一种肝脏病理大切片的he染色方法
阅读说明：本技术 一种肝脏病理大切片的he染色方法 (HE staining method for liver pathological large section ) 是由 金烁 李纯 曾建平 姜楠 于劭勍 于 2021-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及病理切片技术领域,具体涉及一种肝脏病理大切片的HE染色方法。具体地,采用本发明提供的HE染色方法基于肝门胆管癌大范围肝切除组织,制备得到可供诊断及科学研究的5厘米以上肝脏组织病理大切片。采用本发明提供的HE染色方法制备得到的肝脏病理大切片,可以全景展示肝脏肿瘤周围微环境及肝脏肿瘤与周围组织的关系,用于全面临床诊断及科学研究。(The invention relates to the technical field of pathological sections, in particular to an HE staining method for a large pathological section of liver. Specifically, a large pathological section of the liver tissue with the size of more than 5cm for diagnosis and scientific research is prepared by adopting the HE staining method provided by the invention based on the large-scale hepatectomy tissue of the hepatoportal cholangiocarcinoma. The large pathological liver section prepared by the HE staining method provided by the invention can display the microenvironment around the liver tumor and the relationship between the liver tumor and the surrounding tissues in a panoramic way, and is used for comprehensive clinical diagnosis and scientific research.)
技术领域
本发明涉及病理切片技术领域，具体涉及一种肝脏病理大切片的HE染色方法。
背景技术
病理大切片组织学的采用始于20世纪70年代的脑组织病理学。采用病理大切片的原因是为了可视化大脑的正常组织及其结构和改变，可将大脑的宏观和微观特征以及异常与临床表现相关联，包括为当时新兴的成像技术提供信息。
病理大切片组织学应用于泌尿生殖系统癌症标本，与神经病理学家具有相同的原因。例如，大切片组织学的应用对了解前列腺的正常解剖具有重要的意义，尤其适合正在接受培训的病理学家和放射科医生，藉由与放射影像的相关性来改善临床医生诊断前的“临床观点”。
通过病理大切片技术，病理学家可定义并转发给临床医生的精准信息有：诊断和预后信息，包括肿瘤多灶性和位置，组织学类型和变异，分级，TNM分期，包括手术切缘状态(R)和淋巴血管浸润(LVI)，以及肿瘤的体积和大小。通过病理大切片技术，还可以知道具有临床意义的其他特点以及具有潜在临床意义的其他特征。
肝脏病理大切片技术在肝脏恶性肿瘤的研究方面有着有极大的作用。该技术可全景观察肿瘤周围微环境、定位肿瘤与周围组织关系，肿瘤的生物学边界，然而目前国际上仍无系统性肝脏病理大切片的研究型论文报道。
肝脏组织的HE染色是整个肝脏病理大切片制备环节的关键。肝脏是腹腔最大的实质脏器，此外，肝脏实质细胞较多，其内的Glisson系统错综复杂，需同时观察肝内各系统及细胞的形态，HE染色步骤及难度较其他组织有着较大差异，这对HE染色的质量提出了较高的要求。
发明内容
为了解决现有常规HE染色不适用于病理大切片的制备，本发明提供一种适用于肝脏病理大切片的HE染色方法。本发明的目的是提供一种适用于制备5cm以上病理切片的肝脏病理组织的HE染色方法，以利于在肝脏疾病术后病理诊断及科学研究中应用。
第一方面，本发明提供一种肝脏病理大切片的HE染色方法，由于肝脏5厘米以上大标本组织含蜡量高，现有技术中的脱蜡方法，不能适用于大标本组织的脱蜡，因此在所述HE染色方法中，水化脱蜡处理为：
二甲苯(Ⅰ)，10min，
二甲苯(II)，10min，
二甲苯(III)，5min；
脱二甲苯处理使用：
100％乙醇(Ⅰ)，5min，
100％乙醇(II)，5min，
95％乙醇，5min；
80％乙醇，5min。
由于肝脏组织标本较大，若采用常规染色步骤中的水化处理，肝脏大组织内将有较多细胞因过度膨胀而着色效果不佳，影响观察；且肝脏大组织体积急速膨胀，会导致组织表面产生凹凸，从未导致数字扫描成像失败。在进行大组织的水化时，使用三级酒精浓度梯度及增加酒精作用时间是必不可少的。
染色分化处理使用1％盐酸处理20-40s；
伊红染色为0.5％水性伊红染色1-3min。
本发明在染色过程中，使用水性伊红溶液的原因是，在脱蜡和脱二甲苯处理后，肝脏大组织已水化完成，醇溶伊红在水中结合度较差，染色完成后必须快速进入酒精，如果稍慢，颜色即脱落。
在本发明提供的HE染色方法中，苏木素染色的时间为8-12min。
在本发明提供的HE染色方法中，使用1％氨水返蓝的时间为30s。
本发明提供的HE染色方法，还包括染色后脱水处理，所述染色后脱水和透明处理为：
80％乙醇，3min、95％乙醇，5min、无水乙醇(I)，5min、无水乙醇(II)5min、二甲苯(Ⅰ)，5min和二甲苯(II)、5min。
在本发明提供的HE染色方法中，所述肝脏病理大组织为肝门胆管癌大范围肝切除组织。
具体地，作为本发明的一个
具体实施方式
，所述HE染色方法为：
(1)二甲苯(Ⅰ)，10min、二甲苯(II)，10min、二甲苯(III)，5min；
(2)100％乙醇(Ⅰ)，5min、100％乙醇(II)，5min、95％乙醇，5min、80％乙醇，5min、流水冲洗，2min、蒸馏水2min；
(3)苏木素染色10min，流水冲洗3min；
(4)1％盐酸乙醇30s，流水冲洗1min；
(5)1％氨水返蓝30s，流水冲洗1min；
(6)0.5％水性伊红液染色1-3min，流水冲洗1min；
(7)80％乙醇，3min、95％乙醇，5min、无水乙醇(I)，5min、无水乙醇(II)5min；
(8)二甲苯(Ⅰ)，5min、二甲苯(II)，5min。
第二方面，本发明提供一种肝脏病理组织大切片的制备方法，所述制备方法中，使用上述的HE染色方法对所述肝脏病理组织进行染色后，使用中性树胶封固，尽量减少气泡，获得染色后的肝脏病理组织大切片。
第三方面，本发明提供一种肝脏病理石蜡切片，所述石蜡切片使用上述的HE染色方法进行所述肝脏病理组织的染色；所述石蜡切片为5cm以上的肝脏病理切片。
根据本领域技术人员的理解，本发明还要求保护上述HE染色方法或上述的制备方法或上述石蜡切片在肝脏疾病术后病理诊断、肝门胆管癌研究中的应用。
本发明的有益效果至少在于：
(1)本发明通过增加二甲苯的作用时间，起到对5厘米以上大标本组织充分脱蜡，使得组织充分进入水溶状态；
(2)本发明在水化过程中，增加了100％酒精的作用时间的同时，也增加了长时间的95％及80％乙醇的水化步骤，增加处理所用酒精浓度及作用时间，使得肝脏组织水化梯度更为缓和，充分防止细胞过度膨胀；
(3)本发明采用的水性伊红溶液较易与水化的大标本组织相结合，在大标本的HE染色中着色更为稳定；
(4)本发明提供了一种肝脏病理组织的染色方法，所述染色方法制备出的病理大切片适应于肝脏病理诊断级研究，在病理切片中各种细胞的细胞核显示清楚、各细胞及组织着色均匀；
(5)使用本发明提供的HE染色方法制备得到的肝脏病理大切片，在显微镜下，可清晰辨别到肝脏附属神经、动脉、静脉及纤维结缔组织，有利于观察肿瘤生物学行为。
附图说明
图1为本发明实施例1中使用的肝脏病理组织图。
图2为本发明实施例1中显微观察病理大切片获得的异型性细胞图。
图3为本发明实施例1中显微观察病理大切片获得肝实质细胞图。
图4为本发明对比例1中病理大切片的显微观察图。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供一种制备5cm以上病理大切片的病理组织HE染色方法。
一、HE染色前处理
如图1所示，将术后肝脏组织置于10倍于标本的10％福尔马林浸泡24小时，应用取材刀采用横断面8-10mm厚度的连续辐向取材后(与轴位腹部增强CT平行的平面取材)。随后将标本进行二次取材，为保证大标本取材的平整度，在包埋框的引导下，以同样人体周围角度进行再次切片取材，将每片组织厚度控制在4-5mm之间。于10倍于组织的10％中性福尔马林充分浸泡组织进行再次固定24小时，完成脱水机烤片程序后，进入HE染色阶段。
二、HE染色方法的步骤如下：
在着色完成后，本发明在第18-21步，采用了80％、95％及无水乙醇梯度酒精脱水，并控制脱水时间，使得脱水过程更为缓和，有效防止了大切片细胞急速皱缩而影响病理观察。同时防止了组织表面的出现凹凸，导致数字成像失败。
最后应用Olympus VS200全景数字扫描机，完成扫描后进行阅片。
经病理科医师阅片后，本实施例制备的肝脏大组织切片的全肝组织着色均匀，未见明显色差，进一步放大后见肝细胞癌细胞显示清楚，放大200倍后可清晰辨别异型性细胞(见图2)，同时可清楚观察癌组织周围血管、神经及纤维结缔组织，可准确观察癌周微环境及与周围组织关系。肝实质细胞及细胞核显示清楚(见图3)。说明该HE染色方法在肝脏病理大组织中可普适应用。
经病理科医师阅片后，本实施例制备的肝脏大组织切片的全肝组织着色均匀，未见明显色差，进一步放大后见肝细胞癌细胞显示清楚，放大200倍后可清晰辨别异型性细胞，同时可清楚观察癌组织周围血管、神经及纤维结缔组织，可准确观察癌周微环境及与周围组织关系。肝实质细胞及细胞核显示清楚。说明该HE染色方法在肝脏病理大组织中可普适应用。
对比例1
为了得到染色清晰的5cm以上的肝脏病理切片，本发明对染色方法进行多次不同改进方向的尝试，本对比例提供一种肝脏病理大组织的HE染色方法，本对比例与实施例1的区别在于，本对比例采用的HE染色方法为：
(1)二甲苯3min；
(2)二甲苯3min；
(3)二甲苯3min；
(4)无水乙醇3min；
(5)95％乙醇3min；
(6)95％乙醇3min；
(7)80％乙醇3min；
(8)70％乙醇3min；
(9)自来水1min；
(10)苏木素7min；
(11)自来水lmin；
(12)0.5～1％盐酸酒精<75％酒精>分化液30s；
(13)自来水1min；
(14)0.5-1％氨水返蓝液30s；
(13)自来水lmin；
(14)0.5％醇<80％乙醇>溶性伊红30s；
(15)70％乙醇30s；
(16)80％乙醇lmin；
(17)95％乙醇2min；
(18)95％乙醇2min；
(19)无水乙醇1min；
(20)二甲苯3min；
(21)二甲苯3min；
(22)二甲苯3min；
(23)进入封片机进行中性树胶的封固。
本对比例得到的大切片的显微观察图见图4，本对比例的染色程序得到的肝脏病理大切片着色不均，不能准确辨别各种细胞的细胞核，宣告染色失败。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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