具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一方面，提供一种金属有机骨架材料-酶复合物的制备方法，包括以下步骤：

将抗氧化酶、过渡金属离子及有机配体溶于溶剂中进行共沉淀反应；

其中，抗氧化酶选自超氧化物歧化酶与过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶或辣根过氧化物酶的组合酶，或谷胱甘肽还原酶与谷胱甘肽过氧化物酶、葡萄糖脱氢酶或乙醇脱氢酶的组合酶；

所述过渡金属离子来源于可溶性金属盐，所述有机配体为咪唑类化合物。

所述金属有机骨架材料-酶复合物具有依赖于pH的蛋白质释放机制，同时依赖于质子海绵效应，摄入细胞后能够有效从偏酸性的内涵体逃逸，从而能够保证其在生理条件下的稳定储存，而被摄入细胞后能够有效从偏酸性的内涵体逃逸，使抗氧化酶在细胞质发挥清除活性氧的功能。具体的，如在pH＝5.0条件下，金属有机骨架材料-酶复合物1h内迅速释放80％左右负载蛋白质，而在pH＝7.4条件下，28h后仅有16％的蛋白质释放。而且金属有机骨架材料-酶复合物具有较好的稳定性与分散性，并能通过简单的分离后进行回收再利用，且能够经过多次重复使用后仍能保持较高的催化活力。具体的，如经过10次重复使用后，酶活仍能保持80％以上。另外，共沉淀法便捷简单，极大地减少了实验合成的成本，且可批量化制备。

在一些实施方式中，超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)或辣根过氧化物酶(HRP)的质量比为1：(0.001～1000)，还可以为1:0.01、1:0.1、1:1、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:100、1:200、1:400、1:500、1:800等。

在一些实施方式中，谷胱甘肽还原酶(GR)与谷胱甘肽过氧化物酶、葡萄糖脱氢酶(GDH)或乙醇脱氢酶(ADH)的质量比为1：(0.001～1000)，还可以为1：(0.001～1000)，还可以为1:0.01、1:0.1、1:1、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:100、1:200、1:400、1:500、1:800等。通过调节级联酶配比可以提高抗氧化效率，消除毒害中间产物积累造成的二次危害。

在一些实施方式中，所述制备方法还包括在进行共沉淀反应后加入活性保护剂及协同增效剂混合，干燥的步骤；

所述活性保护剂可以为糖类、氨基酸、醇类、蛋白质等中的一种或多种。所述糖类包括但不限于葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、壳聚糖等，所述氨基酸可以为精氨酸、甘氨酸等，所述醇类可选自甘油、聚乙二醇等，所述蛋白质可以为人血清白蛋白。所述协同增效剂可以选自维生素及其衍生物、维生素类似物、多肽、核苷酸、醇、酸、酮等中的一种或它们的混合物。所述维生素及其衍生物包括维生素C、维生素C棕榈酸酯、维生素C琥珀酸酯、维生素C磷酸酯、维生素E、维生素E琥珀酸酯，所述多肽优选为谷胱甘肽，所述核苷酸可以为烟酰胺单核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，所述维生素类似物优选为辅酶Q10，所述醇优选为白藜芦醇，所述酸可以为硫辛酸、阿魏酸等，所述酮优选为根皮素。

在一些实施方式中，活性保护剂及协同增效剂的质量百分含量独立地选自0.1％～30％，还可以为0.5％、1％、5％、10％、12％、15％、20％、25％等。

在一些实施方式中，干燥的方式可以为本领域技术人员能够获知的任意方式，例如可以为真空干燥、冷冻干燥及自然风干中的至少一种，干燥的时间为10h～120h。

在一些实施方式中，过渡金属离子可以为锌离子、铜离子或亚铁离子，所述抗氧化酶与所述过渡金属离子的质量比为(0.00001～1)：1，还可以为0.00005:1、0.0001:1、0.0008:1、0.001:1、0.006:1、0.01:1、0.05:1、0.08:1、0.1:1、0.4:1、0.8:1等。优选的，过渡金属离子为锌离子。

在一些实施方式中，有机配体可以为2-甲基咪唑、2-咪唑甲醛、咪唑及苯并咪唑中的一种或多种。优选的，有机配体为2-甲基咪唑。

在一些实施方式中，过渡金属离子与有机配体的摩尔比为1：(0.01～200)，还可以为1:0.1、1:1、1:10、1:20、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:100、1:110、1:120、1:150、1:180等。通过调节过渡金属离子与有机配体的质量比可以调控金属有机骨架材料-酶复合物的粒径、酶负载量、酶活性等，从而可以使所述复合物适用于任意场景。

在一些实施方式中，所述溶剂可以为水、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、乙腈、丙酮及N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。

在一些实施方式中，在进行共沉淀反应后，加入活性保护剂及协同增效剂之前，还包括对所得物质进行离心、洗涤的步骤。

在一些实施方式中，所述离心的速度为4000rpm～15000rpm，离心的时间为2min～20min。

在一些实施方式中，洗涤所用的溶剂为本领域常用溶剂即可，优选为与溶解抗氧化酶、过渡金属离子及有机配体的溶剂相同的溶剂。

在一些实施方式中，为了使溶剂中的溶质完全溶解，可以采用搅拌或超声处理等进行增溶处理，优选为搅拌，所述搅拌的速度为10rpm～1000rpm。

本发明一方面，还提供一种上述所述的制备方法制得的金属有机骨架材料-酶复合物。

本发明另一方面，进一步提供一种含有上述所述的金属有机骨架材料-酶复合物的日化用品、食品、医药材料或药品。

在一些实施方式中，日化用品可以为护肤品，所述护肤品可以为防晒霜、面霜、乳液、化妆水、精华液、冻干粉、洗面奶、沐浴露、面膜等。

在一些实施方式中，食品可以为保健品或休闲食品，所述保健品可以为抗糖化胶囊、抗氧化胶囊等，所述休闲食品可以为果冻、饮料、蜜饯等。

在一些实施方式中，所述医用材料可以为纱布、创可贴、口罩、伤口敷料、牙科填充材料、牙科种植材料等，所述药品可以为膏药。

以下结合具体实施例和对比例对本发明的金属有机骨架材料-酶复合物及其制备方法和应用作进一步详细的说明。

实施例1

(1)分别配制1.25mol/L的2-甲基咪唑水溶液，0.31mol/L的硝酸锌水溶液，2.5mg/mL SOD溶液，7.0mg/mL CAT溶液，室温下超声10min直至完全溶解，其中，锌离子与2-甲基咪唑的摩尔比为1:40；

(2)将160μL硝酸锌水溶液、50μL SOD溶液、100μL CAT溶液同时加入1.6mL 2-甲基咪唑水溶液中，室温下利用转速为600rpm的磁力搅拌器搅拌30min；

(3)将步骤(2)所得溶液在15000rpm的速度下离心5min，去掉上清后用去离子水重悬，重复洗涤2次；

(4)将步骤(3)所得沉淀物在-20℃下预冻12h，冷冻干燥24h，即得金属有机骨架材料-酶复合物，记为[email protected]。

本实施例制得的金属有机骨架材料-酶复合物的扫描电镜如图1所示。由图1可知，金属有机骨架材料-酶复合物主体形状近似为球形，颗粒粒径在400nm～700nm之间。金属有机骨架材料-酶复合物的热重曲线如图2所示。由图2可知，金属有机骨架材料-酶复合物在250℃左右开始分解，而ZIF-8晶体在450℃左右发生降解，根据曲线差异可计算得到抗氧化酶在复合物中的质量分数约为4.5wt％。金属有机骨架材料-酶复合物在不同pH条件下的蛋白释放曲线如图3所示。由图3可知，在pH＝5.0条件下，1小时内迅速释放80％左右负载蛋白质，而在pH＝7.4条件下，28小时后仅有16％的蛋白质释放。说明金属有机骨架材料-酶复合物具有的依赖于pH的蛋白质释放机制，既能够保证其在生理条件下的稳定储存，又能够保证其被摄入细胞后能够有效从偏酸性的内涵体逃逸，使抗氧化酶在细胞质发挥清除活性氧的功能。

实施例2

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：2-甲基咪唑水溶液的浓度为1.875mol/L。具体步骤如下：

(1)分别配制1.875mol/L的2-甲基咪唑水溶液，0.31mol/L的硝酸锌水溶液，2.5mg/mL SOD溶液，7.0mg/mL CAT溶液，室温下超声10min直至完全溶解，其中，锌离子与2-甲基咪唑的摩尔比为1:60；

(2)将160μL硝酸锌水溶液、50μL SOD溶液、100μL CAT溶液同时加入1.6mL 2-甲基咪唑水溶液中，室温下利用转速为600rpm的磁力搅拌器搅拌30min；

(3)将步骤(2)所得溶液在15000rpm的速度下离心5min，去掉上清后用去离子水重悬，重复洗涤2次；

(4)将步骤(3)所得沉淀物在-20℃下预冻12h，冷冻干燥24h，即得金属有机骨架材料-酶复合物，记为[email protected]。

本实施例制得的金属有机骨架材料-酶复合物的扫描电镜如图4所示。由图4可知，金属有机骨架材料-酶复合物主体形状近似为球形，颗粒粒径在200nm～400nm之间。

实施例3

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：2-甲基咪唑水溶液的浓度为2.5mol/L。具体步骤如下：

(1)分别配制2.5mol/L的2-甲基咪唑水溶液，0.31mol/L的硝酸锌水溶液，2.5mg/mL SOD溶液，7.0mg/mL CAT溶液，室温下超声10min直至完全溶解，其中，锌离子与2-甲基咪唑的摩尔比为1:80；

(2)将160μL硝酸锌水溶液、50μL SOD溶液、100μL CAT溶液同时加入1.6mL 2-甲基咪唑水溶液中，室温下利用转速为600rpm的磁力搅拌器搅拌30min；

(3)将步骤(2)所得溶液在15000rpm的速度下离心5min，去掉上清后用去离子水重悬，重复洗涤2次；

(4)将步骤(3)所得沉淀物在-20℃下预冻12h，冷冻干燥24h，即得金属有机骨架材料-酶复合物，记为[email protected]。

本实施例制得的金属有机骨架材料-酶复合物的扫描电镜如图5所示。由图5可知，金属有机骨架材料-酶复合物主体形状近似为球形，颗粒粒径在80nm～200nm之间。

实施例4

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：2-甲基咪唑水溶液的浓度为3.125mol/L。具体步骤如下：

(1)分别配制3.125mol/L的2-甲基咪唑水溶液，0.31mol/L的硝酸锌水溶液，2.5mg/mL SOD溶液，7.0mg/mL CAT溶液，室温下超声10min直至完全溶解，其中，锌离子与2-甲基咪唑的摩尔比为1:100；

(2)将160μL硝酸锌水溶液、50μL SOD溶液、100μL CAT溶液同时加入1.6mL 2-甲基咪唑水溶液中，室温下利用转速为600rpm的磁力搅拌器搅拌30min；

(3)将步骤(2)所得溶液在15000rpm的速度下离心5min，去掉上清后用去离子水重悬，重复洗涤2次；

(4)将步骤(3)所得沉淀物在-20℃下预冻12h，冷冻干燥24h，即得金属有机骨架材料-酶复合物，记为[email protected]。

本实施例制得的金属有机骨架材料-酶复合物的扫描电镜如图6所示。由图6可知，金属有机骨架材料-酶复合物主体形状近似为球形，颗粒粒径在60nm～160nm之间。

实施例1～4制得的金属有机骨架材料-酶复合物的X射线衍射图谱如图7所示。由图7可知，金属有机骨架材料-酶复合物表现出了金属有机骨架化合物(ZIF-8)的晶体结构和良好的结晶度。

实施例5

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：步骤(2)中CAT溶液体积为50μL。

实施例6

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：步骤(2)中CAT溶液体积为200μL。

对实施例1～6中制得的金属有机骨架材料-酶复合物进行酶活测定：

SOD酶活测定：利用WST-8法测定SOD的酶活性，具体步骤：配制WST-8/酶工作液和反应启动工作液，并根据表1设置样品孔与对照孔。加入反应启动工作液后在37℃下孵育30min，然后测量450nm处的吸光度。将SOD酶活力定义为：偶联反应体系中抑制百分率为50％时，SOD具有1个酶活力单位(1U)。

抑制百分率＝[(A_B1-A_B2)-(A_S-A_B3)]/(A_B1-A_B2)×100％

SOD活力＝抑制百分率/(1-抑制百分率)(U)

表1 SOD酶活测定样品孔与对照孔设置表

CAT酶活测定：配制50mM，pH＝7.0的磷酸缓冲溶液，加入30％的过氧化氢使其浓度为20mM。取980μL过氧化氢溶液，加入20μL酶溶液，利用紫外-可见分光光度计测定240nm处吸光度值变化。将CAT酶活力单位(1U)定义为：25℃下，每分钟内使底物吸光度值上升0.001所需要的酶量。

相对酶活及酶活收率的计算公式如下：

相对酶活＝A/A_f×100％

其中A_f为对应蛋白浓度时游离酶的活性，A为金属有机骨架材料-酶复合物的表观总活性。

酶活收率＝A/A_pre×100％

其中A为金属有机骨架材料-酶复合物的表观总活性，A_pre为投料时加入的游离酶的总活性。

测试结果如表2和3所示：

表2不同金属有机骨架材料-酶复合物的相对酶活

表3不同金属有机骨架材料-酶复合物的酶活保留

实施例7

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：加入了活性保护剂和协同增效剂、组分体积不同。具体步骤如下：

(1)分别配制1.25mol/L的2-甲基咪唑水溶液，0.31mol/L的硝酸锌水溶液，2.5mg/mL SOD溶液，7.0mg/mL CAT溶液，室温下超声10min直至完全溶解；

(2)将16mL硝酸锌水溶液、5mL SOD溶液、10mL CAT溶液同时加入160mL 2-甲基咪唑水溶液中，室温下利用转速为600rpm的磁力搅拌器搅拌30min；

(3)将步骤(2)所得溶液在15000rpm的速度下离心5min，去掉上清后用去离子水重悬，重复洗涤2次；

(4)将步骤(3)所得沉淀物用10mL去离子水重悬后，加入8wt％的蔗糖及甘氨酸(质量比为60:40)的混合物及5wt％的维生素C、谷胱甘肽及烟酰胺单核苷酸(质量比为50:30:20)的混合物，在-20℃下预冻12h，冷冻干燥24h，即得金属有机骨架材料-酶复合物。

实施例8

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：加入的抗氧化酶为超氧化物歧化酶与谷胱甘肽过氧化物酶的组合。具体步骤如下：

(1)分别配制1.875mol/L的2-甲基咪唑水溶液，0.31mol/L的硝酸锌水溶液，2.5mg/mL SOD溶液，1.0mg/mL GPx溶液，室温下超声10min直至完全溶解；

(2)将160μL硝酸锌水溶液、50μL SOD溶液、100μL GPx溶液同时加入1.6mL 2-甲基咪唑水溶液中，室温下利用转速为600rpm的磁力搅拌器搅拌30min；

(3)将步骤(2)所得溶液在15000rpm的速度下离心5min，去掉上清后用去离子水重悬，重复洗涤2次；

(4)将步骤(3)所得沉淀物用0.1mL去离子水重悬，加入8wt％的谷胱甘肽，在-20℃下预冻12h，冷冻干燥24h，即得金属有机骨架材料-酶复合物，记为[email protected]。

实施例9

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：加入的抗氧化酶为谷胱甘肽还原酶与谷胱甘肽过氧化物酶的组合。具体步骤如下：

(1)分别配制1.875mol/L的2-甲基咪唑水溶液，0.31mol/L的硝酸锌水溶液，1.0mg/mL GR溶液，1.0mg/mL GPx溶液，室温下超声10min直至完全溶解；

(2)将160μL硝酸锌水溶液、50μL GR溶液、50μL GPx溶液同时加入1.6mL2-甲基咪唑水溶液中，室温下利用转速为600rpm的磁力搅拌器搅拌30min；

(3)将步骤(2)所得溶液在15000rpm的速度下离心5min，去掉上清后用去离子水重悬，重复洗涤2次；

(4)将步骤(3)所得沉淀物用0.1mL去离子水重悬，加入8wt％的谷胱甘肽与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的混合物(摩尔比为1:10)，在-20℃下预冻12h，冷冻干燥24h，即得金属有机骨架材料-酶复合物，记为[email protected]，测得的扫描电镜图如图8所示。

实施例10

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：加入的抗氧化酶为谷胱甘肽还原酶与乙醇脱氢酶的组合。具体步骤如下：

(1)分别配制1.875mol/L的2-甲基咪唑水溶液，0.31mol/L的硝酸锌水溶液，1.0mg/mL GR溶液，6.6mg/mL ADH溶液，室温下超声10min直至完全溶解；

(2)将160μL硝酸锌水溶液、50μL GR溶液、50μL ADH溶液同时加入1.6mL2-甲基咪唑水溶液中，室温下利用转速为600rpm的磁力搅拌器搅拌30min；

(3)将步骤(2)所得溶液在15000rpm的速度下离心5min，去掉上清后用去离子水重悬，重复洗涤2次；

(4)将步骤(3)所得沉淀物用0.1mL去离子水重悬，加入1wt％的氧化型谷胱甘肽、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的混合物(摩尔比为1:2)，在-20℃下预冻12h，冷冻干燥24h，即得金属有机骨架材料-酶复合物，记为[email protected]，测得的扫描电镜图如图9所示。

实施例11

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：加入的抗氧化酶为谷胱甘肽还原酶与葡萄糖脱氢酶的组合。具体步骤如下：

(1)分别配制1.875mol/L的2-甲基咪唑水溶液，0.31mol/L的硝酸锌水溶液，1.0mg/mL GR溶液，7.5mg/mL GDH溶液，室温下超声10min直至完全溶解；

(2)将160μL硝酸锌水溶液、50μL GR溶液、50μL GDH溶液同时加入1.6mL2-甲基咪唑水溶液中，室温下利用转速为600rpm的磁力搅拌器搅拌30min；

(3)将步骤(2)所得溶液在15000rpm的速度下离心5min，去掉上清后用去离子水重悬，重复洗涤2次；

(4)将步骤(3)所得沉淀物用0.1mL去离子水重悬，加入8wt％的氧化型谷胱甘肽、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与葡萄糖的混合物(摩尔比为1:2:5)，在-20℃下预冻12h，冷冻干燥24h，即得金属有机骨架材料-酶复合物，记为[email protected]，测得的扫描电镜图如图10所示。

对比例1

本对比例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：未添加抗氧化酶。

对比例2

本对比例与实施例2的制备方法基本相同，不同之处在于：未添加抗氧化酶。

对比例3

本对比例与实施例3的制备方法基本相同，不同之处在于：未添加抗氧化酶。

对比例4

本对比例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：未添加CAT。将金属有机骨架材料-酶复合物记为[email protected]。

对比例5

本对比例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：抗氧化酶为SOD和GR。将金属有机骨架材料-酶复合物记为[email protected]。

对比例6

本对比例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：抗氧化酶为SOD和GDH。将金属有机骨架材料-酶复合物记为[email protected]。

利用MTT法检测实施例1～3及对比例1～3中制得的金属有机骨架材料-酶复合物的细胞毒性。具体步骤：以每孔8000个细胞的密度将HeLa细胞接种于96孔板，将含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM培养基在37℃、含有5％CO₂的培养箱中过夜培养。除去培养基，用PBS洗涤1次，加入200μL含有不同浓度(0、10、20、30、40、50μg/μL)的金属有机骨架材料-酶复合物或金属有机骨架化合物的培养基孵育24h。除去培养基，用PBS洗涤2次，加入100μL含有0.5mg/mL MTT的DMEM培养基，37℃下孵育4h。加入10μLFormazan溶解液，37℃下孵育4h，测量560nm下的吸光度值。以不含细胞的样品孔作为空白组(blank)，不加入药物的样品孔作为控制组(control)，加药处理的样品孔记为样品组(sample)，根据下式计算细胞存活率：细胞存活率＝(A_s-A_b)/(A_c-A_b)×100％。测试结果如图11所示。由图11可知，孵育浓度为50μg/μL时仅导致细胞活力降低约20％，表明金属有机骨架材料-酶复合物及金属有机骨架化合物(ZIF-8)具有良好的生物相容性。

金属有机骨架材料-酶复合物的体外抗氧化活性测试：

以甲基紫精(百草枯，PQ)作为氧化还原毒剂，观察金属有机骨架材料-酶复合物对细胞的保护作用。具体操作为：以每孔10000个细胞的密度将HeLa细胞接种于96孔板，37℃下过夜培养后除去培养基，用PBS洗涤1次；加入200μL含有30μg/μL的金属有机骨架材料-酶复合物或金属有机骨架化合物，37℃下孵育10h，使细胞完成内吞及释放过程。除去培养基，用PBS洗涤2次，加入200μL含6mM PQ的培养基，37℃下孵育12h。除去培养基，加入100μL含MTT试剂的培养基37℃下孵育4h，加入100μL Formazan溶解液，37℃下孵育4h，测量560nm下的吸光度值，细胞存活率分析方法同上。实施例1及对比例1对百草枯诱导的氧化应激细胞毒性的保护情况如图12所示。由图12可知，在6mM PQ处理下细胞会明显降低存活率至36％(控制组)，而预先与实施例1中制得的金属有机骨架材料-酶复合物孵育后，能够将细胞存活率提高20％。与此同时，可观察到游离抗氧化酶、金属有机骨架化合物(ZIF-8)并不表现出明显的保护效果。

利用WST-8法检测实施例1、对比例4～6中制得的金属有机骨架材料-酶复合物中SOD的催化活性，测试结果如表4所示。由表4可知，按照实施例1采用的抗氧化酶组合的SOD活性显著比SOD单酶、其他组合酶制备的金属有机骨架材料-酶复合物的活性更高。

表4不同金属有机骨架材料-酶复合物的SOD酶活

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。