜内给药剂量为200μg/小鼠的抗PD-1(BioXCellBE0146)或其同型大鼠IgG2a,k(BioXCell BE0089)。

在终点，对小鼠实施安乐死，并使用Mouse Tumor Dissociation Kit(Miltenyi)将肺部切除并分离，并用缀合抗体染色，以通过流式细胞术分析免疫细胞的含量。染色之前，按照制造商的说明，用Fixable Viability Stain 510(BD Biosciences 564406)对死亡细胞进行染色。通过与抗CD16/32抗体在室温下孵育10分钟来封闭非特异性相互作用。对于表面染色，将细胞与抗体在黑暗中于4℃孵育20分钟。表1列出了使用的抗体。使用CytoFlex cytometer(Beckman Coulter)采集细胞，并使用CytoExpert 2.0software(Beckman Coulter)分析数据。

与载体和仅抗PD-1治疗组两者相比，Omomyc和抗PD-1疗法的组合显著增加了表达PD-1但不表达Tim-3的CD4⁺ T细胞向肿瘤部位的募集(图3)。该发现表明Omomyc与抗PD-1的组合协同促进了抗肿瘤免疫应答。最近的发现表明，PD-1在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的表达准确地识别出克隆扩增的肿瘤反应性细胞的所有组成成分(Gros A等人,J Clin Invest(2014)124(5):2246–2259)。按照这种思路，尽管在与其配体(PD-L1和PD-L2)连接时会产生抑制信号，但现在很清楚的是，PD-1表达是T细胞活化和特异性针对肿瘤抗原的高亲和力TIL的首要标志物(参见Simon S和Labarriere N.，OncoImmunology(2018).7:1,e1364828)。

Omomyc与抗PD-1的组合诱导IFN-γ的产生

实验模型、Omomyc和抗PD-1处理与先前描述的相同。

在终点，对小鼠实施安乐死，并使用Mouse Tumor Dissociation Kit(Miltenyi)将肺部切除并分离，并用缀合抗体染色，以通过流式细胞术分析免疫细胞的含量。染色之前，按照制造商的说明，用Fixable Viability Stain 510(BD Biosciences 564406)对死亡细胞进行染色。通过与抗CD16/32抗体在室温下孵育10分钟来封闭非特异性相互作用。对于表面染色，将细胞与抗体在黑暗中于4℃孵育20分钟。表1列出了使用的抗体。对于IFN-γ染色，在莫能菌素(monensin)和贝菲德林(befeldrin)A(均来自BD Biosciences)的存在下，用PMA加ionomicin(均来自Sigma-Aldrich)刺激收获和分离的肿瘤细胞12小时。然后收获细胞并染色以进行流式细胞术分析。对于IFN-γ的细胞内染色，按照制造商的说明使用BD Cytofix/Cytoperm buffer set(BD Biosciences 554722)。使用CytoFlex cytometer(Beckman Coulter)采集细胞，并使用CytoExpert 2.0software(Beckman Coulter)分析数据。

这些实验表明，与它们的载剂对照相比，Omomyc加抗PD-1的组合疗法显著诱导了通过CD4⁺辅助细胞和CD8+细胞毒性肿瘤内T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)(图4)，这一事实在Omomyc或抗PD-1处理组中都没有观察到。

在最近几年中，已经积累了大量证据，证明IFN-γ在促进肿瘤排斥和清除中起关键作用。该细胞因子主要由活化的T细胞和NK细胞产生，并通过直接诱导对于肿瘤细胞的抗增殖、促凋亡和促坏死作用，并通过诱导主要组织兼容性分子上调来增强免疫原性，从而发挥其抗肿瘤作用(更多内容参见Castro F等人，Front.Immunol.(2018).9:847和Ikeda H等人，Cytokine&Growth Factors Reviews(2002)13，95-109)。此外，该细胞因子还影响肿瘤微环境，通过抑制肿瘤周围的内皮细胞的增殖和存活从而损害血管生成，并因此诱导肿瘤部位的局部缺血，这是导致肿瘤排斥的重要机制(Beatty G和Paterson Y.J Immunol(2001)166:2276–82,Kammertoens T等人，Nature(2017)545:98–102和Briesemeister D等人，Int J Cancer(2011)128:371–8)。此外，由Th1 CD4⁺和CD8⁺ T细胞产生的IFN-γ增强了肿瘤清除，因为这种细胞因子对于T和NK细胞向肿瘤部位的转移至关重要(Melero I等人，Cancer Discov(2014)4:522–6)。此外，IFN-γ在活化巨噬细胞和促进其杀肿瘤活性方面也起着关键作用(Celada A等人，J Exp Med(1984)160:55–74)。重要的是，升高水平的IFN-γ是响应于化学疗法和放射疗法以及抗PD-1和CLTA-4免疫疗法两者的预测性生物标志物(Karachaliou N等人，Ther Adv Med Oncol(2018)10:1758834017749748和Mo X等人，Cancer Res(2018)78:436–50)。一致地，最近的临床试验已经有了显示出产生IFN-γ的效应T细胞与肿瘤生长抑制之间的关联的有希望的结果(Liakou CI等人，Proc Natl AcadSci U S A(2008)105:14987–92,Peng W等人，Cancer Res(2012)72:5209–18和Overacre-Delgoffe AE等人，Cell(2017)169:1130–41.e11)。

表1：用于流式细胞术分析的抗小鼠抗体

Omomyc与抗PD-1抗体的组合协同地增加健康肺部的比例，并将T细胞募集到肿瘤 部位。

通过Transnetyx对KRas^LSL-G12D/+小鼠进行基因分型，并按照先前的描述(Jackson,E.L.等人，Analysis of lung tumor initiation and progression using conditionalexpression of oncogenic K-ras.Genes Dev,2001.15(24):第3243-8页)，在雄性和雌性中产生肺部肿瘤。使动物保持在纯的C57BL/6背景中。在Adeno-Cre感染后14至16周后，一旦小鼠出现通过micro-CT可检测到的肿瘤，就将它们随机分为4组，按以下方式治疗4周：载体+同型大鼠IgG2a,k、Omomyc+同型大鼠IgG2a,k、载体+抗PD-1和Omomyc+抗PD-1。对于Omomyc治疗，通过吸入异氟烷(AbbVie Farmaceutica S.L.U.)麻醉动物，并每周四次(1101100)经鼻内用30μL总体积的Omomyc多肽(3.75mg/kg)或载体(PBS，pH＝7)处理动物。在四周内，每周一次(0010000)经腹膜内给药5mg/kg的抗PD-1(BioXCell BE0146)或其同型大鼠IgG2a，k(BioXCell BE0089)。

使用Quantum FX成像系统(Perkin Elmer.940Winter St.Waltham，Massachusetts.EEUU)获得了microCT研究，图像重建基于Feldkamp方法。对于胸腔容积，使用Quantum FX分析软件。首先，在脊水平(carina level)处测量侧肋骨之间的距离(r2)。第二个测量定义为从脊水平到横隔膜的杯状部的最大距离(h)。最后一个测量是胸腔高度，其定义为横隔膜的杯状部水平处的胸骨与下腰肌之间的距离(r1)。使用这三个值，使用以下数学公式计算出截锥的体积：

体积＝高度*π/3*(r13-r23)/(r1-r2)

利用AMIDE软件(Andreas Loening)使用阈值方法计算肺部健康组织。此阈值选择强度值包括在-950/-350灰度范围内的图像中的全部体素量。在进行了不同的研究后，手动选择了此灰度范围。

最终，基于维持完整胸腔容积的意图，计算出健康的肺部体积/胸腔容积比，而随着病理学进展逐渐减少健康的肺部体积。与单独的载体和治疗相比，用Omomyc与抗PD-1的组合治疗的动物呈现出健康肺部的的比例增加(图5A和5B)。

在终点，对小鼠实施安乐死，并使用Mouse Tumor Dissociation Kit(Miltenyi)将肺部切除并分离，并用缀合抗体染色，以通过流式细胞术分析免疫细胞的含量。染色之前，按照制造商的说明，用Fixable Viability Stain 510(BD Biosciences 564406)对死亡细胞进行染色。通过与抗CD16/32抗体在室温下孵育10分钟来封闭非特异性交叉反应。对于表面染色，将细胞与抗体在黑暗中于4℃孵育20分钟。表2列出了使用的抗体。

表2：用于流式细胞术分析的抗小鼠抗体

对于IFN-γ和IL-17染色，在莫能菌素和贝菲德林A(均来自BD Biosciences)的存在下，用PMA加ionomicin(均来自Sigma-Aldrich)刺激收获和分离的肿瘤细胞12小时。然后收获细胞并染色以进行流式细胞术分析。对于IFN-γ的细胞内染色，按照制造商的说明使用BD Cytofix/Cytoperm buffer set(BD Biosciences 554722)。使用CytoFlexcytometer(Beckman Coulter)采集细胞，并使用CytoExpert 2.0software(BeckmanCoulter)分析数据。

图5C表明，联合给药Omomyc和抗PD-1诱导T细胞募集到肿瘤部位，特别是CD4T细胞和Th1/Th17细胞。表3示出了所获得的效果是协同的。当感兴趣的免疫细胞群的增加高于单独治疗的增加的总和时，被认为是协同作用。

表3：每个免疫细胞群的平均值

Omomyc与抗CTLA-4抗体的组合协同地减少肿瘤生长，并将抗肿瘤T细胞募集到肿 瘤部位

实验模型、micro-CT扫描和FACS染色与图5中所示的相同。

在Adeno-Cre感染后14-16周后，一旦小鼠出现通过micro-CT可检测到的肿瘤，就将它们随机分为4组，按以下方式处理4周：载体+同型叙利亚仓鼠(Syrian hamster)IgG、Omomyc+同型叙利亚仓鼠IgG、载体+抗CTLA-4、和Omomyc+抗CTLA-4。对于Omomyc处理，通过吸入异氟烷(AbbVie Farmaceutica S.L.U.)麻醉动物，并每周四次(1101100)经鼻内用30μL总体积的Omomyc多肽(3.75mg/kg)或载体(PBS，pH＝7)处理动物。在四周内，每周一次(0010000)经腹膜内给药10mg/kg的抗CTLA-4(BioXCell BE0131)或其同型叙利亚仓鼠IgG(BioXCell BE0087)。

图6A表明与单独的载体和治疗相比，用Omomyc与抗CTLA-4的组合治疗的动物出现减少的肿瘤生长。图6B表明联合给药Omomyc和抗CTLA-4诱导T细胞募集到肿瘤部位，特别是CD4T细胞和CD4与CD8 PD-1⁺ T细胞二者。表4示出了所获得的效果是协同的。当感兴趣的免疫细胞群的增加高于单独治疗的增加的总和时，被认为是协同作用。

表4：每个免疫细胞群的平均值

依序经静脉给药Omomyc与抗PD-1抗体的组合协同地将抗肿瘤T细胞募集到肿瘤部 位。

实验模型、micro-CT扫描和FACS染色与图5中所示的相同。

在Adeno-Cre感染后14-16周后，一旦小鼠出现通过micro-CT可检测到的肿瘤，就将它们随机分为4组，按以下方式处理4周：载体、Omomyc、载体+抗PD-1、和Omomyc+抗PD-1。对于Omomyc处理，每周两次用Omomyc多肽(50mg/kg)或用载体(NaAc 24mM+150mM NaCl)(0100100)经静脉对动物进行处理，持续10天。接受组合的组在前10天每周用Omomyc处理两次。在Omomyc处理10天后，接受组合的组停止该Omomyc处理，并开始每周一次(0010000)经腹膜内接受2.5mg/kg的抗PD-1(BioXCell BE0146)，直到实验结束。仅使用Omomyc的单一疗法组在前10天每周接受两次Omomyc，然后继续处理，但每周只接受一次，直到实验结束。

图7显示依序用Omomyc、然后用抗PD-1处理诱导T细胞募集到肿瘤部位，特别是表达PD-1和Tim-3分子二者的CD4 T细胞以及表达PD-1的Th1/Th17 T细胞。表5示出了所获得的效果是协同的。当感兴趣的免疫细胞群的增加高于单独治疗的增加的总和时，被认为是协同作用。

表5：每个免疫细胞群的平均值

经静脉给药Omomyc和抗PD-1抗体的组合协同地将T细胞募集到肿瘤部位

将极具侵袭性的Kras/p53突变的NSCLC MuH-163细胞系(1×10⁶细胞)经皮下接种到C57/BL6同源小鼠中。一旦肿瘤形成后，将小鼠随机分为4组:载体、Omomyc、载体+抗PD-1、和Omomyc+抗PD-1。Omomyc处理是以50mg/kg(0010000)经静脉给药，伴随着以5mg/kg经腹膜内给药抗PD-1抗体，每周一次，共3周。每周两次监测小鼠，通过卡尺测量来监测肿瘤的生长。

在终点处收集肿瘤，将其中一半用4％PFA固定并包埋在石蜡中用于IHC分析，而另一半使用Mouse Tumor Dissociation Kit(Miltenyi)进行消化，并用缀合抗体染色以通过流式细胞仪分析免疫细胞含量。如图5所示进行FACS染色和分析。

对于CD3免疫荧光，通过使用设置在400W的微波在0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中加热20分钟进行抗原修复。在3％BSA中封闭45分钟并在PBS中洗涤后，将切片与用Dako即用型稀释剂(Dako S2022)以1/100稀释的抗CD3(Dako A0452)在4℃孵育过夜。PBS洗涤后，将切片与以1/200稀释的山羊抗兔IgG(H+L)–488缀合物(Thermo FisherScientific A-11008)一起孵育，并用1/10000稀释的DAPI(Life Technologies D1306)染色，用水洗涤一次，并用荧光封片剂(Dako S3023)固定。CD3阳性是通过每只动物在20倍放大下捕获的5张具有代表性的荧光显微镜图像来检测的。

图8示出了Omomyc和抗PD-1的联合治疗将T细胞显著地募集到肿瘤部位。表6示出了所获得的效果是协同的。当感兴趣的免疫细胞群的增加高于单独治疗的增加的总和时，被认为是协同作用。

表6：每个免疫细胞群的平均值

CD3、CD4、IL-17和IFN-γ的高表达与更高的存活率相关

Kaplan-Meier绘图使用在线软件Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/index.php？p＝background)进行。为此，选择了肺癌患者数据库。NSCLC的所有组织学类型、所有分期、所有分级均纳入分析。

图9示出了CD3、CD4、IL-17和IFN-γ的高表达与NSCLC患者中更高的存活率相关。

讨论

与单独的Omomyc(0.86)和抗PD-1(0.92)疗法所显示的改善相比，鼻内Omomyc与抗PD-1抗体的组合协同增加了在总胸腔容积中健康肺部的比例(平均值7.969)(图5A和5B)。另外，联合给药的处理显著诱导T细胞募集到肿瘤部位，特别是CD4 T细胞和Th1/Th17细胞，已知它们发挥有效的抗肿瘤作用(Chatterjee,S.等人，CD38-NAD(+)Axis RegulatesImmunotherapeutic Anti-Tumor T Cell Response.Cell Metab,2018.27(1):p.85-100e8)(图5C)。

与这些结果一致，与载体(3.85)和两种单独给药的处理(Omomyc：2.3；a-CTLA-4：3.0)相比，鼻内Omomyc与抗CTLA-4的组合也显示出减少的肿瘤生长(1.11)(图6A)。

除了对肿瘤生长的直接影响外，该治疗组合还协同诱导T细胞募集到肿瘤部位，尤其是CD4 T细胞以及表达PD-1分子的CD4和CD8 T细胞二者(已知可识别肿瘤特异性T细胞的细胞(Gros,A.等人，PD-1identifies the patient-specific CD8(+)tumor-reactiverepertoire infiltrating human tumors.J Clin Invest,2014.124(5):第2246-59页)(图6B)。总之，经鼻内给药Omomyc与抗PD-1或抗CTLA-4的组合减少了肿瘤生长，并协同将抗肿瘤T细胞募集到肿瘤部位。

此外，使用相同的小鼠模型(Kras^G12D驱动的NSCLC)，发明人已证明经静脉的Omomyc与抗PD-1的组合的依次给药(先是Omomyc，然后是抗PD-1抗体)也协同并诱导T细胞募集到肿瘤部位，尤其是同时表达PD-1和Tim-3分子的肿瘤特异性CD4和Th1/Th17抗肿瘤T细胞(图7)。

为了在另一个模型中验证这种协同作用，作者在由Kras和p53二者突变驱动的另一个非常极具侵袭性的NSCLC模型中将Omomyc和抗PD-1结合使用。同样，两种药物都协同地，并显著地募集更多的T细胞至肿瘤部位(图8A)，还募集了更多的整体免疫细胞(图8B)。

总之，作者得出的结论是，将Omomyc处理与抗PD-1和CTLA-4疗法联合能够减少肿瘤生长，并协同将抗肿瘤T细胞募集到肿瘤部位。使用不同的给药途径、不同的Omomyc剂量以及不同剂量的抗PD-1和CTLA-4都观察到了这种治疗效果。

这种免疫细胞募集对NSCLC癌症患者具有明显的治疗效果，因为分泌IFN-g和IL-17的总CD3 T细胞、CD4和T细胞的比例增加与存活率增加相关(图9)。该证据强调了发现上述有关Omomyc与肿瘤免疫剂的组合的重要性。相同的结论可以推论到其他类型的癌症，其中基于免疫特征(signature)的数据已经建立，强大的免疫细胞组分可预测乳腺癌中对化学疗法的良好反应，而高的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与对新辅助治疗的更高的反应率相关。在结直肠癌的肝转移中，CD8⁺ T细胞的高度渗透预示了对化学疗法的更好反应和更长的生存期。在黑色素瘤中，免疫特征的表达(即Th1细胞和与细胞毒性相关的基因的高表达)与使用黑色素瘤相关的抗原3(MAGEA3)对治疗性疫苗的良好临床反应相关(Fridman,W.H.等人的描述，The immune contexture in cancer prognosis and treatment.Nat Rev ClinOncol,2017.14(12):p.717-734)。

在过去的几年中，已经积累了大量的证据，这些证据表明TIL对于消灭肿瘤和肿瘤免疫疗法的功效都起着至关重要的作用。实际上，对肿瘤免疫疗法的耐药性的主要因素是缺乏肿瘤T细胞浸润，这就是所谓的“冷肿瘤”的特征。用肿瘤免疫剂处理这种免疫惰性肿瘤面临着巨大的挑战，因为它们没有针对肿瘤的任何适应性免疫反应，并且无法对这种类型的疗法产生反应(Bonaventura,P.等人，Cold Tumors:A Therapeutic Challenge forImmunotherapy.Front Immunol,2019.10:p.168)。

在PD-1/PD-L1阻断后从未表现出临床反应或疾病稳定的患者被称为对治疗具有“原发性耐药性”。相反，来自临床试验的早期数据表明，在肿瘤及其周围存在预先存在的TIL，以及在T细胞和肿瘤细胞上共定位的PD-1和PD-L1表达预测对抗PD-1治疗的治疗反应(Nowicki,T.S.,S.Hu-Lieskovan,和A.Ribas,Mechanisms of Resistance to PD-1andPD-L1 Blockade.Cancer J,2018.24(1):p.47-53)。在同一条证据上，Pembrolizumab(抗PD-1)的功效与肿瘤内T细胞的存在和PD-1/PD-L1的表达相关，这是有效的抗肿瘤反应(Tumeh,P.C.等人，PD-1blockade induces responses by inhibiting adaptive immuneresistance.Nature,2014.515(7528):p.568-71)和抗PD-1试剂的功效(Ribas,A.,Tumorimmunotherapy directed at PD-1.N Engl J Med,2012.366(26):p.2517-9)的要求。

考虑到所有这些证据，表明协同诱导T细胞浸润和刺激的Omomyc与肿瘤免疫剂的组合最终会提高对肿瘤免疫疗法的临床反应率。

序列表

<110> 瓦尔希伯伦私人肿瘤研究基金会

卡塔兰研究和高级研究院

佩普托米克公司

<120> 采用Omomyc和结合PD-1或CTLA-4的抗体治疗癌症的联合疗法

<130> P17442PC00

<150> EP19382194.9

<151> 2019-03-19

<160> 65

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组蛋白

<400> 1

Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln

1 5 10 15

Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile

20 25 30

Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu

50 55 60

Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His

65 70 75 80

Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala

85 90

<210> 2

<211> 454

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met

1 5 10 15

Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp

20 25 30

Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln

35 40 45

Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile

50 55 60

Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg

65 70 75 80

Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser

85 90 95

Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp

100 105 110

Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln

115 120 125

Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile

130 135 140

Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val

145 150 155 160

Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser

165 170 175

Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr

180 185 190

Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val

195 200 205

Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala

210 215 220

Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser

225 230 235 240

Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His

245 250 255

Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu

260 265 270

Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro

275 280 285

Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys

290 295 300

Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His

305 310 315 320

Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala

325 330 335

Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser

340 345 350

Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn

355 360 365

Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu

370 375 380

Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu

385 390 395 400

Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala

405 410 415

Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

420 425 430

Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln

435 440 445

Leu Arg Asn Ser Cys Ala

450

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组蛋白

<400> 3

Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组蛋白

<400> 4

Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg

1 5 10 15

Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln

20 25 30

Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys

50 55 60

Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys

65 70 75 80

His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala

85 90

<210> 5

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组蛋白

<220>

<221> 变体

<222> (89)..(89)

<223> aa可以是除半胱氨酸外的任何氨基酸

<400> 5

Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln

1 5 10 15

Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile

20 25 30

Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu

50 55 60

Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His

65 70 75 80

Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Xaa Ala

85 90

<210> 6

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组蛋白

<220>

<221> 变体

<222> (90)..(90)

<223> Xaa可以是除半胱氨酸外的任何氨基酸

<400> 6

Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg

1 5 10 15

Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln

20 25 30

Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys

50 55 60

Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys

65 70 75 80

His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Xaa Ala

85 90

<210> 7

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组蛋白

<400> 7

Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln

1 5 10 15

Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile

20 25 30

Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu

50 55 60

Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His

65 70 75 80

Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala

85 90

<210> 8

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组蛋白

<400> 8

Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg

1 5 10 15

Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln

20 25 30

Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys

50 55 60

Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys

65 70 75 80

His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala

85 90

<210> 9

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组蛋白

<400> 9

Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln

1 5 10 15

Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile

20 25 30

Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu

50 55 60

Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His

65 70 75 80

Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ala Ala

85 90

<210> 10

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组蛋白

<400> 10

Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg

1 5 10 15

Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln

20 25 30

Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys

50 55 60

Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys

65 70 75 80

His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ala Ala

85 90

<210> 11

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组蛋白

<400> 11

Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg

1 5 10 15

Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln

20 25 30

Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys

50 55 60

Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys

65 70 75 80

His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala Gly Arg Lys Lys Arg

85 90 95

Arg Gln Arg Arg Arg

100

<210> 12

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 重组蛋白

<400> 12

Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg

1 5 10 15

Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln

20 25 30

Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu

35 40 45

Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys

50 55 60

Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys

65 70 75 80

His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala Arg Arg Arg Arg Arg

85 90 95

Arg Leu Arg

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 果蝇触角足蛋白中发现的CPP序列

<400> 13

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 14

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 单纯疱疹病毒1（HSV-1）VP22 DNA结合蛋白中发现的CPP序列

<400> 14

Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr

1 5 10 15

Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro

20 25 30

Val Glu

<210> 15

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> Bac-7的CPP序列

<400> 15

Arg Arg Ile Arg Pro Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg

1 5 10 15

Pro Leu Pro Phe Pro Arg Pro Gly

20

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> HIV-1 TAT蛋白的CPP序列(氨基酸 49-57)

<400> 16

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5

<210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> HIV-1 TAT蛋白的CPP序列

<400> 17

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Thr Pro Gln

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> HIV-1 TAT蛋白的CPP序列(氨基酸 47-57)

<400> 18

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> S413-PV肽的CPP序列

<400> 19

Ala Leu Trp Lys Thr Leu Leu Lys Lys Val Leu Lys Ala Pro Lys Lys

1 5 10 15

Lys Arg Lys Val

20

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 穿膜肽的CPP序列

<400> 20

Arg Gln Ile Lys Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 21

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> SynB1的CPP序列

<400> 21

Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr

1 5 10 15

Gly Arg

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> SynB3的CPP序列

<400> 22

Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe

1 5 10

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> PTD-4的CPP序列

<400> 23

Pro Ile Arg Arg Arg Lys Lys Leu Arg Arg Leu Lys

1 5 10

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> PTD-5的CPP序列

<400> 24

Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg

1 5 10

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> FHV COat的CPP序列(氨基酸 35-49)

<400> 25

Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg

1 5 10 15

<210> 26

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> BMV Gag的CPP序列 (氨基酸7-25)

<400> 26

Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp

1 5 10 15

Thr Ala Arg

<210> 27

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> HTLV-II Rex 的CPP序列(氨基酸 4-16)

<400> 27

Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg

1 5 10

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> D-Tat的CPP序列

<400> 28

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 29

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> R9-Tat的的CPP序列

<400> 29

Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 30

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> MAP的CPP序列

<400> 30

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Lys Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 31

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> SBP的CPP序列

<400> 31

Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly

1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 32

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> FBP的CPP序列

<400> 32

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 33

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> MPG的CPP序列

<400> 33

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 34

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> MPG(ENLS)的CPP序列

<400> 34

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 35

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> Pep-1的CPP序列

<400> 35

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val

20

<210> 36

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> Pep-2的CPP序列

<400> 36

Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val

20

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CPP序列

<400> 37

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CPP序列

<400> 38

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Arg

1 5

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CPP序列

<400> 39

Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg

1 5 10

<210> 40

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 转运肽

<400> 40

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1 5 10 15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

20 25

<210> 41

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CPP序列

<400> 41

Lys Ala Leu Ala Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala

1 5 10 15

Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Cys Glu

20 25 30

Ala

<210> 42

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CPP序列

<400> 42

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CPP序列

<400> 43

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 44

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CPP序列

<400> 44

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg

1 5

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CPP序列

<400> 45

Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala

1 5 10

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CPP序列

<400> 46

Thr His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 47

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CPP序列

<400> 47

Gly Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> SV40 大T抗原的NLS 序列

<400> 48

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 49

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 核质蛋白的NLS序列

<400> 49

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 50

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CBP80的NLS序列

<400> 50

Arg Arg Arg His Ser Asp Glu Asn Asp Gly Gly Gln Pro His Lys Arg

1 5 10 15

Arg Lys

<210> 51

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> HIV-I Rev 蛋白的NLS序列

<400> 51

Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Trp Glu

1 5 10

<210> 52

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> HTLV-I Rex的NLS序列

<400> 52

Met Pro Lys Thr Arg Arg Arg Pro Arg Arg Ser Gln Arg Lys Arg Pro

1 5 10 15

Pro Thr

<210> 53

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> hnRNP A的NLS

<400> 53

Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Lys Pro Arg

20 25 30

Asn Gln Gly Gly Tyr

35

<210> 54

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> rpL23a的NLS

<400> 54

Val His Ser His Lys Lys Lys Lys Ile Arg Thr Ser Pro Thr Phe Thr

1 5 10 15

Thr Pro Lys Thr Leu Arg Leu Arg Arg Gln Pro Lys Tyr Pro Arg Lys

20 25 30

Ser Ala Pro Arg Arg Asn Lys Leu Asp His Tyr

35 40

<210> 55

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> NLS序列

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(2)

<223> /代替="R或K"

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> /代替="R或K"

<400> 55

Lys Xaa Xaa Xaa

1

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> M1肽(Myc NLS)

<400> 56

Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp

1 5

<210> 57

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> M2肽(Myc NLS)

<400> 57

Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe

1 5 10

<210> 58

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 柔性肽

<400> 58

Gly Pro Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 59

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> FLAG-标签

<400> 59

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 60

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> Strep-标签

<400> 60

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> HA-标签

<400> 61

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 62

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> V5标签

<400> 62

Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr

1 5 10

<210> 63

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 肽标签

<400> 63

Ala His Gly His Arg Pro

1 5

<210> 64

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 肽标签

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> Xaa可以是任何天然氨基酸

<400> 64

Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser Gly Met

1 5 10 15

Thr Cys Xaa Xaa Cys

20

<210> 65

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> CPP

<400> 65

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5