一种神经酰胺化合物的提取纯化方法
阅读说明：本技术 一种神经酰胺化合物的提取纯化方法 (Extraction and purification method of ceramide compound ) 是由 于姗姗 赵海荣 张敦谱 张辉 于 2021-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种对发酵法制备的神经酰胺化合物进行批量、快速的分离纯化方法；所述方法基于双水相萃取-分子印迹固相萃取相结合的联合萃取手段,具有大批量快速分离、成本较低的优点,适合工业化生产。本发明对预处理后的发酵液采用特定体系的双水相萃取、快速分子蒸馏,并借助于具有特定二维表面的分子印迹聚合微球批量快速吸附-快速非梯度洗脱方法,能显著提高产品的提取率和分离纯度,并有效降低产品损耗。(The invention provides a method for separating and purifying ceramide compounds prepared by a fermentation method in batches and rapidly; the method is based on a combined extraction means combining aqueous two-phase extraction and molecular imprinting solid-phase extraction, has the advantages of large-scale rapid separation and low cost, and is suitable for industrial production. The invention adopts a specific system of aqueous two-phase extraction and rapid molecular distillation to the pretreated fermentation liquor, and adopts a method of batch rapid adsorption-rapid non-gradient elution by molecular imprinting polymeric microspheres with specific two-dimensional surfaces, so that the extraction rate and the separation purity of the product can be obviously improved, and the product loss can be effectively reduced.)
技术领域
本发明属于发酵液神经酰胺提取和分离纯化技术领域，具体涉及一种从微生物发酵液中利用水相-固相联合萃取工艺的大规模快速纯化分离神经酰胺的方法。
背景技术
神经酰胺(Ceramide)广泛存在于动植物体内，是由神经鞘氨醇和长链脂肪酸缩合而成的酰胺类物质，分子式中通常具有酰胺基、多羟基以及不同长度的长链烷基链等基团，具有亲水亲油的双亲特性。神经酰胺是细胞膜的组成成分神经鞘磷脂的基本单位，与细胞的增殖、分化、凋亡等密切相关，具有屏障、保湿、美白、抗衰老、抗肿瘤等功效。过去在工业应用中主要作为化妆品添加剂使用，近年来，神经酰胺在食品和药物领域的功能也逐渐被发现，目前被广泛地应用于医药、食品和化妆品领域。
神经酰胺的来源可分天然和化学合成两类，天然神经酰胺通常来源于植物性提取、动物源提取以及发酵菌发酵提取。目前应用以天然的神经酰胺产品为主。而现有天然的神经酰胺均是通过从动植物来源例如酵母、植物、哺乳动物中分离得到，由于动物源存在疾病等原因，其安全性受到质疑。而植物源神经酰胺含量极低，其提取效率不高且成本昂贵。发酵法制备神经酰胺兼具安全性和高含量特点，属于可以人为控制神经酰胺目标物富集程度的方法，尤其是随着发现越来越多的高产神经酰胺且无毒的菌种例如酿酒酵母菌、假丝酵母菌和汉逊氏酵母菌，其在工业化生产中展现出巨大的潜力。
目前对于发酵法制备的神经酰胺提取仍然采用与植物源神经酰胺相似的纯化分离方法，包括萃取、色谱或层析分离。但是，尽管发酵法的神经酰胺含量相对更高，但是由于发酵液中存在大量的培养基成分以及微生物代谢产物，再加上破碎菌体或发酵基质等因素，导致产量低，成本高，导致发酵液中杂质极多，远超植物源提取液，导致后期分离纯化处理难度也更大。因此，开发适合从发酵液中提取纯化神经酰胺的工业化方法有重要意义。
现有技术中利用发酵制备神经酰胺或其衍生物的方法较少，可列举如下：CN106434825公开了A一种利用酱油滤渣制备D-葡萄糖基神经酰胺的方法，其特征在于采用以下步骤：活化菌株：将鞘氨醇单胞菌属菌株和解脂亚罗酵母菌株，分别接种至100mL活化培养基；B将步骤A获得的鞘氨醇单胞菌属菌株活化培养液和解脂亚罗酵母菌株活化培养液有氧发酵培养36～72h，得复合菌种发酵液；C、将复合菌种发酵液与酱油滤渣混合，加入复合发酵罐，静态培养，在25～30℃培养48～96h，获得富含菌体细胞的滤渣；高压均质2次，获得破壁细胞匀浆物；D、将破壁细胞匀浆物与乙醇溶液混合，滤得沉淀物，得D-葡萄糖基神经酰胺提取物。
CN 109206336 A公开了一种发酵法从米糠中制备神经酰胺的方法。所述方法包括以下步骤：米糠经除杂、粉碎、过筛后，向米糠粉中加入灵芝菌发酵；将发酵液分离，取清液得到神经酰胺溶液，将所得神经酰胺溶液经浓缩结晶可得神经酰胺固体。利用灵芝菌发酵米糠，不仅能显著提高米糠中神经酰胺的溶出，而且灵芝菌也会产生一定量的神经酰胺。
CN 106119310A提供了一种发酵法制备神经酰胺的工艺，包括培养基的制备、产紫青霉菌EFOZ-02的培养、样品制备、HPLC分离、干燥等工艺流程。由于产紫青霉EFOZ-02能分泌大量神经酰胺类物质到发酵液中，故不需要任何衍生化过程，操作简单，提取方便；而微生物发酵周期短、见效快且不受地区气候限制。
CN 109943602 A涉及一种酵母菌发酵法制备神经酰胺的工艺，包括以下步骤：原料基体包括米糠50-60％，板栗壳40-50％,将米糠和板栗壳烘干、除杂、粉碎，过筛，得原料基体，制备发酵培养基，接种酵母菌，均质破壁，分离、过滤、脱色，将滤液经过连续色谱选择分离得到神经酰胺。利酵母菌将米糠和板栗进行降解，从米糠和板栗壳中提取神经酰胺，酵母菌本身也含有神经酰胺，原料易得、成本低。
上述关于神经酰胺纯化的现有技术均为从发酵液中制备，但是均没有涉及到从发酵液中进行大规模批量处理得到高纯度产品的描述(HPLC高纯分离仅适用于微量分离，或用于分析鉴定神经酰胺具体结构)。因此，在面对成分复杂的发酵液时，现有技术难以从其中直接纯化分离得到高纯度的神经酰胺。因此，基于微生物发酵液原料，开发工艺操作相对简单、成本低廉，适合大批量快速纯化且产品收率和纯度较高的神经酰胺提取分离技术具有重要的应用价值和市场价值。
发明内容
针对现有技术中从发酵液提取神经酰胺存在的分离效率低、溶剂消耗大、产物纯度低以及无法进行大批量快速分离等问题，本发明提供了一种基于液相萃取-固相萃取相结合的联合萃取工艺以分离纯化发酵液中的神经酰胺。
具体地，本发明的首要目的是提供一种对发酵法制备的神经酰胺及其衍生物进行批量、快速的分离纯化方法；所述方法基于双水相萃取-分子印迹固相相结合的萃取联合萃取手段，具有大批量快速分离、成本较低的优点，适合工业化生产；且产品提取率和纯度较高。
本发明的另一目的在于提供基于发酵液提取分离的高纯神经酰胺，其无需进一步精制即可直接用于护肤化妆领域甚至药物领域，所述高纯神经酰胺具有不低于95％的HPLC纯度，优选为不低于97％的纯度。
本发明方法采用的主要技术方案为：对预处理后的发酵液采用特定体系的双水相萃取、快速分子蒸馏和分子印迹聚合物微球特异性吸附相结合(固相萃取)的手段，尤其是借助于具有特定二维表面的分子印迹聚合微球批量快速吸附-快速非梯度洗脱方法，能显著提高产品的提取效率和分离纯度，并有效降低产品损耗，且分离所用材料基本可以回收利用，适合工业化生产。
本发明所述的发酵法制备的神经酰胺及其衍生物，既包括从发酵液的发酵菌体中提取的神经酰胺类，也包括从发酵液中(发酵菌产生并释放或发酵基质中所含有)提取的神经酰胺类。前者例如从鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)菌株或解脂亚罗酵母菌菌株的菌壁中提取的包括神经酰胺衍生物在内的神经酰胺粗品，后者例如发酵液中含有的神经酰胺类粗品(例如CN106119310 A或CN109943602 A所公开的)；但是无论哪种来源，均需从发酵液中分离纯化得到。另外，微生物发酵产生神经酰胺的方法是现有技术已知的。
具体地，本发明的技术方案如下。
第一个方面，本发明提供一种基于发酵液的神经酰胺分离纯化方法，包括以下步骤S1-S5：
步骤S1：过滤除杂和初步萃取预处理
1)将经过初步固液分离或破壁匀浆处理后的含神经酰胺发酵液，经进一步过滤处理或离心处理去除残留固体杂质后进行浓缩，浓缩后通过100-600nm陶瓷滤膜进行超滤过滤，得到基本不含固体杂质的除杂滤液；其中，陶瓷滤膜优选100-500nm规格的超滤膜；
2)初步萃取：向除杂滤液中加入适量氢氧化钠，调整pH至碱性(例如pH 8-10)，加热至40-60℃，搅拌30-60min；然后加入0.5-1倍体积的石油醚进行萃取，并对萃取后的水相采用石油醚/乙酸乙酯混合萃取溶剂重复萃取2-5次，合并有机相；将合并后的有机相蒸发浓缩并回收有机溶剂，对所得产品充分干燥，即可得到含神经酰胺的粗品原料。
其中，加入适量氢氧化钠调整pH优选为8-9。由于固液分离后的发酵液中含有大量的包括各种脂肪酸等杂质在内的有机酸类物质，通过加入氢氧化钠进行适度皂化，可使其溶于水从而通过简单萃取除去，降低杂质含量(在该步骤中部分种类的神经酰胺或其衍生物部分成盐，无需调节成酸性pH，从而简化操作；在后续步骤中存在酸性环境条件)。
其中，对水相进行重复萃取时可通过高效液相色谱测定水相中神经酰胺含量，至基本不含有神经酰胺时停止萃取。
其中，混合萃取溶剂中石油醚/乙酸乙酯的体积比为5-10:1。
另外，由于神经酰胺具有亲水亲脂的两亲特性，使得部分神经酰胺存在于水相中，因此需对水相进行多次萃取并通过复合萃取溶剂的使用以提高提取率，降低神经酰胺在初步萃取中的损耗。
但是，通过多次萃取，也使得有机相中保留了大量的其他脂溶性有机杂质，因此需进行进一步精细化的二次萃取-双水相萃取。
步骤S2：双水相萃取
双水相萃取包括如下主要步骤:
(1)制备含有机聚合物/无机盐的双水相体系；
(2)向双水相体系中加入神经酰胺粗品原料，恒温下充分振荡进行混合；
(3)离心分相，对神经酰胺/有机聚合物的相分离去除聚合物，从而得到神经酰胺溶液；
(4)将获得的神经酰胺溶液浓缩(例如浓缩至神经酰胺含量5％或10％以上)。
其中，双水相萃取的具体流程包括：
1)双水相体系的配制
将高分子有机聚合物，选自硫酸铵/或磷酸氢二钾的无机盐，选自醇类的分相调节剂，去离子水或Britton-Robinson缓冲溶液(优选Britton-Robinson缓冲溶液)，按一定比例配制成双水相体系。
其中，所述高分子有机聚合物选自PEG或环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(EOPO)中的至少一种。
优选地，所述PEG为PEG l000-2000，所述共聚物EOPO分子量为1200-2200。
优选地，所述无机盐为硫酸铵；所述分相调节剂为甲醇。
其中，Britton-Robinson缓冲溶液(又称三酸混合液，由浓度均为40mM的磷酸、乙酸、硼酸组成)用0.2M氢氧化钠调节pH至5-8。
优选地，所述双水相体系中，有机聚合物的质量分数为16-22％，无机盐质量分数为10-15％，甲醇质量分数1-2％，Britton-Robinson缓冲溶液的pH为5-7。配制双水相体系的操作温度为20-25℃。
其中，甲醇也可以用乙醇代替；试验发现，通过在双水相体系中添加甲醇或乙醇等醇类可以增加双水相中的上相比，增大上相体积，从而在一定程度上增加神经酰胺的提取率。
作为本发明的进一步优选方案，双水相体系组成为：聚合物的质量分数为18-20％；硫酸铵的质量分数为10-12％，甲醇质量分数1％；Britton-Robinson缓冲溶液pH值为5.5-6.5，操作温度为室温。
2)将上述神经酰胺粗品按一定比例加入到双水相体系中，控制神经酰胺粗品与双水相体系的比例为1-5g:100ml；然后置于摇床或恒温振荡器中，于20-25℃下震荡1-2h，充分混合均匀。
其中，震荡频率可以为200-300rpm。
优选地，神经酰胺粗品与双水相体系的用量比例为2-3g/100ml。
3)将震荡处理后的混合溶液分装于离心管中，于3000-6000rpm的转速下高速离心5-15min进行相分离；上相组分含聚合物和神经酰胺，下相组分为无机盐溶液。将上相溶液通过热诱导相分离法等操作除去高分子聚合物即得到神经酰胺溶液(例如，采用EOPO聚合物时，可将上相溶液加热至60℃以上使得共聚物析出并回收利用)。
进一步地，对下相水溶液进行石油醚萃取，将有机相合并入步骤S1中的发酵液中进行循环利用，以回收残留的神经酰胺组分。
任选地，对所得溶液进行蒸发浓缩，备用。
优选地，将神经酰胺溶液蒸发浓缩至神经酰胺含量5％以上，或者10％以上；通过HPLC进行含量监测。
该步骤中，尽管双水相萃取可以提高神经酰胺的纯度，但是由于双水相萃取后的神经酰胺溶液中仍含有少量蛋白质、核酸等大分子存在，因此需要进一步采用固相萃取进行特异性吸附纯化。
为了排除少量蛋白质、核酸等大分子杂质，可通过蒸馏的方式进行去除。由于分子蒸馏纯化具有操作简单快速、无有机溶剂残留等特点，适合作为大批量纯化的手段。
步骤S3：快速分子蒸馏纯化
具体地，快速分子蒸馏纯化的步骤如下：
取上述浓缩后的神经酰胺浓缩液，在分子蒸馏器的预热器内预热处理后进行分子蒸馏，参数为：真空度为5-50Pa，蒸馏温度150-200℃，进料速度1-5ml/min，冷凝温度5-15℃，刮膜转速200-300r/min；收集沿冷凝柱流出的神经酰胺蒸馏组分。
该分子蒸馏步骤可以有效去除双水相萃取中残留的蛋白质、核酸等杂质；所得神经酰胺溶液经HPLC法测定其中神经酰胺纯度约为90％左右。
经过上述分离之后，大量的原始发酵液已经被分离纯化为较高纯度的神经酰胺产品，此时可进行特异性吸附以进一步精制纯化。
优选地，将上述经过分子蒸馏的神经酰胺用去离子水调配成含量5-50g/L的神经酰胺溶液(优选5-10g/L)，以备使用。
步骤S4：分子印迹法特异性吸附纯化(固相萃取)
该步骤操作流程如下：
1)将所得神经酰胺配制成神经酰胺粗品含量为5-50g/L的溶液(例如神经酰胺粗品用去离子水配制浓度为5-10g/L)，在搅拌条件下加入四氧化三铁基质的分子印迹聚合物微球(聚合物微球与溶液的质量比为1-8:10)，震荡吸附1-2h，然后过滤或在磁场作用下进行固液分离，收集分子印迹聚合物微球；其中，优选地，聚合物微球与溶液的质量比为3-5:10；
进一步地，将分离微球后的溶液加入新的分子印迹聚合物微球，重复进行震荡吸附-固液分离操作若干次，直至母液中基本不含神经酰胺(可通过HPLC取样监测)时合并分子印迹聚合物微球，备用。
其中，该步操作中神经酰胺的量以不超过分子印迹聚合物的最大吸附量为宜；优选地，分子印迹聚合物的加入量远超过所含神经酰胺完全吸附的理论用量。例如，溶液中神经酰胺粗品的质量低于聚合物微球质量的5wt％。
该步骤中也可采用层析柱装填分子印迹聚合物微球进行上样。但是，由于分子印迹聚合物微球颗粒较大导致柱孔隙较大，直接装填进柱进行上样吸附导致神经酰胺在上样时难以完全吸附，且由于柱体积所限，分离效率低。而采用震荡吸附方式则操作简单快捷适合大批量操作，并可以通过调整分子印迹聚合物微球的相对用量比例，使其远远超过理论所需吸附量，使得大批量操作时分离效率快，适合工业化规模生产。
2)将上述合并的分子印迹聚合物微球装柱，依次用1-5倍柱体积的无水乙醇、乙醇-醋酸混合液(乙醇:醋酸体积比为10-15:1)、甲醇-乙酸乙酯混合液(甲醇:乙酸乙酯体积比为1:1-2)洗脱，收集洗脱液直至洗脱液中基本不含有神经酰胺组分，减压浓缩并回收溶剂，得到神经酰胺纯品。
可选地，当装填量较大时，可以对洗脱后的分子印迹聚合物微球在有机溶剂中进行超声处理，以彻底解吸附的神经酰胺分子并进行回收。
该步骤采用层析柱洗脱的方式，便于采用不同组成的洗脱液替换进行洗脱，还可以通过加压手段提高解吸效率。
该步骤通过震荡吸附和上柱洗脱解吸附相结合的方式，避免了上装填柱吸附带来的吸附速率慢、微球间隙导致的吸附效率低以及上样量低的弊端；操作简易，处理量大，洗脱溶剂少且可循环使用，生产成本低，适合大规模工业化生产。
其中，分子印迹聚合物的制备方法如下：
以四氧化三铁磁性纳米微粒为固体微球基质，发酵液中的神经酰胺为模板分子，甲基丙烯酸(或甲基丙烯酸甲酯)以及丙烯酰胺或N-异丙基丙烯酰胺为复合功能单体(质量比10:1-5)，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂制备而成。
示例性地，所述的分子印迹聚合物的制备方法为：
在高压反应釜内，将0.5-2g神经酰胺、3-10g复合功能单体，加入到0.5-1L溶剂(例如，选自乙腈，DMF，氯仿或甲苯)溶液中，充分搅拌均匀；然后加入5-10g四氧化三铁磁性微球，超声分散后加入5-10mL交联剂和0.5-1g偶氮二异丁腈成孔剂，氮气置换气氛后密封反应釜，加热(60-70℃)搅拌反应6-12h，反应完成后冷却，过滤分离得到分子印迹聚合物材料；用乙醇充分洗涤并真空干燥后装柱，用体积比5-10:1的乙醇/乙酸混合溶液和甲醇-乙酸乙酯(1:1)反复洗脱，彻底去除神经酰胺模板分子，直至洗脱液中检测不到神经酰胺，最后用蒸馏水洗涤聚合材料至中性，真空干燥，得到分子印迹聚合物。
其中，所述的四氧化三铁磁性微球的粒径为100-1000nm；优选300-800nm。
任选地，本发明上述方法还包括重结晶步骤，即如下步骤S5：
进一步地，将所得神经酰胺在水浴加热及搅拌条件下用溶剂使其恰好溶解，冷却至室温，然后静置于0-5℃下析晶6-12h；过滤，烘干干燥得到高纯神经酰胺晶体；其HPLC纯度可达98％甚至99％以上。其中，所述溶剂可以选自丙酮、醇等有机溶剂，也可以为含一定量醇(例如10-50％体积比)的去离子水。
第二个方面，本发明提供基于上述方法从发酵液中纯化的神经酰胺纯品，其纯度在95％以上。
第三个方面，本发明还提供所述神经酰胺在皮肤护理领域和药品领域中的应用。
本发明中所述的发酵液原料制备方法是已知的，例如利用神经酰胺生产菌制备含有神经酰胺的发酵液的主要步骤可以为：将菌种按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在28℃条件下震荡培养3d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在28℃条件下震荡培养5d，破壁匀浆，于5℃下高速离心5-15min，收集上清液，得到含有神经酰胺的发酵液；通常，发酵上清液中的神经酰胺原始浓度约为0.1-1g/L。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
(1)本发明对预处理后的发酵液采用特定体系的双水相萃取、快速分子蒸馏和分子印迹聚合物微球特异性吸附相结合的手段，尤其是借助于具有特定模板表面的分子印迹聚合微球的快速吸附-洗脱方法，克服了现有纯化方法通过柱层析色谱无法批量获得高纯度神经酰胺的弊端；本发明方法可以显著提高产品的分离效率和分离纯度，提高提取率(总提取率可高达80％以上)、减少损耗，并达到95％以上的HPLC纯度，适合工业化生产。
(2)本发明方法的处理原料为发酵液，由于发酵液特性所致，尤其是破壁处理后的发酵液，其中含有的成分较杂，远远超过植物提取物。而现有的对发酵液的纯化方法中，通常采用普通萃取和色谱分离方法，但是由于神经酰胺具有亲水亲脂的两亲特性，使得部分神经酰胺存在于水相中，通过多次萃取也使得有机相中保留了大量的其他脂溶性有机杂质，导致后续的色谱分离难以完全去处而且分离效率较低(尽管液相色谱分离较为有效，但是仅适合微量分离和分析；现有的液相色谱不适合对发酵液进行大规模的工业纯化)。而本发明通过双水相二次萃取和分子蒸馏相结合的处理手段，可以有效去除脂溶性杂质及蛋白、核酸等大分子。
另外，由于固液分离后的发酵液中含有大量的包括各种脂肪酸等杂质在内的有机酸类物质，本发明通过加入氢氧化钠进行适度皂化，可使其溶于水从而通过简单萃取除去，在预处理步骤有效降低脂溶性杂质含量。
(3)本发明的以具有磁性的四氧化三铁为微球基质，在表面进行二维化表面处理：神经酰胺为模板分子，在复合功能单体和交联剂作用下热聚合制备得到分子印迹聚合物。该分子印迹聚合物具有较好的特异选择吸附目标物神经酰胺的性能，并可以通过磁性操作进行固液分离，从而高效、高选择性地分离纯化神经酰胺，纯度可达98％以上，且通过特定的操作具有较高的回收率。操作简单、成本低廉。
(4)本发明创新性采用水溶液条件下的分子印迹聚合物对神经酰胺的震荡吸附的方式，克服了采用装柱进行上样吸附带来的吸附量小、效率低的缺陷：由于分子印迹聚合物微球颗粒较大导致柱孔隙较大，直接装填进柱进行上样吸附导致神经酰胺在上样时难以完全吸附，且柱吸附由于柱体积所限，处理量低。而采用震荡吸附方式则操作简单快捷、适合大批量操作；重要的是，可以通过调整提高分子印迹聚合物微球的相对用量比例，使其远远超过溶液中神经酰胺的量，使得适合大批量操作，分离效率快，适合工业化规模生产。
其中，相应地，在解吸附时，采用复合有机溶剂轮流洗脱的方式，便于彻底洗脱，还可以通过加压手段提高解吸效率(在吸附阶段采取水代替有机溶剂，避免了神经酰胺在有机溶剂中易溶解带来的解吸附效应，抑制了吸附-解吸平衡向解吸附方进行)。因此，本发明通过水相中的震荡吸附和有机相条件下的洗脱解吸附相结合的方式，可以达到快速高效特异性分离纯化神经酰胺的目的，所用溶剂少且分子印迹聚合物微球可循环使用(提取中采用的溶剂经回收后可再次作为提取溶剂重复使用，减少溶剂的消耗)，生产成本低。
(5)本发明纯化方法适用的发酵液原料和神经酰胺/衍生物产物的范围广(除了分子印迹分离步骤外，无需考虑发酵液中具体的神经酰胺分子结构)，原料可以来自各种发酵方法获得的神经酰胺及其衍生物发酵液，例如菌体破壁所得粗产物，或者发酵液中存在的神经酰胺类产物(现已存在能分泌大量神经酰胺类物质到发酵液中的菌种，不需要菌体破壁等衍生化过程)，均可适用。另外，由于神经酰胺类分子结构具有高度的相似性和共有结构，在分子印迹纯化步骤采取常见的神经酰胺作为模板分子即可。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些实施方式并非对本发明的保护范围构成任何形式的限定。
制备例
制备神经酰胺分子印迹聚合物
将1g神经酰胺模板分子(Ceramide，cas 104404-17-3，米糠提取物纯化)、3g复合功能单体(2.4g甲基丙烯酸和0.6g丙烯酰胺)，加入到680mL DMF/氯仿(体积比2:1)溶剂中，室温搅拌0.5h；然后加入6g四氧化三铁磁性纳米微球(粒径500nm)，超声分散；分散均匀后加入5mL二甲基丙烯酸乙二醇酯交联剂和0.7g偶氮二异丁腈，通入氮气置换反应体系气氛，密封后加热至65℃搅拌反应10h，冷却，过滤分离得到分子印迹聚合物材料；将材料用乙醇充分洗涤并真空干燥；装柱，先用体积比5:1的乙醇/乙酸混合溶液再用体积比1:1的甲醇-乙酸乙酯反复洗脱干燥后的聚合材料，除去聚合材料中的模板分子(洗脱的神经酰胺模板分子回收并循环利用)，直至洗脱液中检测不到神经酰胺分子，最后用蒸馏水洗涤洗脱后的聚合材料至中性，真空干燥，得到分子印迹聚合物，备用。
实施例1
基于发酵液的神经酰胺分离纯化方法(其中发酵液由酵母菌发酵米糠培养基得到，发酵条件参考CN109943602 A中的方法)；包括以下步骤：
S1：过滤除杂和初步萃取预处理
1)将经过均质机破壁匀浆处理和离心固液分离后的约1L发酵液上清(其中神经酰胺含量约0.16wt％)，进行微滤过滤处理去除残留固体杂质后进行真空蒸发浓缩，浓缩后通过250nm规格的陶瓷滤膜进行超滤过滤，得到基本不含固体杂质的除杂滤液；
2)初步萃取：向除杂滤液中加入氢氧化钠溶液调整pH至8.5，加热至50℃，搅拌30min；然后加入等体积的石油醚进行萃取，并对萃取后的水相采用0.5倍体积的石油醚/乙酸乙酯(5:1体积比混合)混合萃取溶剂重复萃取3次，合并有机相；将合并后的有机相蒸发浓缩并回收有机溶剂，对所得固体产品烘干干燥，即可得到含神经酰胺的粗品原料。
S2：双水相萃取
1)双水相体系的配制
称取EOPO无规共聚物(分子量约2000)18g，硫酸铵12g，无水甲醇1g，室温下加入至适量Britton-Robinson缓冲溶液(用0.2M氢氧化钠调pH值为6)中，使得体系总重量为100g；从而配置体系组成为聚合物18％(w/w)、硫酸铵12％(w/w)、甲醇1％(w/w)的双水相体系；
2)将上述步骤S1中经过干燥处理的神经酰胺粗品原料按照1g:50ml的比例加入到双水相体系中，然后将体系置于恒温振荡器中，在25℃下振荡1.5h(振荡频率280rpm)，使两相充分混合均匀；
3)将混合均匀后的溶液体系分装入带盖离心管中，置于离心机中以4000转/分钟的转速离心10min，使得离心管中的液体通过离心分离形成两相，离心完成后分离体系的上下相；其中上相组分主要是高分子聚合物和神经酰胺，将上相溶液加热进行相诱导分离除去聚合物，从而得到神经酰胺溶液，经HPLC法测定其中神经酰胺纯度约为75.2％。
将神经酰胺溶液蒸发浓缩至约10wt％。下相溶液用石油醚萃取后将有机相合并入步骤S1的有机萃取液中。
S3：取上述浓缩后的神经酰胺浓缩液，在分子蒸馏器的预热器内预热处理后进行分子蒸馏，其中在真空度为25Pa，蒸馏温度185℃，进料速度2ml/min，冷凝温度8℃，刮膜转速250r/min的条件下进行分子蒸馏，收集神经酰胺馏出组分，经HPLC法测定其中神经酰胺纯度为90.6％。
将上述经过分子蒸馏的神经酰胺用去离子水调配成浓度为10g/L的神经酰胺溶液，备用。
S4：分子印迹法特异性吸附纯化(固相萃取)
1)将上述调整浓度后的神经酰胺溶液在搅拌条件下加入上述制备例方法制备的四氧化三铁基质的分子印迹聚合物微球约50g，室温下在摇床上震荡1h，然后利用磁铁的磁场作用下进行固液分离，收集吸附目标分子的聚合物微球；进一步地，将分离微球后的溶液加入新的分子印迹聚合物微球，重复进行震荡吸附-固液分离操作3次，至母液中基本不含神经酰胺，合并分子印迹聚合物微球；将分离微球后的母液合并入发酵液中进行循环套用。
2)将上述合并后的分子印迹聚合物微球装柱，依次用3倍柱体积的无水乙醇、2倍柱体积的乙醇-醋酸混合液(体积比为10:1)、3倍柱体积的甲醇-乙酸乙酯混合液(体积比为1:1)洗脱，收集洗脱液，减压浓缩并回收溶剂，将浓缩液蒸干，得到固体神经酰胺纯品1.32g，总提取率约82％，经HPLC法测定其中神经酰胺纯度为97.6％。
进一步地，洗脱后的分子印迹聚合物微球在石油醚溶剂中进行超声震荡处理，将石油醚合并入步骤S1中的石油醚萃取溶剂中以回收残留神经酰胺循环套用。
其中，该实施例HPLC分析的参数为(下同)：使用C18反相柱，柱温30℃；流动相：0.1％醋酸:甲醇＝10:90；流速0.8mL/min，进样量20微升，紫外检测波长为254nm。
实施例2
发酵液原料同上；包括以下步骤：
S1：过滤除杂和初步萃取预处理
1-1)将经过均质机破壁匀浆处理和离心固液分离后的约1L发酵液上清，进行微滤过滤处理去除残留固体杂质后进行真空蒸发浓缩，浓缩后通过陶瓷滤膜进行超滤过滤，得到基本不含固体杂质的除杂滤液；
1-2)向除杂滤液中加入氢氧化钠溶液调整pH至8，加热至50℃，搅拌30min；然后加入等体积的石油醚进行萃取，并对萃取后的水相采用0.5倍体积的石油醚/乙酸乙酯(5:1体积比混合)混合萃取溶剂重复萃取3次，合并有机相；将合并后的有机相蒸发浓缩并回收有机溶剂，对所得固体产品烘干干燥，即可得到含神经酰胺粗品的原料。
S2：双水相萃取
2-1)双水相体系的配制
称取EOPO无规共聚物(分子量约2000)20g，硫酸铵10g，无水甲醇1g，室温下加入至适量Britton-Robinson缓冲溶液(用0.2M氢氧化钠调pH值为6)中，使得体系总重量为100g；从而配置体系组成为聚合物20％(w/w)、硫酸铵10％(w/w)、甲醇1％(w/w)的双水相体系；
2-2)将上述步骤S1中神经酰胺粗品原料按照1g:60ml的比例加入到双水相体系中，然后将体系置于恒温振荡器中，在25℃下振荡1h(振荡频率260rpm)，使两相充分混合均匀；
2-3)将混合均匀后的溶液体系分装入带盖离心管中，置于离心机中以3000转/分钟的转速离心15min，使得离心管中的液体通过离心分离形成两相，离心完成后分离体系的上下相；将上相含有神经酰胺的溶液加热进行相诱导分离除去聚合物，从而得到神经酰胺溶液，经HPLC法测定其中神经酰胺纯度为73.6％。
将神经酰胺溶液蒸发浓缩至约15wt％。下相溶液用石油醚萃取后将有机相合并入步骤S1的有机萃取液中循环套用。
S3：取上述浓缩后的神经酰胺浓缩液，在分子蒸馏器的预热器内预热处理后进行分子蒸馏，其中在真空度为20Pa，蒸馏温度170℃，进料速度3ml/min，冷凝温度10℃，刮膜转速250r/min的条件下进行分子蒸馏，收集神经酰胺馏出组分，经HPLC法测定其中神经酰胺纯度为88.7％。
将上述经过分子蒸馏的神经酰胺用去离子水调配成浓度约为10g/L的神经酰胺溶液，备用。
S4：分子印迹法特异性吸附纯化
4-1)将上述调整浓度后的神经酰胺溶液在搅拌条件下加入上述制备例方法制备的四氧化三铁基质的分子印迹聚合物微球约45g，室温下在摇床上震荡1h，然后过滤进行进行固液分离，收集聚合物微球固体；进一步地，将分离微球后的溶液加入适量新的分子印迹聚合物微球，重复进行震荡吸附-固液分离操作2次，直至母液中基本不含神经酰胺，合并分子印迹聚合物微球；将分离微球后的母液合并入发酵液中进行循环套用。
4-2)将上述合并后的分子印迹聚合物微球装柱，依次用2倍柱体积的无水乙醇、2倍柱体积的乙醇-醋酸混合液(体积比为10:1)、3倍柱体积的甲醇-乙酸乙酯混合液(体积比为1:1)洗脱，收集洗脱液，减压浓缩并回收溶剂，将浓缩液蒸干，得到白色固体神经酰胺纯品1.26g，经HPLC法测定其中神经酰胺纯度为96.8％。总提取率约80％。
其中，对洗脱后的分子印迹聚合物微球在石油醚溶剂中进行超声震荡处理，将石油醚合并入步骤S1中的石油醚萃取溶剂中以回收残留神经酰胺，循环套用。
S5：重结晶：将所得神经酰胺固体在65℃水浴加热及搅拌条件下用50％的乙醇水溶液使其恰好溶解，冷却至室温，然后静置于0-2℃下析晶10h；过滤，将所得晶体烘干干燥得到HPLC纯度为99.2％的高纯神经酰胺晶体；结晶母液可合并入步骤S1或S2的原料中循环套用。
对比例1
除了不含步骤S2之外(即将S1中的粗品原料直接配制成水溶液进行步骤S3的分子蒸馏)，其余操作条件按照实施例1的方法进行纯化，所得神经酰胺HPLC终纯度为92.7％。总提取率约87％。
对比例2
除了不含步骤S3之外(即双水相萃取后直接采用固相萃取，中间不经分子蒸馏除杂)，其余操作条件按照实施例1的方法进行纯化，所得神经酰胺HPLC终纯度为94.3％。总提取率约85％。
上述对比例1-2由于减少了中间分离环节步骤，尽管可以在一定程度上提高总的提取率，降低产物损耗，但是产物的纯度明显有所降低。
对比例3
对发酵液直接进行HPLC分离，步骤如下：
将实施例1中的经过均质机破壁匀浆处理和离心固液分离后的发酵液上清1ml，进行陶瓷滤膜超滤过滤和高速离心处理，去除残留固体杂质和多糖等大分子杂质后，直接进行HPLC分离；HPLC分离使用C18反相柱，甲醇-水系统洗脱。液相色谱所得神经酰胺的纯度为89.2％，显著低于本发明实施例。
相比较现有技术(例如CN106119310A)，对比例3对发酵液进行直接色谱分离产物纯度降低，这可能是由于菌体破壁后使得杂质尤其是蛋白、核酸类杂质显著增多导致；而这些能够干扰紫外检测的杂质仅通过超滤和高速离心不能完全去除，从而影响了色谱分离效率。
综上，本发明针对发酵液量大、杂质多且神经酰胺含量低的特点，结合神经酰胺类物质具有两亲性质特性，在纯化步骤中的前期进行超滤、碱化和多次重复萃取等预处理，在保证提取率的基础上显著降低了杂质含量，得到了提高目标物纯度的预处理发酵液，并显著降低了处理量，这对于后期纯化提供了便捷性。在后续主要的纯化分离步骤中，联合采用双水相萃取-固相萃取的联合萃取工艺，并结合分子蒸馏进一步除杂，使得特异性吸附萃取之后即使不采取重结晶手段，也获得了高纯度的产品，满足食品和护肤化妆领域的纯度要求；进一步地，重结晶后可以达到药品领域的纯度要求。
以上实施例并非限制本发明的技术方案，本领域的普通技术人员可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，这些修改或者替换并不脱离本发明技术方案的范围。