阅读说明：本技术 苯并噁嗪酮类衍生物及其应用 (Benzoxazine ketones derivant and its application ) 是由 李锐 魏于全 于 2018-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及苯并噁嗪酮类衍生物及其应用,属于抗肿瘤药物技术领域。本发明解决的技术问题是提供一种新的苯并噁嗪酮衍生物,该化合物的结构式如式Ⅰ所示。本发明设计合成了一系列以苯并噁嗪酮为母核的新化合物,该化合物可以抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,达到较好的抑制肿瘤细胞增殖的效果。<Image he="320" wi="356" file="DDA0001722173430000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The present invention relates to benzoxazine ketones derivant and its applications, belong to anti-tumor drug technical field.The technical problem to be solved by the present invention is to provide a kind of new benzoxazine ketone derivatives, and the structural formula of the compound is as shown in formula I.Present invention design has synthesized a series of using benzoxazinone as the noval chemical compound of parent nucleus, which can inhibit PI3K/Akt/mTOR signal path, achieve the effect that preferably to inhibit tumor cell proliferation.)

苯并噁嗪酮类衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及苯并噁嗪酮类衍生物及其应用，属于抗肿瘤药物技术领域。

背景技术

PI3K/Akt/mTOR信号通路主要包含磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(PKB/Akt)、和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)三个成员。PI3K是一种酯酶，静息状态下主要存在于胞质中；PI3K被完全激活后催化底物PIP2转变为PIP3，PIP3作为第二信使激活下游的Akt。Akt为PI3K下游关键蛋白，是一种进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，静息状态下多位于细胞质中；被激活的Akt可磷酸化抑制TSC1/2的形成，进而使Rheb释放出来，最终激活下游mTORC。mTOR属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，拥有mTORC1和mTORC2两个亚型，它是细胞生长和增殖的重要调节因子；当细胞受到外界营养因子或生长因子信号刺激时，胞内mTOR可以激活下游一些相关靶蛋白，进而对整个细胞的代谢与生长进行正向或负向调控。PI3K/Akt/mTOR信号通路参与调节细胞的多种生命过程，比如：细胞的生长和增殖、蛋白的合成、转录和代谢过程。现有的研究表明，PI3K/Akt/mTOR信号通路在肿瘤的发生发展中有着至关重要的作用，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路被认为是一种有前途的抗癌疗法。

目前，针对该PI3K/Akt/mTOR信号通路所设计的抗肿瘤药物不胜枚举，比如，ATP竞争性的PI3K和mTOR抑制剂BEZ235、多靶点PI3K抑制剂PI-103、mTOR单抑制剂雷帕霉素等。可是，在实际研究中，发现，现有的化合物存在一些缺陷。例如，mTOR单抑制剂易导致药物抵抗，雷帕霉素衍生物抑制mTOR时会产生Akt的反馈性激活，导致PI3K信号通路的重新激活，因此雷帕霉素在体外肿瘤细胞抑制实验中对肿瘤细胞的抑制能力有限。

专利US2010/0311736 A1公开了以N-3-吡啶基-4-氟苯磺酰胺为母核的化合物，其中有两个含有苯并噁嗪酮结构，N-6位通过亚甲基与苯环链接。但是，通过研究发现，该化合物对PI3Kα的抑制率有限，甚至部分抑制活性很低，我们经过对PI3Kα晶体结构的研究，发现N-6位与苯环直接偶联所得到的分子活性远优于通过亚甲基与苯环偶联。

发明内容

本发明的目的是研究开发具有抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的新化合物，用于治疗和预防与PI3K/Akt/mTOR信号异常相关的癌症。

本发明解决的技术问题是提供一种新的苯并噁嗪酮衍生物，该化合物可成功抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路。

本发明苯并噁嗪酮衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：

式Ⅰ

其中，R₁为C3-C6环烷基、杂环基或R₆为单取代或多取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；

R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N，X₂为C或N。

本发明还提供本发明所述的苯并噁嗪酮类衍生物的异构体、可药用的盐以及水合物。

本发明还提供本发明所述的苯并噁嗪酮类衍生物用于生产抑制哺乳动物体内PI3K/Akt/mTOR信号通路的药物的用途。

本发明还提供本发明所述的苯并噁嗪酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物由有效成分和药学上可接受的辅料组成，所述有效成分包含治疗有效量的本发明所述的苯并噁嗪酮类衍生物或其异构体或可药用的盐或水合物。

本发明还提供所述的苯并噁嗪酮类衍生物用于制备DNA-PK抑制剂的用途。

优选的，所述苯并噁嗪酮类衍生物为化合物C5-1。

本发明设计合成了一系列以苯并噁嗪酮为母核的新化合物，该化合物可以抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，达到较好的抑制肿瘤细胞增殖的效果。此外，本发明的化合物可以作为DNA-PK抑制剂，对DNA-PK具有良好的抑制活性。

附图说明

图1为不同浓度的化合物C5-1对Hela细胞的平板克隆照片。

图2为不同浓度的化合物C5-1对Hela细胞的平板克隆集落数统计。

图3为Hela移植瘤模型给药时间与肿瘤体积的变化。

图4为A549移植瘤模型给药时间与肿瘤体积的变化。

图5为Hela移植瘤模型给药时间与小鼠体重的变化。

图6为A549移植瘤模型给药时间与小鼠体重的变化。

具体实施方式

本发明苯并噁嗪酮衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：

式Ⅰ

其中，R₁为C3-C6环烷基、杂环基或R₆为单取代或多取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N，X₂为C或N。

优选的，R₁为C3-C6环烷基、杂环基或R₆为单取代或多取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N。优选的，R₁为C3-C6环烷基、杂环基或R₆为单取代或多取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素。优选的，R₁为C3-C6环烷基、杂环基或R₆为单取代或多取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₁为C3-C6环烷基、杂环基或R₆为单取代或多取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₁为C3-C6环烷基、杂环基或R₆为单取代或多取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氯或甲氧基，R₅为氢或卤素。

优选的，R₁为C3-C6环烷基、杂环基或R₆为单取代或多取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为X₂为C或N。进一步优选X₂为N。

进一步优选的，R₁为C3-C6环烷基或R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N，X₂为C或N。

优选的，R₁为C3-C6环烷基或R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N。优选的，R₁为C3-C6环烷基或R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素。优选的，R₁为C3-C6环烷基或R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₁为C3-C6环烷基或R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₁为C3-C6环烷基或R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氯或甲氧基，R₅为氢或卤素。

优选的，R₁为C3-C6环烷基或R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为X₂为C或N。进一步优选X₂为N。

进一步优选的，R₁为环丙基、环己基、苯环、或者被卤素、甲基或甲氧基单取代的苯基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N，X₂为C或N。

优选的，R₁为环丙基、环己基、苯环、或者被卤素、甲基或甲氧基单取代的苯基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N。优选的，R₁为环丙基、环己基、苯环、或者被卤素、甲基或甲氧基单取代的苯基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素。优选的，R₁为环丙基、环己基、苯环、或者被卤素、甲基或甲氧基单取代的苯基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₁为环丙基、环己基、苯环、或者被卤素、甲基或甲氧基单取代的苯基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₁为环丙基、环己基、苯环、或者被卤素、甲基或甲氧基单取代的苯基，R₂为R₃为氯或甲氧基，R₅为氢或卤素。

优选的，R₁为环丙基、环己基、苯环、或者被卤素、甲基或甲氧基单取代的苯基，R₂为X₂为C或N。进一步优选X₂为N。

作为其中一种优选方式，其结构式如式Ⅱ所示：

式Ⅱ

其中，R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N，X₂为C或N。

优选的，R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N。优选的，R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素。优选的，R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为R₃为氯或甲氧基，R₅为氢或卤素。

优选的，R₆为单取代基，R₆选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、硝基或被羟基、氨基、硝基取代的C1-C4烷基；R₂为X₂为C或N。进一步优选X₂为N。

进一步优选的，R₆为氯、溴、甲基或甲氧基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N，X₂为C或N。

优选的，R₆为氯、溴、甲基或甲氧基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N。优选的，R₆为氯、溴、甲基或甲氧基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素。优选的，R₆为氯、溴、甲基或甲氧基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₆为氯、溴、甲基或甲氧基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₆为氯、溴、甲基或甲氧基，R₂为R₃为氯或甲氧基，R₅为氢或卤素。

优选的，R₆为氯、溴、甲基或甲氧基，R₂为X₂为C或N。进一步优选X₂为N。

更优选的结构式如式Ⅲ所示：

式Ⅲ

式Ⅲ中的基团选择与式Ⅱ相同，仅是将式Ⅱ中的R₆限定为对位取代基。

作为另一种优选方式，式Ⅰ中的R₁为C3-C6环烷基；R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N，X₂为C或N。

优选的，R₁为C3-C6环烷基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N。优选的，R₁为C3-C6环烷基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素。优选的，R₁为C3-C6环烷基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₁为C3-C6环烷基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₁为C3-C6环烷基，R₂为R₃为氯或甲氧基，R₅为氢或卤素。

优选的，R₁为C3-C6环烷基，R₂为X₂为C或N。进一步优选X₂为N。

进一步优选的，R₁为环丙基或环己基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N，X₂为C或N。

优选的，R₁为环丙基或环己基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素，X₁为C或N。优选的，R₁为环丙基或环己基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₄为氢或R₅为氢或卤素。优选的，R₁为环丙基或环己基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₁为环丙基或环己基，R₂为R₃为氢、C1-C4烷氧基、卤素或羟基，R₅为氢或卤素。优选的，R₁为环丙基或环己基，R₂为R₃为氯或甲氧基，R₅为氢或卤素。

优选的，R₁为环丙基或环己基，R₂为X₂为C或N。进一步优选X₂为N。

以下为本发明优选的结构式。

本发明苯并噁嗪酮类衍生物的制备方法，可采用常规的方法，具体的制备方法详见实施例1。

本发明还涉及如通式Ⅰ所示化合物的异构体、可药用的盐以及水合物。其中，可药用的盐包括但不限于通式Ⅰ化合物与无机酸如盐酸、硫酸、磷酸、亚磷酸、氢溴酸和硝酸所成的盐以及与各种有机酸，如苹果酸、马来酸、柠檬酸、延胡索酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、棕榈酸等所成的盐。本发明中的一些化合物可能用水或各种有机溶剂结晶或重结晶，在这种情况下，可能形成各种溶剂化物。本发明包括那些化学计量的溶剂化物，包括水合物，也包括在用低压升华干燥法制备时形成的包含可变量水的化合物。

本发明的苯并噁嗪酮类衍生物，可用于生产抑制哺乳动物体内PI3K/Akt/mTOR信号通路的药物。

本发明的苯并噁嗪酮类衍生物，还可用于制备抗肿瘤药物。

本发明的化合物或其可药用的盐可以单独使用，也可与可药用的载体或赋形剂一起以药物组合物的形式使用，当以药物组合物的形式使用时，通常将治疗有效量的本发明化合物或其可药用盐或水合物以及一种或多种可药用载体或稀释剂结合制成适当的施用形式或剂量形式。因此，本发明还提供了药物组合物，它包含治疗有效量的本发明所述的苯并噁嗪酮类衍生物、其所有可能的异构体或其可药用的盐或水合物以及至少一种可药用的载体。

本发明化合物的药用组合物，可以以下方面的任意方式施与：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、***给药、局部给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、销内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选口服、肌注、腹膜内或静脉内用药方式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、温悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、温悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、埋植剂、贴剂、擦剂等。

本发明的药物组合物中还可以含有常用的载体，这里所述可药用载体包括但不局限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二纳，磷酸氢钾，氧化纳，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素纳，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛酯等。载体在药物组合物中的含量(重量比)可以是1～98％，通常大约占到80％。为方便起见，局部麻醉剂，防腐剂，缓冲剂等可直接溶于载体中。

本发明还提供所述的苯并噁嗪酮类衍生物用于制备DNA-PK抑制剂的用途。

优选的，所述苯并噁嗪酮类衍生物为化合物C5-1。

本发明中，“C1-C6烷基”是指具有1～6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基等。“C1-C4烷基”是指具有1～4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等。

“C1-C4烷氧基”是指具有1～4个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。

“单取代”是指只有一个氢原子被取代。

“多取代”是指有至少两个氢原子被取代，取代基可以相同也可以不同。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1化合物的合成

1、中间体的合成

中间体2-氯-N-环己基乙酰胺(a1)的制备

将原料环己胺(3g，30mmol)溶于25mL乙腈中，加入碳酸钾(6.2g，45mmol)。冰浴下搅拌20min使其充分混匀。再缓慢滴加氯乙酰氯(3mL，36mmol)，产生大量白烟，继续搅拌30min后白烟消失，溶液呈淡黄色。继续在室温下反应3h，TLC监测直到反应完全。处理方法：先用减压蒸馏除去大部分乙腈，再加入100mL水，用EA萃取(4×25mL)，收集有机层，用饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏浓缩，得到白色粗品，用PE/EA体系重结晶得到粉白色针状晶体，约3.5g，产率67％。ESI-MS:198.1[M+Na]⁺.

中间体(5-溴-2-氯苯氧基)-N-环己基乙酰胺(b1)的合成

5-溴-2-氯苯酚(2.9g，14.3mmol)为原料溶于50mL乙腈中，加入碳酸钾(2.5g，17.1mmol)搅拌30min，将中间体a1加入反应液中，再移入80℃油浴锅中加热回流4小时，混合液由澄清变为浑浊(有白色固体析出)，TCL监测反应进度。处理方法：反应冷却至室温，先旋除部分乙腈，再加水除去碳酸钾，用EA萃取4次，收集有机层，用水和饱和食盐水分别洗三次，减压蒸馏，得到粉红色固体，用PE/EA体系重结晶得到白色固体4.7g,产率约80％。¹HNMR(400MHz,DMSO)δ7.88(s,1H),7.40(d,J＝8.4Hz,1H),7.26–7.11(m,2H),4.64(s,2H),3.67–3.54(m,1H),1.81–1.61(m,4H),1.55(d,J＝12.5Hz,1H),1.40–1.07(m,5H).ESI-MS:346.1,348.1[M+H]⁺.

中间体2-氯-N-环丙基乙酰胺(a2)的合成

该中间体的制备方法与中间体a1的制备操作方法相同，仅将原料改为环丙胺。有机层减压蒸馏后得到淡黄色油状物，PE/EA体系重结晶得到白色晶体,产率为53.9％。ESI-MS:134.1[M+H]⁺.

中间体(5-溴-2-氯苯氧基)-N-环丙基乙酰胺(b2)的合成

该反应的操作同中间体b1，使用的原料为a2，PE/EA体系重结晶得到粉白色固体，产率为88.2％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.12(s,1H),7.40(d,J＝8.3Hz,1H),7.26–7.13(m,2H),4.61(s,2H),2.67(s,1H),0.79–0.55(m,2H),0.55–0.35(m,2H).ESI-MS:342.3,344.2[M+K]⁺.

中间体N-(5-溴-2-氯吡啶-3)-4-氟苯磺酰胺(h)的合成

将原料5-溴-2-氯-3-氨基吡啶(f，530mg，2.57mmol)溶于8mL吡啶中，在冰浴条件下，缓慢滴加约5mL的4-氟苯磺酰氯(4g，19.4mmol)的吡啶溶液，再向溶液中补加一小勺的DMAP作为催化剂，滴加完后反应在室温下继续反应过夜，溶液呈黄褐色。TCL监测反应进度。处理方法：向反应液中加水200mL，溶液产生大量的沉淀，过滤，用水洗滤饼层至无吡啶味，在用乙醇洗一次，干燥后得到乳白色的固体粉末g，940mg，取中间体g溶于10mL的甲醇中，再加入约3mL碳酸钾水溶液。室温下搅拌反应5-6h，TCL监测至反应完全。处理方法：向反应液中加入水，再用EA萃取4次，合并有机层，用饱和食盐水溶液洗涤2次，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后用EA/PE洗脱体系进行柱层析，得到淡黄色固体，PE/EA体系重结晶得到白色粉末。产率约为75％。ESI-MS:363.1[M-H]^-.

中间体N-(5-溴-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-氟苯磺酰胺(j)的合成

首先用原料5-溴-2-氯-3-氨基吡啶(f，500mg，2.42mmol)溶于20mL二氧六环中，再加入甲醇钠(300mg，5.55mmol)，升温到100℃回流，反应约10h，TCL检测反应进度。处理方法：加入水淬灭反应，EA萃取，收集有机层，浓缩，EA/PE洗脱体系过柱，制得5-溴-2-甲氧基-3-氨基吡啶(i)。取中间体i(500mg，2.45mmol)溶解到10mL吡啶中，在冰浴条件下缓慢加入4-氟苯磺酰氯(4g，19.4mmol)的吡啶溶液8mL，并加入少量DMAP催化。室温下继续反应5-6h。反应完全后处理方法同中间体h。干燥后得到白色固体720mg，产率约为81％。ESI-MS：259.2[M-H]^-.

中间体3-(4-氟苯基磺酰氨基)苯基硼酸(k)

将3-氨基苯硼酸(1g，7.3mmol)和4-氟苯磺酰氯(2g，9.7mmol)溶于10mL二氯甲烷中，再加入三乙胺1.5mL，在室温下反应过夜，溶液由混悬液变成黄色澄清溶液，处理反应液：向反应液减压蒸馏除去DCM，再加水，滴加烯HCl调节PH至酸性，用EA萃取3次，收集有机层，干燥，浓缩。得到褐色油状物，用PE/EA体系重结晶，得到黄色固体粉末约1.88g，产率约为92％。ESI-MS:294.1[M-H]^-.

中间体N-(5-硼酸酯-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-氟苯磺酰胺(l)的合成

取N-(5-溴-2-甲氧基-3-吡啶基)-4-氟苯磺酰胺(j，400mg，1.12mmol)、联硼酸频那醇酯(340mg，1.32mmol)、PdCl2(dppf)(60mg，0.084mmol)、醋酸钾(328mg，3.46mmol)混合于10mL1,4-二氧六环中，抽真空，充入氮气保护，置于100℃油浴锅中反应5h。TCL监测反应进度。处理反应：将反应冷却至室温，加入30mL水，再用EA萃取(4×20mL)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，用EA/PE(1：5)洗脱体系进行柱层析，得到粗品后重结晶，得到白色固体粉末360mg，产率79.6％。ESI-MS:409.0[M+H]⁺,431[M+Na]⁺.

2、苯并噁嗪酮类化合物的合成

6-溴-2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C0)的制备

在冰浴下，将氯乙酰氯(4.7ml，60mmol)溶于25mL THF溶液中，将该溶液滴加入2-氨基-4-溴苯酚(9g，48mmol)的THF溶液中。再加入NaHCO₃(6g，72mmol)，在冰浴下继续搅拌反应1h。TCL检测反应完成时再加入碳酸钾(10g，72mmol)，将反应液加热到80℃反应3h，室温下继续反应过夜。处理反应：反应液加水稀释，用EA萃取4次，收集有机层，分别以稀盐酸、饱和NaHCO₃，饱和食盐水溶液各洗一次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏浓缩，重结晶得到棕色固体6.9g，产率约为63％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.82(s,1H),7.07(dd,J＝8.5,2.4Hz,1H),7.03(d,J＝2.3Hz,1H),6.91(d,J＝8.5Hz,1H),4.59(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₈H₆BrNO₂Na[M+Na]⁺m/z 249.9480,251.9459,found 249.9448,251.9419.

6-溴-4-(3-甲氧基苯基)-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C1)的制备

C1的制备原料为6-溴-2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C0)和3-甲氧基苯硼酸，其他原料和操作同C2，产率约为19.2％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.51(t,J＝8.1Hz,1H),7.18(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),7.11(dd,J＝8.4,3.4Hz,1H),7.05(d,J＝8.5Hz,1H),6.99–6.96(m,1H),6.92(d,J＝8.7Hz,1H),6.36(d,J＝2.3Hz,1H),4.83(s,2H),3.79(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₁₅H₁₂BrNO₃Na[M+Na]⁺m/z 355.9898,357.9878,found355.9861,357.9856.

6-溴-4-苯基-2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C2)的制备

将6-溴-2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C0，350mg，1.54mmol)作为反应原料，原料C0溶于20mL THF中，在室温搅拌下加入苯硼酸(400mg，3.28mmol)和醋酸铜(420mg，2.31mmol)，再滴加入三乙胺(0.5mL，4.62mmol)，最后在反应液中加入4目的分子筛少许。移入60℃油浴锅中反应约6h，TCL监测反应完全。处理反应液：将反应液减压蒸馏除去部分THF，再加水过滤，滤液用EA萃取4次，收集有机层，干燥，浓缩，干法上样，用PE/EA(6：1)洗脱体系进行柱层析，收集目标化合物，重结晶得到白色晶体102mg，产率约22％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.63–7.58(m,1H),7.53(t,J＝7.4Hz,1H),7.37(d,J＝7.1Hz,1H),7.18(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),7.06(d,J＝8.5Hz,1H),6.31(d,J＝2.3Hz,1H),4.85(s,1H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₁₄H₁₀BrNO₂Na[M+Na]⁺m/z 325.9793,327.9772found325.9771,327.9762.

6-溴-4-(4-氯苯基)-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C3)的制备

C3的制备原料为6-溴-2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C0)和4-氯苯硼酸，其他原料和操作同C2，产率约为19.8％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.22(d,J＝8.6Hz,2H),7.11(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),6.93(d,J＝8.6Hz,1H),6.55(s,1H),4.75(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₁₄H₉BrClNO₂Na[M+Na]⁺m/z 336.9505,338.9485found 336.9501,338.9481.

6-溴-4-(4-甲基苯基)-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C4)的制备

C4的制备原料为6-溴-2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C0)和4-甲基苯硼酸，其他原料和操作同C2，产率约为21.6％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.35(d,J＝8.1Hz,2H),7.14(d,J＝8.2Hz,2H),7.08(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),6.91(d,J＝8.5Hz,1H),6.56(d,J＝2.2Hz,1H),4.75(s,2H),2.44(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₁₅H₁₂BrNO₂Na[M+Na]⁺m/z339.9949,341.9929,found 339.9931,341.9906.

6-溴-4-(4-甲氧基苯基)-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C5)的制备

C5的制备原料为6-溴-2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C0)和4-甲氧基苯硼酸，其他原料和操作同C2，产率约为21.6％。产率为25.2％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.28(d,J＝8.9Hz,2H),7.16(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),7.12(d,J＝8.9Hz,2H),7.03(d,J＝2.3Hz,1H),6.35(d,J＝2.3Hz,1H),4.82(s,2H),3.84(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₁₅H₁₂BrNO₃Na[M+Na]⁺m/z 355.9898,357.9878,found 355.9876,357.9855.

6-溴-4-(4-氟苯基)-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C6)的制备

C6的制备原料为6-溴-2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C0)和4-甲氟苯硼酸，其他原料和操作同C2，产率约为18.7％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.47–7.40(m,4H),7.19(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),7.06(d,J＝8.5Hz,1H),6.34(d,J＝2.2Hz,1H),4.84(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₁₄H₉BrFNO₂Na[M+Na]⁺m/z 343.9698,345.9678,found343.9612,345.9655.

6-溴-4-环己基-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C7)的制备

中间体(5-溴-2-氯苯氧基)-N-环己基乙酰胺(b1)为原料，取b1(220mg，0.64mmol)、碳酸铯(500mg，1.53mmol)置于微波反应管中，加入3mL DMF溶解。将反应试管置于微波仪中反应，微波条件设置为温度150℃，功率50W，时间60min。反应结束后TCL监测反应完全。处理反应，向反应中加水，用EA萃取，用水洗三次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，干法上样，用PE/EA(10：1)洗脱体系进行柱层析，收集目标化合物，浓缩得到黄色油状物，PE重结晶得到淡黄色晶体80mg，产率约为50.6％。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.25(d,J＝1.9Hz,1H),7.08(d,J＝10.5Hz,1H),6.86(d,J＝8.5Hz,1H),4.45(s,2H),4.12–4.01(m,1H),2.40–2.25(m,2H),1.98–1.67(m,5H),1.47–1.20(m,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₁₄H₁₇BrNO₂[M+H]⁺m/z 310.0443,312.0422,found 310.0436,312.0415.

6-溴-4-环丙基-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C8)的制备

中间体2-(5-溴-2-氯苯氧基)-N-环丙基乙酰胺(b2)

为原料，其他原料及操作同C7的制备。产率约为43.6％。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44(d,J＝2.2Hz,1H),7.10(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),6.84(d,J＝8.5Hz,1H),4.54(s,2H),2.76–2.65(m,1H),1.22–1.16(m,2H),0.82–0.75(m,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculatedfor C₁₁H₁₁BrNO₂[M+H]⁺m/z 267.9973,269.9953,found 267.9952,269.9932.

3、目标化合物的合成

目标化合物C1-1的合成

将原料6-溴-4-(3-甲氧基苯基)-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C1，60mg，0.18mmol)，中间体l(80mg，0.21mg)，催化剂PdCl₂(dppf)(10mg，0.013mmol)和碱醋酸钾(60mg，0.6mmol)加入反应试管中，加入4mL二氧六环溶解。抽真空，充入氮气，移入80℃油浴锅中反应5h，TCL监测反应进度。处理反应液：冷却至室温，加水，用EA萃取，合并有机层，用饱和NaCl溶液洗两次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，干法上样，用PE/EA(4：1)展开剂进行薄层色谱分离纯化，收集目标产物，重结晶得到白色粉末40mg。产率为41.7％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.06(s,1H),δ8.29(d,J＝2.3Hz,1H),7.89(dd,J＝9.0,5.0Hz,2H),7.61(d,J＝2.3Hz,1H),7.55–7.48(m,3H),7.28(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.21(d,J＝8.3Hz,1H),7.11(dd,J＝8.1,2.7Hz,1H),7.01(t,J＝2.1Hz,1H),6.97(d,J＝7.8Hz,1H),6.53(d,J＝2.0Hz,1H),4.87(s,2H),3.79(s,3H),3.47(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₇H₂₂FN₃O₆S[M+H]⁺m/z535.1213,found 535.1211.

目标化合物C1-2的合成

化合物C1-2的制备原料为化合物C1，中间体k，其他原料和操作同C1-1。PE/EA体系重结晶得到淡黄色固体56mg。产率为61.5％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),7.72(dd,J＝8.9,5.2Hz,2H),7.53(t,J＝8.1Hz,1H),7.33(t,J＝8.8Hz,2H),7.21(t,J＝7.9Hz,1H),7.17–7.11(m,2H),7.06(s,1H),7.04–6.99(m,2H),6.96(d,J＝8.7Hz,2H),6.42(s,1H),4.84(s,2H),3.80(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₇H₂₁FN₂O₅S[M+H]⁺m/z504.1155,found 504.1149.

目标化合物C1-3的合成

化合物C1-3的制备原料为化合物C1，中间体h和联硼酸频那醇酯，其他原料和操作同C7-3。薄层色谱分离纯化，收集目标化合物。重结晶得到乳白色固体，产率为16.5％。¹HNMR(400MHz,DMSO)δ10.56(s,1H),8.60(d,J＝2.3Hz,1H),7.96(dd,J＝9.0,5.0Hz,2H),7.69(d,J＝2.3Hz,1H),7.61–7.47(m,3H),7.35(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.26(d,J＝8.3Hz,1H),7.10(dd,J＝8.7,2.9Hz,1H),7.01(t,J＝2.1Hz,1H),6.96(d,J＝10.3Hz,1H),6.62(d,J＝2.1Hz,1H),4.90(s,2H),3.78(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₂₅H₁₇ClF₂N₃O₄S[M+H]⁺m/z 528.0596,found 528.0579.

目标化合物C1-4的合成

化合物C1-4的制备原料为化合物C1和3-喹啉硼酸。其他原料和操作同C1-1。得到白色固体。产率约为39.6％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.91(d,J＝2.3Hz,1H),8.33(d,J＝2.3Hz,1H),7.99(d,J＝9.4Hz,2H),7.74(t,J＝8.3Hz,1H),7.61(t,J＝8.0Hz,1H),7.56–7.47(m,2H),7.28(d,J＝8.3Hz,1H),7.10(dd,J＝8.1,2.8Hz,1H),7.05–6.97(m,2H),6.70(d,J＝2.1Hz,1H),4.90(s,2H),3.79(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₂₄H₁₈N₂O₃[M+H]⁺m/z 382.1317,found 382.1309.

目标化合物C1-5的合成

化合物C1-5的制备原料为化合物C1和4-羟基苯硼酸。其他原料和操作同C1-1。得到白色固体。产率约为15.8％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.69(s,1H),7.49(t,J＝8.1Hz,1H),7.20–7.07(m,5H),7.00–6.92(m,2H),6.75(d,J＝8.6Hz,2H),6.43(d,J＝2.0Hz,1H),4.82(s,2H),3.78(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₀H₁₅FNO₃[M+H]⁺m/z 336.1036,found 336.1029.

目标化合物C2-1的合成

称取6-溴-4-苯基-2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C2，50mg，0.17mmol)和中间体l(80mg,0.20mmol)，催化剂PdCl₂(dppf)(9mg,0.012mmol)，碱醋酸钾(50mg,0.49mmol)加入3mL 1,4-二氧六环中，加热至80℃反应5h，TCL检测反应完全。处理方法：反应液冷却后，加水，用EA萃取4次，收集有机层，用饱和NaCl溶液洗两次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，薄层层析分离纯化，PE/EA(4：1)体系作为展开剂，收集目标产物条带，用EA洗脱，减压蒸馏，PE/EA重结晶得到黄色粉末15mg，产率18.1％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.02(s,1H),7.93(s,1H),7.70(dd,J＝7.9,4.1Hz,2H),7.63(t,J＝7.5Hz,2H),7.58–7.52(m,1H),7.45(d,J＝2.3Hz,1H),7.42(d,J＝7.1Hz,2H),7.37(t,J＝8.9Hz,2H),7.23(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),7.18(d,J＝8.3Hz,1H),6.36(d,J＝2.0Hz,1H),4.87(s,2H),3.64(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₆H₂₀FN₃O₅S[M+H]⁺m/z 505.1108,found 505.1101.

目标化合物C2-2的合成

化合物C2-2的制备原料为C2和中间体k其他原料和操作同化合物C2-1。产率61.5％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.40(s,1H),7.71(dd,J＝8.9,5.1Hz,2H),7.63(t,J＝7.4Hz,2H),7.56(t,J＝6.7Hz,1H),7.41(d,J＝7.0Hz,2H),7.35(t,J＝8.8Hz,2H),7.22(t,J＝7.9Hz,1H),7.16(s,2H),7.07–7.00(m,2H),6.98(d,J＝8.1Hz,1H),6.37(s,1H),4.86(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₆H₁₉FN₂O₄S[M+H]⁺m/z 474.1050,found474.1025.

目标化合物C2-3的合成

化合物C2-3的合成所用的原料是C2(60mg，0.2mmol)，中间h(87mg，0.24mmol)和联硼酸频那醇酯(76，0.3mmol),采用“一锅法”，其他原料和操作方法同C1-3，产率为11.8％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),8.19(s,1H),8.03(dd,J＝8.9,4.9Hz,1H),7.96(d,J＝9.2Hz,1H),7.87(d,J＝2.2Hz,1H),7.70(dd,J＝8.8,5.2Hz,2H),7.65–7.60(m,2H),7.55(s,2H),7.44–7.38(m,2H),7.22(d,J＝8.3Hz,1H),6.43(s,1H),4.86(s,2H).HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₅H₁₇ClFN₃O₄S[M+H]⁺m/z 509.0612,found 509.0611.

目标化合物C2-4的合成

化合物C2-4的制备原料为C2(45mg，0.15mmol)和3-喹啉硼酸(31mg，0.18mmol)，其他原料和操作同从化合物C2-1，产率为36.6％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.89(d,J＝2.4Hz,1H),8.32(d,J＝2.2Hz,1H),7.98(d,J＝8.3Hz,2H),7.77–7.70(m,1H),7.64–7.57(m,3H),7.56–7.47(m,2H),7.44(d,J＝7.0Hz,2H),7.29(d,J＝8.3Hz,1H),6.65(d,J＝2.1Hz,1H),4.92(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₃H₁₆N₂O₂[M+H]⁺m/z 352.1212,found352.1210.

目标化合物C2-5的合成

化合物C2-5的制备原料为C2(45mg，0.15mmol)和4-羟基苯硼酸(30mg，0.22mmol),其他原料和操作同从化合物C2-1，产率为21.5％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.56(s,1H),7.59(t,J＝7.9Hz,2H),7.52(t,J＝7.4Hz,1H),7.39(d,J＝7.0Hz,2H),7.18(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.12(d,J＝8.5Hz,3H),6.74(d,J＝8.6Hz,2H),6.38(d,J＝2.0Hz,1H),4.83(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₀H₁₅NO₃[M+H]⁺m/z 317.1052,found 317.1041.

目标化合物C3-1的合成

将6-溴-4-(4-氯苯基)-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C3)和中间体l用于合成C3-1，其他原料的操作同从C2-1，重结晶得到淡黄色粉末，产率为24.2％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.04(s,1H),7.96(d,J＝2.3Hz,1H),7.75–7.66(m,4H),7.51(d,J＝2.3Hz,1H),7.47(d,J＝8.7Hz,2H),7.38(t,J＝8.9Hz,2H),7.24(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),7.19(d,J＝8.3Hz,1H),6.40(d,J＝2.0Hz,1H),4.86(s,2H),3.65(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₂₆H₁₉ClFN₃O₅S[M+H]⁺m/z 539.0718,found 539.0713.

目标化合物C3-2的合成

化合物C3-2的制备原料为C3和中间体k，其他原料及操作同C2-1。得到白色粉末，产率约为34.7％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.42(s,1H),7.76–7.65(m,4H),7.47(d,J＝8.7Hz,2H),7.36(t,J＝8.8Hz,2H),7.24(t,J＝7.9Hz,1H),7.17(d,J＝1.1Hz,2H),7.10–7.03(m,2H),7.00(d,J＝10.0Hz,1H),6.38(s,1H),4.86(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₆H₁₈ClFN₂O₄S[M+H]⁺m/z 508.0660,found 508.0645.

目标化合物C3-3的合成

化合物C3-3的制备原料为C3，中间体h和联硼酸频那醇酯，采用“一锅法”，其他原料和操作方法同C1-3，产率为15.6％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.49(s,1H),8.30(d,J＝2.3Hz,1H),7.72(dd,J＝8.9,5.1Hz,1H),7.68(d,J＝8.7Hz,2H),7.64(d,J＝2.3Hz,1H),7.58(t,J＝8.8Hz,1H),7.47(d,J＝8.7Hz,2H),7.41(dd,J＝10.9,6.8Hz,2H),7.33(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.24(d,J＝8.3Hz,1H),6.50(d,J＝2.1Hz,1H),4.89(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₅H₁₆C_l2FN₃O₄S[M+H]⁺m/z 543.0223,found 543.0221.

目标化合物C3-4的合成

化合物C3-4的制备原料为C3(45mg，0.13mmol)和3-喹啉硼酸(30mg，0.16mmol)，其他原料和操作同从化合物C2-1，得到白色固体20mg，产率为39.2％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.95(d,J＝2.4Hz,1H),8.36(d,J＝2.2Hz,1H),8.00(d,J＝8.6Hz,2H),7.74(t,J＝7.6Hz,1H),7.66(d,J＝8.7Hz,2H),7.61(t,J＝7.0Hz,1H),7.55–7.44(m,3H),7.29(d,J＝8.3Hz,1H),6.73(d,J＝2.1Hz,1H),4.91(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₃H₁₅ClN₂O₂[M+H]⁺m/z 386.0822,found 386.0816.

目标化合物C3-5的合成

化合物C3-5的制备原料为C3(45mg，0.13mmol)和4-羟基苯硼酸(30mg，0.22mmol)，其他原料和操作同从化合物C2-1，产率为19.4％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.65(s,1H),7.65(d,J＝8.7Hz,2H),7.45(d,J＝8.7Hz,2H),7.17(ddd,J＝22.2,11.0,5.2Hz,4H),6.76(d,J＝8.6Hz,2H),6.41(d,J＝2.0Hz,1H),4.83(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₂₀H₁₄ClNO₃[M+H]⁺m/z 351.0662,found 351.0639.

目标化合物C4-1的合成

将6-溴-4-(4-甲基苯基)-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C4)和中间体l用于合成C4-1，其他原料的操作同从C2-1，PE/EA体系重结晶得到白色粉末，产率为39.2％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.03(s,1H),7.91(d,J＝2.3Hz,1H),7.71(dd,J＝8.9,5.2Hz,2H),7.47(d,J＝2.3Hz,1H),7.42(d,J＝8.1Hz,2H),7.37(t,J＝8.8Hz,2H),7.28(d,J＝8.2Hz,2H),7.21(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),7.17(d,J＝8.3Hz,1H),6.38(d,J＝1.9Hz,1H),4.85(s,2H),3.65(s,3H),2.40(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₇H₂₂FN₃O₅S[M+H]⁺m/z519.1264,found 519.1243.

目标化合物C4-2的合成

化合物C4-2的制备原料为C4和中间体k，其他原料及操作同C2-1。得到乳白色粉末，产率约为30.3％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),7.72(dd,J＝8.9,5.1Hz,2H),7.42(d,J＝8.0Hz,2H),7.34(t,J＝8.8Hz,2H),7.27(d,J＝8.2Hz,2H),7.22(t,J＝7.9Hz,1H),7.15(d,J＝2.7Hz,2H),7.06(s,1H),7.01(d,J＝7.8Hz,1H),6.97(d,J＝8.1Hz,1H),6.40(s,1H),4.84(s,2H),2.40(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₇H₂₁FN₂O₄S[M+H]⁺m/z 488.1206,found 488.1206.

目标化合物C4-3的合成

化合物C4-3的制备原料为C4，中间体h和联硼酸频那醇酯，采用“一锅法”，其他原料和操作方法同C1-3，产率为12.2％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.49(s,1H),8.16(s,1H),8.03(dd,J＝10.5,3.4Hz,1H),7.70(dd,J＝8.9,5.2Hz,2H),7.61–7.52(m,2H),7.41(t,J＝7.6Hz,3H),7.36(d,J＝8.8Hz,2H),7.28(d,J＝8.3Hz,3H),7.21(d,J＝8.3Hz,1H),6.44(d,J＝2.0Hz,1H),4.87(s,2H),2.40(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₂₆H₁₉ClFN₃O₄S[M+H]⁺m/z 523.0769,found 523.0761.

目标化合物C4-4的合成

化合物C4-4的制备原料为C4(50mg，0.16mmol)和3-喹啉硼酸(41mg，0.24mmol)，其他原料和操作同从化合物C2-1，得到白色固体16mg，产率为28.1％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.89(d,J＝2.4Hz,1H),8.33(d,J＝2.2Hz,1H),7.99(d,J＝8.5Hz,2H),7.77–7.71(m,1H),7.66–7.53(m,1H),7.49(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.40(d,J＝8.1Hz,2H),7.29(dd,J＝12.6,8.3Hz,3H),6.67(d,J＝2.1Hz,1H),4.90(s,2H),2.40(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₄H₁₈N₂O₂[M+H]⁺m/z 351.0662,found 351.0649.

目标化合物C4-5的合成

化合物C4-5的制备原料为C4(50mg，0.16mmol)和4-羟基苯硼酸(35mg，0.25mmol)，其他原料和操作同从化合物C2-1，产率为27％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.72(s,1H),7.37(t,J＝8.9Hz,2H),7.25(d,J＝8.2Hz,2H),7.19–7.08(m,3H),6.77(dd,J＝16.6,8.6Hz,3H),6.41(d,J＝2.0Hz,1H),4.81(s,2H),2.40(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₂₁H₁₇NO₃[M+H]⁺m/z 331.1208,found 331.1202.

目标化合物C5-1的合成

将6-溴-4-(4-甲氧基苯基)-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C5)和中间体l用于合成C5-1，其他原料的操作同从C2-1，PE/EA体系重结晶得到淡黄色粉末，产率为39.5％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.04(s,1H),7.92(d,J＝2.3Hz,1H),7.71(dd,J＝8.9,5.2Hz,2H),7.48(d,J＝2.3Hz,1H),7.38(d,J＝8.8Hz,2H),7.35–7.30(m,2H),7.21(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),7.16(dd,J＝8.6,1.9Hz,3H),6.40(s,1H),4.85(s,2H),3.83(s,3H),3.65(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₇H₂₂FN₃O₆S[M+H]⁺m/z 535.1213,found 535.1201.

目标化合物C5-2的合成

化合物C5-2的制备原料为C5和中间体k，其他原料及操作同C2-1。得到白色粉末，产率约为33.8％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.42(s,1H),7.72(dd,J＝8.9,5.1Hz,2H),7.39–7.28(m,4H),7.23(t,J＝7.9Hz,1H),7.15(d,J＝6.9Hz,4H),7.08(s,1H),7.03(d,J＝7.8Hz,1H),6.98(d,J＝8.1Hz,1H),6.41(s,1H),4.84(s,2H),3.83(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₇H₂₁FN₂O₅S[M+H]⁺m/z 504.1155,found 504.1142.

目标化合物C5-3的合成

化合物C5-3的制备原料为C5，中间体h和联硼酸频那醇酯，采用“一锅法”，其他原料和操作方法同C1-3，产率为16.7％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.53(s,1H),8.44(s,1H),8.19(s,1H),7.88(d,J＝2.2Hz,1H),7.83(dd,J＝8.9,5.2Hz,2H),7.71(dd,J＝8.9,5.2Hz,1H),7.59(d,J＝2.3Hz,1H),7.40(t,J＝8.4Hz,2H),7.32(d,J＝8.9Hz,1H),7.20(d,J＝8.3Hz,1H),7.15(d,J＝8.9Hz,1H),6.47(s,1H),4.87(s,2H),3.83(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₆H₁₉ClFN₃O₅S[M+H]⁺m/z 539.0718,found 539.0703.

目标化合物C5-4的合成

化合物C5-4的制备原料为C5和3-喹啉硼酸，其他原料和操作同从化合物C2-1，得到白色固体，产率为27.5％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.91(d,J＝2.4Hz,1H),8.33(d,J＝2.2Hz,1H),8.00(d,J＝8.4Hz,2H),7.77–7.70(m,1H),7.64–7.58(m,1H),7.49(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.35(d,J＝8.9Hz,2H),7.27(d,J＝8.3Hz,1H),7.13(d,J＝9.0Hz,2H),6.70(d,J＝2.1Hz,1H),4.89(s,2H),3.83(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₄H₁₈N₂O₃[M+H]⁺m/z 382.1317,found 382.1309.

目标化合物C5-5的合成

化合物C5-5的制备原料为C5和4-羟基苯硼酸，其他原料和操作同从化合物C2-1，得到白色固体，产率为18.4％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.59(s,1H),7.30(d,J＝8.9Hz,2H),7.20–7.14(m,2H),7.11(dd,J＝9.0,4.8Hz,4H),6.75(d,J＝8.6Hz,2H),6.43(d,J＝2.0Hz,1H),4.81(s,2H),3.83(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₁H₁₇NO₄[M+H]⁺m/z347.1158,found 347.1143.

目标化合物C6-1的合成

将6-溴-4-(4-氟苯基)-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C6，50mg，0.16mmol)和中间体l(70mg，0.18mmol)用于合成C6-1，其他原料的操作同C2-1，PE/EA体系重结晶得到白色固体40mg，产率为48.7％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.03(s,1H),7.93(d,J＝2.3Hz,1H),7.75–7.65(m,4H),7.48(dd,J＝8.7,5.5Hz,3H),7.37(t,J＝8.8Hz,2H),7.23(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),7.18(d,J＝8.3Hz,1H),6.40(s,1H),4.86(s,2H),3.65(s,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₆H₁₉F₂N₃O₅S[M+H]⁺m/z 523.1013,found 523.1011.

目标化合物C6-2的合成

化合物C6-2的制备原料为C6(50mg，0.16mmol)和中间体k(68mg，0.24mmol)，其他原料及操作同C2-1。得到乳白色粉末60mg，产率约为65.2％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.43(s,1H),7.73(dd,J＝8.9,5.2Hz,2H),7.69(d,J＝8.7Hz,2H),7.47(d,J＝8.7Hz,2H),7.35(t,J＝8.8Hz,2H),7.23(t,J＝7.9Hz,1H),7.17(d,J＝1.0Hz,2H),7.10–7.03(m,2H),6.99(d,J＝8.1Hz,1H),6.37(s,1H),4.85(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₂₆H₁₈F₂N₂O₄S[M+H]⁺m/z 492.0955,found 492.0949.

目标化合物C6-3的合成

化合物C6-3的制备原料为C6(50mg，0.16mmol)，中间体h(70mg，0.19mmol)和联硼酸频那醇酯(60mg,0.24mmol)，采用“一锅法”,其他原料和操作方法同C1-3，得到白色固体10mg，产率为12.1％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.49(s,1H),8.16(s,1H),8.03(dd,J＝9.0,5.0Hz,1H),7.85–7.79(m,1H),7.73–7.64(m,2H),7.61–7.54(m,2H),7.46(dd,J＝8.5,3.0Hz,2H),7.36(t,J＝8.8Hz,2H),7.31–7.26(m,1H),7.22(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),6.46(d,J＝12.1Hz,1H),4.88(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₅H₁₆ClF₂N₃O₄S[M+H]⁺m/z 527.0518,found 527.0516.

目标化合物C6-4的合成

化合物C6-4的制备原料为C6(50mg，0.16mmol)和3-喹啉硼酸(41mg，0.24mmol)，其他原料和操作同从化合物C2-1，重结晶得到白色晶体36mg，产率为62％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.95(d,J＝2.4Hz,1H),8.36(d,J＝2.2Hz,1H),8.00(d,J＝8.3Hz,2H),7.78–7.71(m,1H),7.66(d,J＝8.7Hz,2H),7.61(t,J＝7.5Hz,1H),7.55–7.47(m,3H),7.29(d,J＝8.3Hz,1H),6.73(d,J＝2.1Hz,1H),4.87(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₂₃H₁₅FN₂O₂[M+H]⁺m/z 370.1118,found 370.1116.

目标化合物C6-5的合成

化合物C6-5的制备原料为C6(50mg，0.16mmol)和4-羟基苯硼酸(33mg，0.24mmol)，其他原料和操作同从化合物C2-1，得到白色固体13mg，产率为25％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.74(s,1H),7.65(d,J＝6.6Hz,2H),7.45(d,J＝8.7Hz,2H),7.24–7.08(m,4H),6.76(d,J＝8.6Hz,2H),6.41(d,J＝2.0Hz,1H),4.83(s,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₂₀H₁₄FNO₃[M+H]⁺m/z 335.0958,found 335.0939.

目标化合物C7-1的合成

称取原料6-溴-4-环己基-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C7，60mg，0.19mmol)，中间体l(95mg，0.23mmol)，催化剂PdCl₂(dppf)(10.6mg，0.015mmol)和碱醋酸钾(60mg，0.6mmol)加入反应试管中，加入4mL二氧六环溶解。抽真空，充入氮气，移入80℃油浴锅中反应5h，TCL监测反应进度。处理反应液：冷却至室温，加水，用EA萃取，合并有机层，用饱和NaCl溶液洗两次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，干法上样，用PE/EA(10：1)洗脱剂进行柱层析。收集目标化合物，重结晶得到白色晶体42mg，产率为42.4％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.07(s,1H),8.28(d,J＝2.3Hz,1H),7.86–7.77(m,3H),7.45–7.37(m,3H),7.21(dd,J＝8.3,1.9Hz,1H),7.12(d,J＝8.3Hz,1H),4.54(s,2H),4.26–4.15(m,1H),3.67(s,3H),2.39–2.27(m,2H),1.85–1.63(m,5H),1.50–1.20(m,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₆H₂₆FN₃O₅S[M+H]⁺m/z 511.1577,found 511.1559.

目标化合物C7-2的合成

化合物C7-2的制备原料为C7(60mg，0.19mmol)和中间体k(68mg，0.23mmol)。其他原料和操作方法同化合物C7-1。重结晶得到白色固体50mg。产率为54.6％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.47(s,1H),7.85(dd,J＝8.9,5.1Hz,2H),7.41(t,J＝8.8Hz,2H),7.36–7.30(m,4H),7.15(dd,J＝8.3,1.8Hz,1H),7.12–7.08(m,2H),4.55(s,2H),4.25–4.15(m,1H),2.38–2.24(m,2H),1.89–1.61(m,5H),1.50–1.20(m,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₂₆H₂₅FN₂O₄S[M+H]⁺m/z 480.1519,found 480.1503.

目标化合物C7-3的合成

称取C7(60mg，0.19mmol)和中间体h(83mg，0.23mmol)和联硼酸频那醇酯(74mg，0.29mmol)，催化剂PdCl₂(dppf)(10.6mg，0.015mmol)和碱醋酸钾(60mg，0.6mmol)加入反应试管中，加入4mL二氧六环溶解。采用“一锅法”，抽真空，充入氮气，移入80℃油浴锅中反应6h，TCL监测反应进度。处理反应液：冷却至室温，加水，用EA萃取，合并有机层，用饱和NaCl溶液洗两次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，干法上样，用PE/EA(8：1)洗脱剂进行柱层析。收集目标化合物，重结晶得到淡黄色固体12mg。产率约为12.1％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.49(s,1H)，8.32(d,J＝2.3Hz,1H),8.15(d,J＝2.2Hz,1H),7.82(dd,J＝8.9,4.9Hz,1H),7.31(d,J＝1.8Hz,1H),7.20–7.10(m,4H),7.04(d,J＝6.4Hz,1H),4.55(s,2H),4.35–4.21(m,1H),2.47–2.31(m,2H),2.01–1.68(m,5H),1.47–1.34(m,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₅H₂₃ClFN₃O₄S[M+H]⁺m/z 515.1082,found 515.1065.

目标化合物C7-4的合成

化合物C7-4的制备原料为化合物C7和3-喹啉硼酸。其他原料和操作同C7-1。重结晶得到白色固体。产率约为68.5％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.25(d,J＝2.4Hz,1H),8.61(d,J＝2.2Hz,1H),8.07(t,J＝8.6Hz,2H),7.82–7.75(m,1H),7.69–7.63(m,2H),7.50(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),7.20(d,J＝8.3Hz,1H),4.58(s,2H),4.31–4.19(m,1H),2.47–2.35(m,2H),1.86–1.58(m,5H),1.53–1.18(m,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₃H₂₂N₂O₂[M+H]⁺m/z 358.1681,found 358.1663.

目标化合物C7-5的合成

化合物C7-5的制备原料为化合物C7和4-羟基苯硼酸。其他原料和操作同C7-1。得到白色固体。产率约为32％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.52(s,1H),7.45(d,J＝8.6Hz,2H),7.33(d,J＝1.8Hz,1H),7.18(dd,J＝8.3,1.9Hz,1H),7.05(d,J＝8.3Hz,1H),6.85(d,J＝8.6Hz,2H),4.51(s,2H),4.24–4.12(m,1H),2.41–2.28(m,2H),1.85–1.61(m,5H),1.48–1.16(m,3H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₀H₂₁NO₃[M+H]⁺m/z 323.1521,found323.1509.

目标化合物C8-1的合成

化合物C8-1的制备原料为6-溴-4-环丙基-2H-苯并噁嗪-3(4H)-酮(C8)和中间体l，其他原料和操作同C7-1。得到白色固体。产率为26.1％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.06(s,1H),8.25(d,J＝2.3Hz,1H),7.83(dd,J＝8.9,5.2Hz,2H),7.78(d,J＝2.3Hz,1H),7.50(d,J＝2.1Hz,1H),7.42(t,J＝8.9Hz,2H),7.22(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.07(d,J＝8.3Hz,1H),4.62(s,2H),3.68(s,3H),2.91–2.80(m,1H),1.15–1.09(m,2H),0.70–0.62(m,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₃H₂₀FN₃O₅S[M+H]⁺m/z 469.1108,found 469.1105.

目标化合物C8-2的合成

化合物C8-2的制备原料为化合物C8和中间体k，其他原料和操作同C7-1。得到黄色油状物。产率约为43.1％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.46(s,1H),7.86(dd,J＝8.9,5.1Hz,2H),7.47–7.38(m,3H),7.35–7.30(m,3H),7.14(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.10–7.04(m,2H),4.62(s,2H),2.86–2.78(m,1H),1.15–1.09(m,2H),0.70–0.63(m,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₂₃H₁₉FN₂O₄S[M+H]⁺m/z 438.1050,found 438.1039.

目标化合物C8-3的合成

化合物C8-3的制备原料为化合物C8，中间体h和联硼酸频那醇酯，其他原料和操作同C7-3。重结晶得到乳白色固体，产率为17.3％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.51(s,1H),8.52(s,1H),7.88(d,J＝2.2Hz,1H),7.82(dd,J＝8.8,5.2Hz,2H),7.56(d,J＝1.8Hz,1H),7.43(t,J＝8.8Hz,2H),7.30(dd,J＝8.3,1.9Hz,1H),7.11(d,J＝8.3Hz,1H),4.65(s,2H),2.90–2.78(m,1H),1.15–1.07(m,2H),0.71–0.64(m,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated forC₂₂H₁₇ClFN₃O₄S[M+H]⁺m/z 473.0612,found 473.0601.

目标化合物C8-4的合成

化合物C8-4的制备原料为化合物C8和3-喹啉硼酸。其他原料和操作同化合物C7-1。得到白色晶体。产率为33.5％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.25(d,J＝2.3Hz,1H),8.62(d,J＝2.2Hz,1H),8.07(dd,J＝7.6,5.6Hz,2H),7.84(d,J＝2.0Hz,1H),7.78(t,J＝8.2Hz,1H),7.66(t,J＝7.6Hz,1H),7.53(dd,J＝8.3,2.0Hz,1H),7.16(d,J＝8.3Hz,1H),4.67(s,2H),2.93–2.86(m,1H),1.26–1.18(m,2H),0.74–0.67(m,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculatedfor C₂₀H₁₆N₂O₂[M+H]⁺m/z 316.1212,found 316.1206.

目标化合物C8-5的合成

化合物C8-5的制备原料为化合物C8和4-羟基苯硼酸。其他原料和操作同C7-1。得到白色固体。产率约为22.4％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.52(s,1H),7.51(d,J＝2.1Hz,1H),7.45(d,J＝8.6Hz,2H),7.18(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.01(d,J＝8.3Hz,1H),6.85(d,J＝8.6Hz,2H),4.59(s,2H),2.86–2.80(m,1H),1.17–1.10(m,2H),0.69–0.62(m,2H)ppm.HRMS(DART-TOF)calculated for C₁₇H₁₅NO₃[M+H]⁺m/z 281.1052,found 281.1041.

实施例2目标化合物对肿瘤细胞的抑制活性

在进行体外实验时使用的目标化合物均用DMSO配制成20mg/mL的浓度贮存，化合物均置于4℃冰箱中避光保存，实验时根据所需浓度用完全培养基进行稀释。所用的肿瘤细胞株包括：人结肠癌细胞株(HCT-116)、人肺腺癌细胞株(A549)、人乳腺癌细胞株(MCF-7)、人肝肿瘤细胞株(HepG2)、人恶性黑色素瘤细胞(A375)、人***细胞株(Hela)等，以上细胞株均购于美国ATCC公司。具体试验方法步骤如下：

铺板：首先收集处于对数生长期的肿瘤细胞并用培养基调整细胞悬液的浓度。然后以2～4×10⁴/孔的细胞密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液并置于37℃，5％CO₂培养箱内继续孵育24h。

加药：采用倍比稀释法，用完全培养基将20mg/mL的目标化合物稀释成不同浓度，其中初筛的浓度设置为40、20、10μM，精筛的浓度设计为20、10、5、2.5、1.25、0.625μM。将不同浓度的目标化合物溶液以100μL/孔的量加入96孔板中。另外，设置2mg/mL的BEZ235阳性药为对照组和仅有培养液的空白对照组。为减少误差，每个浓度均为三个复孔。继续培养48h。

处理：取出96孔板，将MTT配制成5mg/mL的溶液以20μL/孔的量加入96孔板中，继续孵育2～4h，弃去上清液，再向每个孔中加入150μL DMSO，充分摇晃10～15min。

检测：每孔震荡染色均匀后，用酶标仪在波长570nm下测定每孔的吸光度值，取其平均值。根据公式：相对细胞增殖抑制率(％)＝(空白对照组-实验组)/空白对照组×100％，从而计算出每个目标化合物对应的肿瘤细胞相对增殖抑制率，再使用IC₅₀计算软件求得半数抑制浓度(IC₅₀，μmol/L)。其测试结果见表1。

表1(单位μmol/L)

由以上IC₅₀数据可知，大多目标化合物对不同肿瘤细胞株有一定的增殖抑制活性。其中，C2-1，C3-1，C5-1和C8-1的活性较好。

实施例3目标化合物对PI3Kα的激酶活性研究

取上述分子，进行纯度测定后，再称取送往上海睿智化学公司进行对PI3Kα的激酶活性的测定。测定这些分子对PI3Kα的IC50。其测定结果见表2。

表2

根据酶活测试结果显示，我们得到了一批能有效靶向于PI3Kα的分子，其中化合物C5-1对PI3Kα激酶的IC50明显优于本实验中作为阳性对照药的PI-103的IC50(9.57nM),也优于对照分子BEZ235(80.5nM)。

C5-1和PI-103对PI3Kα的IC50计算见表3。C5-1、PI-103和BEZ235对PI3K/mTOR靶点的抑制活性见表4。表4中数值均为IC50，单位为nM。

表3

计算得C5-1对PI3Kα的IC50为0.627nM，PI-103对PI3Kα的IC50为9.57nM。

表4(IC50:nM)

靶点	PI3Kα	PI3Kβ	PI3Kγ	PI3Kδ	mTOR
						C5-1	0.63	94.54	22	9.2	13.85
PI-103	9.6	11.98	64.03	11	5.3
						BEZ235	80.5	703.9	104.2	85.3	1.43

可见，C5-1不仅靶向于PI3Kα，对PI3Kβ、PI3Kγ、PI3Kδ以及mTOR也有较好的抑制活性。

实施例4目标化合物与对比化合物对PI3Kα的激酶活性对比

取部分化合物，同时合成报道的对比化合物(US2010/0311736A1)，测定100nM的浓度下对PI3Kα的抑制率，其结果见表5。其中，对比化合物的核磁表征如下：

C3-6-1：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝8.13(d,J＝2.3,1H),8.05(d,J＝2.3,1H),7.72(dd,J＝8.4,1.1,2H),7.63–7.56(m,1H),7.44(dd,J＝10.8,4.9,2H),7.37–7.27(m,4H),7.16(dd,J＝8.3,2.0,1H),7.10(d,J＝8.3,1H),7.04(d,J＝2.0,1H),5.21(s,2H),4.79(s,2H).

C3-6：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝8.05(d,J＝2.3,1H),7.96(d,J＝2.2,1H),7.75–7.68(m,2H),7.61–7.54(m,3H),7.48–7.41(m,2H),7.34–7.28(m,2H),7.17(d,J＝1.1,2H),6.53(t,J＝1.1,1H),4.83(s,2H).

C2-1-1：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝8.20(d,J＝2.2,1H),7.99–7.91(m,4H),7.40(d,J＝2.2,1H),7.35–7.29(m,4H),7.25–7.17(m,5H),7.08–6.99(m,3H),5.21(s,2H),4.78(s,2H),3.61(s,3H).

C2-6-1：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝8.05(dd,J＝17.3,2.3,1H),7.97(dd,J＝8.5,1.1,1H),7.75–7.67(m,2H),7.60–7.53(m,2H),7.43(t,J＝7.8,1H),7.35(t,J＝4.7,2H),7.29(d,J＝5.0,1H),7.12–7.05(m,2H),5.22(d,J＝14.0,2H),4.80(s,2H).

C2-6：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝8.04(s,1H),7.96–7.90(m,1H),7.68(dd,J＝11.2,3.8,2H),7.60(t,J＝7.6,2H),7.53(dd,J＝14.8,7.2,2H),7.41(t,J＝7.6,2H),7.35(dd,J＝10.5,3.3,2H),7.16(s,2H),6.56(d,J＝5.8,1H),4.85(d,J＝5.6,2H).

表5

以上结构对比充分说明了，结构上引入苯亚甲基在活性上完全不如与苯环直接偶联有利。

实施例5化合物C5-1对DNA-PK的抑制活性

DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)是基因组DNA损伤修复过程中的关键蛋白激酶,参与并决定着非同源末端连接DNA损伤修复通路的整个进程.此外DNA-PK还参与了电离辐射诱导的凋亡信号转导通路,免疫细胞V(D)J重组、免疫细胞分化、胰岛素刺激下的细胞应答等过程,具有维持端粒稳定性的功能.DNA-PK活性的升高会降低肿瘤对放射的敏感性。

测定100nM的浓度下对DNA-PK的抑制率，结果显示，C5-1分子对的抑制率在100nM达到了75％，是一个强效的DNA-PK抑制剂。

实施例6化合物C5-1的平板克隆

平板克隆又称平板克隆形成实验，该方法适用于贴壁细胞的实验。主要通过接种肿瘤细胞后，细胞贴壁成活所形成的克隆数量，即细胞克隆形成率(细胞接种存活率)来考察反映肿瘤细胞的增殖能力。克隆细胞是指由单个细胞经持续增长6代以上的培养后，与其后代细胞形成的集合。该集合中包含大小为0.3～1.0，数量为50个以上的细胞。将肿瘤细胞用药物处理后，其增殖能力会受到药物的影响，从而使得克隆产生数量以及形态上的变化。将克隆细胞经染色剂(通常用结晶紫)将细胞中的核酸染成蓝紫色后，能直观的从颜色上判断肿瘤细胞克隆形成的情况，并以此反映出药物抑制细胞增殖的效果。

铺板：取对数生长期的人***细胞Hela，用胰酶进行消化，并把细胞悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基中备用。以细胞数量为100个/孔的密度接种于24孔板中，将孔板置于37℃，5％CO2的培养箱中培养12h。

加药：取出孔板，观察细胞贴壁后，除去上清培养基并设置实验组和对照组。将药物用完全培养基将目标化合物C5-1等倍稀释为20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.375μM的六个浓度，每孔加入1.5mL药液。对照组加入等体积的不含药液的培养基。将孔板置于37℃，5％CO2的培养箱中继续孵育2～3周。

处理：观察孔板中形成肉眼可见的细胞集落时即终止细胞培养，然后除去上清液并用PBS缓冲液反复洗涤两次，再用4％多聚甲醛固定液固定15min，弃去固定液，最后用0.5％结晶紫染色液染色20～30min，再除去染色液并用PBS缓冲液洗去多余的染色。常温下干燥，用照相机拍照，并对集落形成数量进行统计分析，详见图1和图2。

由图可知，Hela细胞的实验组与对照组相比集落形成率明显下降，且呈现出较明显的浓度依赖性。其集落形成与药物浓度呈反比，即药物浓度越高，其克隆形成率越低。在5μM以上的药物浓度孔板中，肿瘤细胞几乎没有形成克隆也没有明显的细胞集落形成，而在1.25μM浓度时，与阴性对照组的细胞相比，已经抑制了过半的克隆形成。

实施例7化合物C5-1分子的药代动力学研究

实验动物：健康成年雄性SD大鼠，6只，体重180～250g。给药途径：尾静脉(i.v.)；灌胃(p.o.)给药剂量：1mg/kg(i.v.)，10mg/kg(p.o.)，给药体积为5ml/kg。给药剂型为静脉给药：DMA/Solutol HS 15/生理盐水(5:10:85,v/v/v)；口服给药：0.5％CMC-Na。

药物配置：i.v.给药组：精密称取适量药物(相当于原形药物1.0mg)，加入DMA0.25ml，Solutol HS15 0.5ml，超声使溶解，后缓慢加入生理盐水至终体积5ml，超声、涡漩混匀。

p.o.给药组：精密称取适量药物(相当于原形药物10.0mg)，0.5％CMC-Na 5ml，超声、涡漩混匀。

实验方案：健康成年SD大鼠6只，分两组(每组i.v.及p.o.各3只)；禁食过夜(自由饮水)后，分别尾静脉及灌胃给药，给药体积5ml/kg；静脉注射给药组分别于给药前及给药后5min,15min,0.5,1,2,4,8,12,24h由眼眶后静脉丛采血0.2ml，4℃离心5min分离血浆，于-20℃保存待测。灌胃给药组分别于给药前及给药后0.5,1,2,4,6,8,12,24h由眼眶后静脉丛采血0.2ml，处理方法同静脉注射给药组。

样品分析：采用LC/MS/MS法测定血浆中的药物浓度，其结果见表6。

表6

实施例8化合物C5-1分子的体内抗肿瘤活性研究

为了研究C5-1在动物体内的抗肿瘤活性，选用细胞株Hela以及A549构建了异种移植瘤模型，实验动物为Balb/c nude小鼠。

实验动物

本课题所用小鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于四川大学生物治疗国家重点实验室动物房(SPF级)。小鼠为SPF级，按照NationalInstitutes of HealthGuide for the Care and Use of Laboratory Animals标准饲养。实验动物的使用由四川大学伦理委员会(Institutional Ethics Committee of Sichuan University)审议批准。实验动物饲养条件：温度16-26℃，相对湿度40％-70％，采用人工照明系统，12h明暗交替，Co60灭菌饲料(北京科澳协力饲料有限公司)，自由饮水。

具体方法如下：

1)胰酶消化对数生长期的Hela和A549肿瘤细胞后，离心收集细胞；用双无(无抗生素无血清)培养基清洗细胞3次；加入适量双无培养基重悬肿瘤细胞，并对肿瘤细胞进行密度测定；根据实验要求将细胞密度调至1×10⁷个/mL。

2)将重悬好的细胞按照每只小鼠1×10⁶个细胞(0.1mL)将细胞接种到小鼠(6-8周龄，体重18-22g)的右腋部皮下。

3)接种后10天左右，小鼠接种部位肿瘤成瘤，体积150～200mm³时，将所有肿瘤体积相近的小鼠随机分组。Hela模型实验设置5组(控制组,阳性药组BEZ235 20mg/kg,C5-110mg/kg,C5-1 20mg/kg,C5-1 40mg/kg,C5-1 50mg/kg)，A549模型实验设置4组(控制组,阳性药组BEZ235 20mg/kg,C5-1 20mg/kg,C5-1 40mg/kg)每组6只。药物溶媒采用PEG300:NMP＝9的混合溶媒,将药物配置成对应的浓度

实验数据记录：每3天测量一次肿瘤体积和小鼠体重，包括肿瘤长径和垂直于长径的短径，单位：毫米(mm)；小鼠体重，单位:克(g)。实验期间需要注意观察小鼠健康状况，如动物活动情况、进水进食情况、小鼠毛发光泽度及颜色、有无腹泻和肿瘤部位有无炎症等。

瘤体积(mm³)＝肿瘤长径×短径×短径/2

抑瘤率(％)＝(对照组肿瘤平均体积－实验组肿瘤平均体积)/对照组肿瘤平均体积×100％。

实验进行30天，试验结果见图3～6。

根据实验结果，C5-1在50,40,20mg/kg给药浓度下，对Hela移植瘤模型的抑瘤率为87.7％,79％,66.6％，阳性药在20mg/kg给药浓度下抑瘤率为66.5％。C5-1在40,20mg/kg给药浓度下,对A549移植瘤模型的抑瘤率为70.16％和66.6％，阳性药在20mg/kg给药浓度下抑瘤率为56.08％。同等浓度下，C5-1的体内抗肿瘤活性接近或略高于阳性药BEZ235。然而在给药过程中，我们观察到，C5-1给药组的小鼠体重平稳，显示了该分子的低毒性。阳性药组的小鼠体重一直低于C5-1给药组，说明这个分子与阳性药相比具有高效低毒的优点。