一种肝脏病理大组织的脱水方法
阅读说明：本技术 一种肝脏病理大组织的脱水方法 (Dehydration method of liver pathological large tissue ) 是由 金烁 李纯 董家鸿 卢倩 项灿宏 曾建平 王良 王思远 于劭勍 姜楠 于 2021-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及病理切片技术领域,具体涉及一种肝脏病理大组织的脱水方法。具体地,本发明基于肝门胆管癌大范围肝切除组织,提供了制备可用于诊断及科学研究的肝脏5厘米以上病理大切片的肝脏组织脱水方法。采用本发明提供的脱水方法对肝脏病理大组织进行脱水,制备得到的肝脏病理大切片,可以全景展示肝脏肿瘤周围微环境及肝脏肿瘤与周围组织的关系,用于全面临床诊断及科学研究。(The invention relates to the technical field of pathological sections, in particular to a dehydration method of large pathological tissues of liver. Specifically, the invention provides a liver tissue dehydration method for preparing pathological large-scale liver sections of more than 5cm, which can be used for diagnosis and scientific research, based on the large-scale hepatectomy tissue of the hepatoportal cholangiocarcinoma. The dehydration method provided by the invention is adopted to dehydrate the large pathological liver tissue, and the prepared large pathological liver section can display the microenvironment around the liver tumor and the relationship between the liver tumor and the surrounding tissue in a panoramic way, and is used for comprehensive clinical diagnosis and scientific research.)
技术领域
本发明涉及病理切片技术领域，具体涉及一种肝脏病理大组织的脱水方法。
背景技术
20世纪70年代的脑组织病理学最早使用病理大切片组织，将大脑的正常组织学及其结构和改变进行可视化。实现了宏观和微观特征以及异常与临床表现相关联，也为当时新兴的成像技术提供信息。大切片组织学的应用对了解组织的正常解剖具有重要的意义，尤其适合正在接受培训的病理学家和放射科医生，藉由与放射影像的相关性来改善其诊断前的“临床观点”，病理大切片的获得具科学研究和学习价值。
例如，在泌尿生殖系统癌症标本制备中，整个病理组织大切片技术可以用于比较三个前列腺区域的不同结构，通过大切片技术，病理学家定义并转发给临床医生的精确信息有：诊断和预后信息、具有临床意义的其他特点和具有潜在临床意义的其他特征。
肝脏病理大切片技术在肝脏恶性肿瘤的研究方面有着有极大的作用，该技术可全景观察肿瘤周围微环境、定位肿瘤与周围组织关系，肿瘤的生物学边界。肝脏组织的脱水是整个肝脏病理大切片制备环节的关键，由于肝脏质地柔软易碎，针对肝脏的5厘米以上大标本的系统性脱水程序尚无报道。一个有研究价值的肝脏病理大切片在制备时，肝脏病理组织脱水应以防止皱缩和保持组织韧性为目标。
发明内容
本发明在制作肝脏病理大切片时，由于大切片中，包含不同组织，采用传统的切片标本制作方法，不能满足脱水需求。
为了解决现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种肝脏病理大组织的脱水方法。
第一方面，本发明提供一种肝脏病理大组织的脱水方法，所述脱水方法中的脱水程序为：
(1)10％福尔马林1.7-2.2h；
(2)70％乙醇3-3.5h；
(3)80％乙醇2-2.5h；
(4)95％乙醇1.3-1.8h；
(5)95％乙醇0.8-1.2h；
(6)95％乙醇0.8-1.2h；
(7)100％乙醇0.8-1.2h；
(8)100％乙醇0.8-1.2h；
所述脱水程序在32-38℃下进行。
在本发明提供的脱水方法中，所述脱水程序可以为：
(1)10％福尔马林2h；
(2)70％乙醇3.5h；
(3)80％乙醇2.5h；
(4)95％乙醇1.3-1.8h；
(5)95％乙醇0.8-1.2h；
(6)95％乙醇0.8-1.2h；
(7)100％乙醇0.8-1.2h；
(8)100％乙醇0.8-1.2h；
所述脱水程序在35℃下进行。
在本发明提供的脱水方法中，所述脱水程序还可以为：
(1)10％福尔马林2h；
(2)70％乙醇3.5h；
(3)80％乙醇2.5h；
(4)95％乙醇1.5h；
(5)95％乙醇1h；
(6)95％乙醇1h；
(7)100％乙醇1h；
(8)100％乙醇1h；
所述脱水程序在32-38℃下进行。
70％乙醇处理3.5h，可增加组织渗透，继续增加乙醇处理梯度为80％乙醇处理2.5h，可增加组织渗透，进行缓慢脱水，防止组织骤缩，70％乙醇处理3.5h和80％乙醇处理2.5h搭配进行，有利于肝脏大组织适应高浓度乙醇的脱水处理，且有利于在脱水的同时，保持组织完整性。
作为本发明的一个具体实施例，在本发明提供的脱水方法中，所述脱水程序为：
(1)10％福尔马林2h；
(2)70％乙醇3.5h；
(3)80％乙醇2.5h；
(4)95％乙醇1.5h；
(5)95％乙醇1h；
(6)95％乙醇1h；
(7)100％乙醇1h；
(8)100％乙醇1h；
所述脱水程序在35℃下进行。
固定后的病理组织中含有较多水分，必须将组织中的水分置换出来。针对病理大组织进行水分置换时，要考虑脱水剂是否可以进入到大组织深层，同时要防止脱水剂对组织产生剧烈收缩作用，导致大组织变脆。
更具难度的是，本次病理大组织中包含不同类型的细胞及组织。本发明采用由低浓度逐级至高浓度的乙醇，作为脱水液，逐步置换组织内的水分。组织在乙醇中脱水时，需要准确把握脱水时间，特别是在高浓度乙醇时，若脱水时间过短则脱水不足，影响了下一步的透明；若脱水时间过长，则导致组织收缩变硬，难以切出理想切片。
在本发明进行病理大组织的脱水程序中，通过低浓度乙醇与高浓度乙醇(梯度乙醇)以及适当处理时间的配合，为后续使用二甲苯作为透明剂提供良好的基础。
在本发明提供的脱水方法中，所述肝脏病理大组织为肝门胆管癌大范围肝切除组织。
在本发明提供的脱水方法中，还包括，在所述脱水程序结束后，使用透明剂对所述肝脏病理大组织进行透明化，所述透明化处理为：二甲苯，2h，35℃；二甲苯，2h，35℃。
若病理组织在二甲苯中，时间过短，采用石蜡包埋后会影响切片，若组织在二甲苯中，透明时间过长，会引起组织变脆，较难切出完整切片。
在本发明提供的脱水方法中，二甲苯处理结束后，在60-65℃下，进行石蜡包埋处理，使用石蜡1h、石蜡1h、石蜡1h和石蜡1h进行透明后病理组织的包埋。在包埋时，本发明发现石蜡温度过高或时间过长,均可使组织收缩、变硬、变脆、切不成片。
第二方面，本发明提供一种肝脏病理组织大切片的制备方法，在所述制备方法中，使用上述的脱水方法对所述肝脏病理组织进行脱水。
第三方面，本发明提供一种肝脏病理石蜡切片，所述石蜡切片使用上所述的脱水方法进行所述肝脏病理组织的脱水；所述石蜡切片为5cm以上的肝脏病理切片。
根据本领域技术人员的理解，本发明还要求保护上述脱水方法或上述的制备方法或上述石蜡切片在肝门胆管癌研究中的应用。
病理大切片的脱水目标在起到充分脱水效果的同时，较常规标本而言，应最大限度的防止组织的整体皱缩及表面不平整，若组织整体皱缩或不平整，会导致切片的碎裂或表面凹凸不平，从而导致数字成像失败。
本发明的有益效果至少在于：
(1)本发明增加了组织在低浓度酒精中的脱水时间，本发明提供的脱水方法适合肝脏病理大组织的脱水，低浓度酒精对组织的穿透力较高浓度酒精强，有效增加了肝实质内部的脱水效能，一定程度上减少了高浓度酒精的作用时间；
(2)本发明增加了组织在70％及80％酒精中的作用时间，使得脱水梯度更为缓和，避免了组织长时间在高浓度酒精中脱水所造成的组织皱缩，最大限度保持了切片的完整性，有效保持病理组织平整度及韧性，可对5厘米以上的病理大切片进行病理诊断及科学研究；
(3)本发明采用了10％中性福尔马林，稳定性高，对抗原抗体影响少的同时对组织DNA及RNA影响少，有利于免疫染色；
(4)本发明突破填补了既往在制备肝脏5厘米以上病理组织切片时，无可靠脱水方法的空白；
(5)本发明解决了肝脏病理大切片中组织柔软易碎，不易大标本切片的脱水问题；
(6)数字扫描及阅片显示，肝脏大切片中异型性细胞显示清楚，同时可清楚观察癌组织周围血管、神经及纤维结缔组织，可准确观察癌周微环境及与周围组织关系；且放大至指定倍数后，肝实质细胞及细胞核显示清楚，说明本发明提供的脱水方法制备得到的肝脏病理大组织切片，可达到诊断及研究标准。
附图说明
图1为本发明实施例1中使用的肝脏病理组织取材示意图。
图2为本发明实施例1中制备脱水完成的肝脏病理组织石蜡块效果图。
图3为本发明实施例1中使用樱花IVS-410切片机完成切片的示意图。
图4为本发明实施例1中得到的病理大切片扫描图。
图5为本发明实施例1中显微观察病理大切片获得的异型性细胞图。
图6为本发明实施例1中显微观察病理大切片获得肝实质细胞显示图。
图7为本发明对比例1中脱水后病理大标本的切片图。
图8为本发明对比例1中病理大切片的显微观察图。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供一种5cm以上的肝脏病理大切片的脱水方法，步骤如下：
一、脱水前处理，将术后肝脏组织(见图1)置于10倍于标本的10％福尔马林浸泡24小时，应用取材刀采用横断面8-10mm厚度的连续辐向取材(与轴位腹部增强CT平行的平面取材)。随后将标本进行二次取材，为保证大标本取材的平整度，在包埋框的引导下，以同样人体周围角度进行再次切片取材，将每片组织厚度控制在4-5mm之间，或长度控制在5-12cm，或宽度控制在5-10cm。于10倍于组织的10％中性福尔马林充分浸泡组织进行再次固定24小时，随后进入脱水阶段。
二、脱水方法为：
(1)10％福尔马林2h，35℃；
(2)70％乙醇3.5h，35℃；
(3)80％乙醇2.5h，35℃；
(4)95％乙醇1.5h，35℃；
(5)95％乙醇1h，35℃；
(6)95％乙醇1h，35℃；
(7)100％乙醇1h，35℃；
(8)100％乙醇1h，35℃；
(9)二甲苯2h，35℃；
(10)二甲苯2h，35℃；
应用30cm圆形玻璃培养皿完成蜡块制备(如图2)，
(11)石蜡1h，60℃；
(12)石蜡1h，62℃；
(13)石蜡1h，60℃；
(14)石蜡1h，62℃。
应用樱花IVS-410切片机完成切片(如图3)，在切片过程中，组织脱水程度良好，可完整切片，切片大小尺寸均为5cm以上，厚度为4μm。随后进行HE染色，得到肝脏病理大切片(见图4)，最后应用全景数字扫描机，完成扫描后进行阅片。
经病理科医师阅片后，发现癌细胞显示清楚，放大200倍后可清晰辨别异型性细胞。同时可清楚观察癌组织周围血管、神经及纤维结缔组织，可准确观察癌周微环境及与周围组织关系；肝实质细胞及细胞核显示清楚(见图5、见图6)。说明本发明提供的脱水方法在肝脏病理大组织中可普适应用。
对比例1
为了得到脱水成功的肝脏大组织，用于制备5cm以上的肝脏病理切片，本发明对脱水方法进行多次不同改进方向的尝试，本对比例提供一种制备5cm以上的肝脏病理大切片的脱水方法，本对比例与实施例1的区别在于，本对比例采用的脱水方法为：
(1)70％乙醇2h；
(2)80％乙醇1h；
(3)95％乙醇1h；
(3)95％乙醇1h；
(4)无水乙醇1h；
(5)无水乙醇1h；
(6)无水乙醇1h；
(7)二甲苯05h；
(8)二甲苯0.5h；
(9)石蜡1h；
(10)石蜡1h；
(11)石蜡1h。
本对比例中，因脱水作用时间不足及梯度不足，本对比例在低浓度乙醇脱水时间短，大组织标本未适应高浓度乙醇的脱水，导致组织急速皱缩及表面不平整，见图7。
本对比例得到的肝脏病理大切片，因肝脏组织实质细胞多，常规脱水梯度及作用时间不足，造成切片成像困难，且肝细胞急速皱缩，导致在镜下不能清晰观察到癌组织周围血管、神经及纤维结缔组织，见图8。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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