(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物及其在抗关节炎药物中的应用
阅读说明：本技术 (4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物及其在抗关节炎药物中的应用 ((4- (1,2, 4-oxadiazole-5-yl) phenyl) formamide derivatives and application thereof in anti-arthritis drugs ) 是由 李增 李俊 吕熊文 刘彤彤 陈世明 黄成� 孟晓明 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物治疗学领域,具体涉及(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物的医药学用途,特别是其在制备预防或治疗关节炎药物中的应用。该化合物的结构式如式A所示：研究表明,本发明所涉及的(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物能够抑制NO,IL-1β和TNF-α的释放,减轻佐剂型关节炎大鼠模型的症状,具有发展成为抗关节炎药物的潜力。(The invention belongs to the field of pharmacotherapeutics, and particularly relates to a medical application of a (4- (1,2, 4-oxadiazole-5-yl) phenyl) formamide derivative, in particular to an application of the derivative in preparing a medicament for preventing or treating arthritis. The structural formula of the compound is shown as a formula A: research shows that the (4- (1,2, 4-oxadiazole-5-yl) phenyl) formamide derivative provided by the invention can inhibit the release of NO, IL-1 beta and TNF-alpha, relieve the symptoms of an adjuvant arthritis rat model, and has the potential of developing into an anti-arthritis drug.)
技术领域
本发明属于药物治疗学领域，具体涉及一种4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物及其在制备预防或治疗关节炎药物中的应用。
背景技术
炎症是各种伤害的因素引起的机体常见病理过程，由多种炎症介质介导产生，主要包括前列腺素类(PGs)和白三烯类(LTs)。免疫是机体接触抗原性异物或异已成份的一种特异性生理反应，其作用是识别、排除抗原性异物，以维持机体的生理平衡。免疫反应和炎症反应都是机体保护性防御反应，然而过度的免疫和炎症对人体又是有害的。免疫和炎症是机体对异物的两种不同反应，但细观其实质，免疫和炎症是一个问题的两个侧面，两者互相重叠，不可分割。临床使用最广泛的抗炎免疫药物是非甾体抗炎药(NSAIDs)和甾体抗炎药，但它们在取得良好抗炎效果的同时又都存在着严重的不良反应，日益引起人们的重视，如何降低不良反应或找到替代药物是药学最重要的研究任务之一。
关节炎是许多自身免疫性疾病中的一种，自身抗体的存在会触发免疫细胞释放炎症分子，从而对关节和其他器官系统造成损害。当前抗细胞因子疗法(例如肿瘤坏死因子(TNF-α)，白介素(IL-1β))已经在自身免疫疾病的治疗中得到应用。因此，在新药设计和研发过程中，可以根据药物活性是否可以抑制炎症因子NO，IL-1β和TNF-α的释放，筛选出具有抗关节炎潜力的化合物。结合分析化合物对佐剂诱导的关节炎模型的治疗情况等研究，可以为医药学领域中关节炎的治疗发展提供实验基础。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的之一在于提供一种(4-(1,2,4-恶二唑- 5-基)苯基)甲酰胺衍生物，本发明采用的技术方案如下：一种(4-(1,2,4-恶二唑-5- 基)苯基)甲酰胺衍生物，该衍生物命名为f9，其结构式如下式A所示：
该(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9的制备路线如下：
制备路线主要为了解释说明本发明，而不是对其进行任何限制。
i.根据文献所报道的方法，用2-氯-4-氰基吡啶与各种苯胺发生亲核取代反应，柱层析纯化粗产品得到化合物a；
ii.化合物a与盐酸羟胺在K2CO3作用下反应生成化合物b；
iii.化合物b与4-硝基苯甲酰氯反应得到化合物c；
iv.化合物c经过还原反应得到中间体d；
v.化合物d与氯乙酰氯发生取代反应得到化合物e；
vi.将中间体e溶于无水乙醇中，与对氟苯胺反应(75℃)，柱层析纯化即得到(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9。
本发明的目的之二在于提供上述的(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物在制备抑制一氧化氮NO产生和/或抑制肿瘤坏死因子TNF-α产生和/或抑制白介素IL-1β产生药物中的应用。
进一步的，所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂中任意一种。
本发明的目的之三在于提供上述的(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物在治疗关节炎疾病药物中的应用。
进一步的，所述关节炎为类风湿性关节炎。
进一步的，所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂中任意一种。
本发明的优点为：
1.通过在LPS诱导的RAW264.7细胞中添加(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9，实验测定结果表明本发明提供的(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9能够很好地抑制NO、IL-1β和TNF-α的分泌与释放。
2.通过体内实验，(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9可以明显的治疗佐剂诱导的关节炎大鼠，表明该(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9 有潜力发展成为治疗关节炎疾病的药物。
附图说明
图1为当RAW264.7细胞被LPS刺激后，不同浓度的(4-(1,2,4-恶二唑-5-基) 苯基)甲酰胺衍生物f9对NO释放的影响；
图2当RAW264.7细胞被LPS刺激后，不同浓度的(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9对IL-1β和TNF-α释放的影响；
图3为佐剂诱导的关节炎模型试验中不同组大鼠右后足对比图；
图4为佐剂诱导的关节炎模型试验中不同组大鼠足肿胀变化，图中横坐标为时间，纵坐标为足体积；
图5为佐剂诱导的关节炎模型试验中不同组的关节炎指数，图中横坐标为时间，纵坐标为关节炎指数；
图6为在佐剂诱导的关节炎模型试验中不同组大鼠体重变化图，图中横坐标为时间；
图7为在佐剂诱导的关节炎模型试验中不同组大鼠体内IL-1β和TNF-α水平变化图，其中图7A为IL-1β，图7B为TNF-α，图中横坐标为时间。
具体实施方式
除非另有说明，本文中所使用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义。
下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明：
实施例1
(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9的合成：
将化合物e(294mg，0.6mM)溶于80mL无水乙醇中，随后加入对氟苯胺 (889mg，4.8mM)与三乙胺(101mg，1.2mM)，于75℃回流8h。TLC检测反应进程。反应结束后，除去反应溶剂。通过柱层析中以乙酸乙酯:石油醚(1:4) 纯化即得到化合物f9，化合物f9为白色固体，产率56％。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.48(s,1H),9.67(s,1H),8.37(d,J＝5.3Hz, 1H),8.14(d,J＝8.8Hz,2H),7.93(d,J＝8.8Hz,2H),7.86(d,J＝9.2Hz,2H),7.57 (s,1H),7.35(dd,J＝5.2,1.4Hz,1H),7.30(d,J＝8.6Hz,2H),6.97(t,J＝8.9Hz, 2H),6.63(dd,J＝9.0,4.5Hz,2H),6.03(t,J＝6.1Hz,1H),3.94(d,J＝5.8Hz,2H)；13C NMR(126MHz,DMSO)δ48.28,109.26,113.53,113.59,115.67,115.85,118.00, 119.56,119.71,119.87,121.73,122.07,129.54,135.11,141.02,142.23,143.91, 145.42,149.03,154.24,156.08,156.68,167.50,170.62,176.05。
HRMS(ESI)m/z[M+H]+:565.15666calcd for C28H20F4N6O3:565.15985。
实施例2
(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9的抗炎活性实验
1)实验材料：(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9(实验室自行设计合成)，NO检测试剂盒(碧云天)，RAW264.7(安徽医科大学药学院)，ELASA 试剂盒(基因美，武汉)，酶标仪(BIO-RAD公司)、倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)；试剂：细胞培养基、DMEM(高糖)(GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季清有限公司)、DMSO(Sigma公司)。
2)细胞培养：
本实验所用的RAW264.7巨噬细胞为贴壁生长细胞株，采用含10％胎牛血清的DMEM培养液进行培养。培养环境为37℃，5％CO2培养箱，每天更换一次培养液，取处于对数生长期的细胞进行实验。
3)抑制NO释放实验：
在LPS诱导的RAW264.7细胞模型中，通过测试化合物抑制NO的释放情况来评估其抗炎能力。
将RAW264.7细胞培养在DMEM高糖培养基中，该培养基额外补充有10％胎牛血清、青霉素100U/mL和链霉素100U/mL。将RAW264.7细胞以每孔6×104个接种于48孔板培养24h后，弃掉旧培养基。然后用预先配制的不同浓度含(4- (1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9的培养基预处理1小时，与浓度为 1μg/ml LPS共孵育24小时。取50μL上清于96孔板中，加入相同体积Griess assay agent混合，室温孵育10分钟，在540nm下用多功能酶标仪测定吸光度。结果如图1所示，从图1可以看出，随着(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9用量由0.78125μM增加至12.5μM,NO的浓度逐渐降低，表明(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9以剂量依赖的方式抑制了LPS诱导的 RAW264.7细胞中NO的释放(IC50＝1.981μM)。
4)TNF-α和IL-1β炎症因子的抑制作用
在LPS诱导的RAW264.7细胞模型中，通过测试(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9对炎症因子TNF-α和IL-1β的抑制作用来进一步评估其潜在抗炎能力。
将RAW264.7细胞以每孔6×104个接种于48孔板中培养24h后，加入含不同浓度的含(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9的培养基。1小时后加入30μL LPS(1μg/mL)，共孵育24小时。然后吸取上清，依照ELASA试剂盒操作说明书进行测定。结果如图2所示，从图2可以看出，(4-(1,2,4-恶二唑-5- 基)苯基)甲酰胺衍生物f9能够抑制IL-1β和TNF-α炎症因子的释放，并且对IL- 1β(IC50＝5.94±0.35μM)的抑制作用的大于TNF-α(IC50＝10.23±1.04μM)。
实施例3
佐剂诱导的关节炎模型试验
实验材料：Sprague-Dawley雌性大鼠，体重160-180g，购自安徽中医药大学动物实验中心。动物房每天的温度、相对湿度和暗光循环分别保持在23℃- 25℃、40％-60％。
2.佐剂性关节炎的诱导和实验设计
将0.1mL弗氏完全佐剂(FCA)皮内注射到大鼠左后足以引起炎症。正常组大鼠在同一部位注射等量生理盐水。
FCA注射10天后，将大鼠随机分为四组。其中两组为药物组，药物组分别给予(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9(10mg/kg和30mg/kg)治疗14天，阳性对照组大鼠给予吲哚美辛Indometacin(10mg/kg)治疗14天，另一组设为模型组Model，每天给予生理盐水。
结果如图3-6所示，图3为不同处理组的大鼠足部对比，图4为不同组大鼠足部体积的变化图。由图3和图4可看出与模型组相比，药物组以浓度依赖性方式减轻了大鼠的足部肿胀。此外，由图5可以看出，30mg/kg的(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9明显降低了大鼠的关节炎指数。图6表明，与模型组相比，给予药物后的大鼠体重有所改善。
3.体内IL-1β和TNF-α水平检测
大鼠被麻醉后，从心脏动脉采血。静置30分钟，血样在4℃下以3000r/min 的速度离心10分钟以收集血清。通过ELISA测定血清中IL-1β和TNF-α的水平。结果如图7A、图7B所示，可以看出，与模型组相比，(4-(1,2,4-恶二唑-5- 基)苯基)甲酰胺衍生物f9可以以剂量依赖的方式降低大鼠血清中的炎症因子IL- 1β和TNF-α的水平。
实验证明(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9可以抑制细胞NO、 IL-1β和TNF-α的释放与分泌，并明显的治疗佐剂诱导的关节炎大鼠，表明本发明提供的(4-(1,2,4-恶二唑-5-基)苯基)甲酰胺衍生物f9有潜力发展成为治疗关节炎疾病药物。
以上仅为本发明的较佳实用例而已，并不用以限制本发明创造；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
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