具体实施方式

本文上面的发明内容在此通过引用的方式重复且不完全重复以避免冗长重复。

帕金森病(PD)是最常见的运动活动神经退行性疾病，全世界有超过1000万人患有该疾病。在PD中牵涉α-突触核蛋白且其由基因SNCA编码。在PD中，α-突触核蛋白形成聚集体且为路易体的主要成分。SNCA基因的突变引起α-突触核蛋白的聚集，且因而引起帕金森病的家族性形式。α-突触核蛋白的C-端结构域(CTD)防止α-突触核蛋白的聚集(参见图1)。

LRP/LR是多功能受体蛋白，其在神经退行性病症(包括阿尔茨海默病和朊病毒病症)的发病机制中起着至关重要的作用。先前已表明，根据PCT/IB2012/054968的公开内容，敲除(下调)LRP/LR是阿尔茨海默病的有用治疗方案。

相比之下且令申请人惊讶的是，现在发现LRP/LR的过表达是治疗帕金森病(PD)的有益治疗方案。鉴于先前的发现，这是完全出乎意料的。不受理论的限制，这指示在神经退行性病症，特别是PD中涉及的生化途径的复杂性和不可预测性质。

PD的诊断依赖于对上述疾病特性的观察，因为没有可用于诊断PD的特定测试。非运动症状在早期阶段用于诊断疾病，因为非运动症状更为突出。目前还没有治愈PD的方法，但只有有助于控制症状的姑息治疗。这些治疗选项包括药物诸如左旋多巴、多巴胺和单胺氧化酶B抑制剂。PD的一线治疗是左旋多巴(levodopa/L-Dopa)，与外周脱羧酶抑制剂配对以防止在外周转化为多巴胺。然而，高剂量或长期使用左旋多巴会导致不良副作用，诸如运动障碍、运动波动和冲动控制障碍。其他非药物对症疗法包括功能性立体定向神经外科手术(深部脑刺激)、物理疗法、言语疗法和饮食改变。需要用于治疗PD的新化合物。

PD主要由位于黑质致密部(SNPC)的产多巴胺的神经元的缺失来定义且最终招致PD的突出运动特征(Dexter&Jenner，2013年)。位于SNPC中的这些产多巴胺的神经元的缺失不仅引起器官萎缩，而且引起路易体的存在(Dauer&Prezedborski，2003年)。路易体是由超过76种不同组分组成的神经元内蛋白包涵体(Wakabayashi等人，2007年)。运动和睡眠调节是SNPC的两个主要功能，且因此这些神经元的缺失导致SNPC的这些功能和其他功能失调(Lima等人，2009年)。在PD中，神经胶质细胞在氧化应激期间释放的氧化毒素也可导致的神经元细胞死亡(Jenner，2003年)。

散发形式的PD占PD病例总数的90％(Yasuda&Mochizuki，2010年)且可由未知退行性疾病过程、毒素、代谢紊乱或药物引起(Dickson，2012年)。只有少数PD病例是家族性的且是由于编码蛋白、α-突触核蛋白和帕金蛋白的基因发生突变造成的(Yasuda&Mochizuki，2010年)。α-突触核蛋白是路易体的主要成分且由基因SNCA编码(Yasuda&Mochizuki，2010年)。SNCA基因的突变引起α-突触核蛋白的聚集且因而引起PD的家族形成(Yasuda&Mochizuki，2010年)。帕金蛋白是E3泛素连接酶，其参与泛素介导的蛋白降解(Seirafi等人，2015年)。PARK2基因编码帕金蛋白且此基因的突变引起帕金蛋白的功能缺失(Kitada等人，1998年)。帕金蛋白负责O-糖基化形式的α-突触核蛋白的泛素化，且因此帕金蛋白的功能缺失引起α-突触核蛋白的聚集(Shimura等人，2000年)。Yang等人(2003年)证明帕金蛋白的过表达降低α-突触核蛋白的毒性且因而保护细胞免受α-突触核蛋白的破坏性影响(Yang等人，2003年)。

19kDa蛋白(α-突触核蛋白)在水溶液中没有确定的结构(Stefanis等人，2012年)。α-突触核蛋白主要发现于突触囊泡的神经元细胞以及细胞核中(Auluck等人，2010年)。该蛋白由CTD(CTD)、斑块的非淀粉样β组分(NAC)结构域和NTD(NTD)组成(Xu&Pu，2016年)。NTD参与膜结合(Vamvaca等人，2009年)。NAC域是负责聚集的结构域(Rajagopalan等人，2001年)且CTD与NAC结构域相互作用以抑制聚集(Emamzadeh，2016年)。α-突触核蛋白的NAC区域也是发现于阿尔茨海默病(AD)中的斑块的成分(Bendor等人，2013年)。α-突触核蛋白具有多种功能，包括通过ERK/MAPK途径的神经元分化(Fu等人，2000年)，从而引起通过抑制酪氨酸羟化酶下调多巴胺生物合成(Rodriguez-Araujo等人，2015年)。

路易体的主要成分是纤维状形式的α-突触核蛋白，这是由于突变和复制(Dolgacheva等人，2018年)。患有PD的患者还具有高水平的磷酸化和硝化形式的α-突触核蛋白，这可能指示这些翻译后修饰可促进α-突触核蛋白的聚集，从而促进PD(Rocha等人，2018年)。功能失调的溶酶体清除和突变的溶酶体水解酶有利于α-突触核蛋白聚集，且因此这些个体PD进展的几率更高(Sidransky等人，2009年)。自噬-溶酶体途径(ALP)以及泛素-蛋白酶体系统的失调(UPS)有利于α-突触核蛋白聚集，因为这些系统引起α-突触核蛋白降解(Rocha等人，2018年)。最近的研究还证明，CTD截断有利于α-突触核蛋白的聚集(van derWateren等人，2018年)。

在下文中，申请人揭示人胚肾(HEK293)细胞用pCIneo-LRP::FLAG稳定转染，这引起成功的LRP::FLAG过表达。LRP::FLAG过表达引起：(i)α-突触核蛋白水平增加，(ii)α-突触核蛋白和LRP/LR之间的共定位，(iii)LRP/LR和帕金蛋白之间的共定位，以及(iv)在MPP+(帕金森病诱导剂)存在下LRP::FLAG过表达HEK293细胞的细胞活力增加。

蛋白印迹分析揭示LRP::FLAG过表达后α-突触核蛋白的CTD水平显著增加。用重组α-突触核蛋白处理后的MTT测定揭示，与未转染的细胞相比，LRP::FLAG转染的HEK293和SH-SY5Y细胞的细胞活力增加。不受理论的限制，申请人提供用于治疗和/或预防PD的LRP/LR，其中LRP/LR用于向有此需要的人或动物给药，并且其中所述LRP/LR增加α-突触核蛋白的C-端结构域(CTD)，从而防止其聚集以改善PD。在使用时，增加CTD还可同时减少细胞损伤和/或维持多巴胺水平。维持受试者体内多巴胺水平抑制继续使用高水平左旋多巴作为帕金森病治疗方案的需要。因此，经由通过LRP/LR维持左旋多巴水平，可向有此需要的受试者给药相对较少的左旋多巴，同时具有更持久的效果。也示出LRP/LR增加细胞活力。申请人已发现这是显著优势，其提供改进的帕金森病治疗和/或预防方案。

pCIneo-moLRP::FLAG转染和未转染的HEK293细胞的MTT测定分析指示，在500uM和750nM 1-甲基-4-苯基吡啶碘化物(MPP+)(PD诱导剂)存在下，LRP::FLAG过表达HEK293细胞的细胞活力显著增加，如图7A和7B所示。LRP/LR过表达促进的帕金蛋白水平增加可进一步提供维持α-突触核蛋白水平和/或抑制或阻碍α-突触核蛋白水平的聚集。

根据本发明的第一方面，提供用于治疗和/或预防帕金森病的37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，其中LRP/LR和/或其片段用于向有此需要的受试者给药。LRP/LR可包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所列的肽/蛋白序列表，或其片段，诸如具有如SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5中所列的序列表的片段。另选地和/或附加地，LRP/LR可包含与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中所列的序列或其片段具有至少80％同源性的肽/蛋白序列表。更进一步地，LRP/LR可包含同源物或其片段，以及片段的同源物，其中LRP/LR可包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中所列的肽/蛋白序列表。

在使用时，所述LRP/LR增加人或动物体内α-突触核蛋白的C-端结构域(CTD)，从而防止其聚集以改善和/或治疗和/或预防PD。在使用时，增加CTD还可提供细胞损伤的伴随减少和/或多巴胺水平的维持，从而改善和/或治疗和/或预防PD。LRP/LR可与左旋多巴(levo-dopa/l-dopa)组合用于治疗和/或预防PD，其中LRP/LR有利于维持多巴胺水平，从而需要更少的左旋多巴并抑制高左旋多巴用量和/或持续使用左旋多巴的负面副作用。LRP/LR过表达有利于的帕金蛋白水平增加可进一步提供维持α-突触核蛋白水平和/或抑制或阻碍α-突触核蛋白水平的聚集。

SEQ ID NO:1可为人LRP/LR的肽/蛋白序列，并且可具有以下序列：

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SEQ ID NO:2可为小鼠(小家鼠)LRP/LR的肽/蛋白序列，并且可具有以下序列：

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应理解，LRP/LR为高度保守的，并且为了实施在本文描述、说明和/或例示的本发明，还可利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的同源物或片段，和/或片段的同源物。

LRP/LR的肽/蛋白序列或者其同源物或片段，或片段的同源物，可与附加的蛋白序列、氨基酸序列、肽、蛋白或抗体结合、或键合、或连接、或缀合或缔合。另选地和/或附加地，LRP/LR的肽/蛋白序列可形成更大和/或更长的蛋白序列的一部分。在本发明的特定实施方案中，LRP/LR可可与FLAG蛋白结合、或键合、或连接、或缀合或缔合，使得在使用时，LRP/LR可用FLAG标记。FLAG蛋白可包括肽/蛋白序列，该肽/蛋白序列包括至少一个序列基序DYKDDDDK(SEQ ID NO:3)。FLAG用于帮助评估和/或量化和/或解释以下实施例部分中的实验。尽管在实施例中使用，但为了实施要求保护的发明，这不是必须的。然而，本领域技术人员可能希望包括标签诸如FLAG。

LRP/LR片段的示例性实施方案被例示为蛋白/肽，该蛋白/肽具有与如SEQ ID NO:1的从氨基酸残基102至氨基酸残基295的片段对应的SEQ ID NO:4和/或与如SEQ ID NO:2的从氨基酸残基102至氨基酸残基295的片段对应的SEQ ID NO:5中所列的序列。

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SEQ ID NO:5可为小鼠LRP/LR片段的肽/蛋白序列，并且可具有以下序列：

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LRP/LR和/或其片段可被配制成药物组合物，该药物组合物可进一步包括用于向受试者肠胃外或非肠胃外给药的药物载体。非肠胃外给药可包括但不限于以下组中的至少一种：口服、鼻内、直肠、阴道、眼睛和透皮给药。典型地，非肠胃外给药可经口服。肠胃外给药可包括静脉内、皮下和肌肉内给药中的至少一种。典型地，肠胃外给药可经静脉内。药物组合物可进一步包括左旋多巴。药物组合物可进一步包括多巴胺和/或单胺氧化酶B抑制剂和/或赋形剂。

根据本发明的第二方面，提供包含37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段和载体的药物组合物，该药物组合物用于治疗和/或预防帕金森病，其中药物组合物用于向有此需要的受试者给药。药物组合物还可包括左旋多巴(levo-dopa/l-dopa)。药物组合物可进一步包括多巴胺和/或单胺氧化酶B抑制剂和/或赋形剂。

根据本发明的第三方面，提供增加人或动物体内α-突触核蛋白C-端结构域(CTD)的方法和/或减少细胞损伤的方法和/或维持人或动物体内的多巴胺水平的方法和/或增加驻留蛋白水平的方法，该方法包含以下步骤：

(i)转染细胞以产生37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，从而增加LRP/LR和/或其片段的细胞水平；或者

(ii)向细胞提供LRP/LR和/或其片段以增加LRP/LR和/或其片段的细胞水平，使得在使用时，所述LRP/LR增加人或动物体内α-突触核蛋白的C-端结构域(CTD)，从而防止其聚集以改善和/或治疗和/或预防PD，和/或使得LRP/LR减少细胞损伤和/或维持人或动物体的多巴胺水平，和/或使得LRP/LR增加帕金蛋白水平/浓度，从而改善和/或治疗和/或预防PD。

应理解，转染细胞以产生37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或片段的步骤可经由本领域已知的程序进行，包括将转染剂引入细胞中。

维持人或动物体内多巴胺水平的方法可进一步包括向受试者提供左旋多巴(l-dopa/levo dopa)以及LRP/LR或其片段的步骤。在使用时，LRP/LRP和/或其片段有利于维持受试者体内的多巴胺水平。维持受试者体内多巴胺水平避免频繁使用左旋多巴和/或反过来抑制与受试者长期使用左旋多巴相关联的不良副作用。进一步地，维持受试者体内多巴胺水平抑制对持续使用高水平左旋多巴的需要。该方法允许向受试者给药相对较少的左旋多巴且具有更持久的效果。LRP/LR和/或其片段与左旋多巴的组合可被配制成药物组合物，用于向有此需要的受试者给药。该方法可进一步包括向受试者提供多巴胺和/或单胺氧化酶B抑制剂的步骤。

根据本发明的第四方面，提供治疗和/或预防帕金森病的方法，该方法包含向有此需要的受试者给药37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段的步骤。

在使用时，所述LRP/LR增加人或动物体内α-突触核蛋白的C-端结构域(CTD)，从而防止其聚集以改善和/或治疗和/或预防PD。在使用时，增加CTD还可提供细胞损伤的伴随减少和/或多巴胺水平的维持，从而改善和/或治疗和/或预防PD。该方法可进一步包括向受试者提供左旋多巴(levo dopa/l-dopa)和/或多巴胺和/或单胺氧化酶B抑制剂的步骤。

根据本发明的第五方面，提供用于治疗创伤的37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，其中LRP/LR和/或其片段用于向有此需要的受试者给药。LRP/LR可包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所列的肽/蛋白序列表，或其片段，诸如具有如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中所列的序列表的片段。另选地和/或附加地，LRP/LR可包含与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中所列的序列或其片段具有至少80％同源性的肽/蛋白序列表。更进一步地，LRP/LR可包含同源物或其片段，以及片段的同源物，其中LRP/LR可包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5中所列的肽/蛋白序列表。创伤优选地为皮肤损害，但也可为内脏的创伤。

现在将描述本发明的具体但非限制性的实施方案。申请人设想进行进一步的工作，包括但不限于体内和体外实验。

实施例：

下面的实施例用于进一步例示本发明且在其范围内是非限制性的。

实施例1-用于阻止帕金森病的化合物。

缩写词的列表

AD 阿尔茨海默病

ALP 自噬-溶酶体途径

BCA 二辛可宁酸

BSA 牛血清白蛋白

CTD C-端结构域

DAPI 二脒基-2-苯基吲哚

DLD-1 晚期结直肠癌细胞

DMEM Dulbecco改良的eagle培养基

DMSO 二甲基亚砜

EDTA 乙二胺四乙酸

ELISA 酶联免疫吸附测定

FBS 胎牛血清

HEK293 人胚肾

HRP 辣根过氧化物酶

hTERT 人端粒酶逆转录酶

L-Dopa 左旋多巴

LRP/LR 37kDa层粘连蛋白受体前体/67kDa高亲和力层粘连蛋白受体

MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物

NAC 斑块的非淀粉样蛋白-β组分

PBS 磷酸盐缓冲盐水

PCA 原儿茶酸

PD 帕金森病

P/S 青霉素/链霉素

PVDF 聚偏二氟乙烯

RIPA 放射免疫沉淀测定

SDS PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳

SNPC 黑质致密部

UPS 泛素-蛋白酶体系统

实验程序(实施例1)：

细胞培养

使用HEK293细胞系，因为它常用于帕金森病(PD)研究(Schlachetzki等人，2013年)。细胞培养基由Dulbecco改良的eagle培养基(DMEM)(Hyclone)和Ham's F12按1:1的比例组成。该混合物补充有1％青霉素/链霉素(P/S)和15％胎牛血清(FBS)，以创建补充培养基，该培养基将为细胞提供必需的营养物质，其包括生长因子和P/S，以防止细菌和真菌的污染。当需要时更新营养培养基。细胞在培养箱中培养，该培养箱维持湿度、pH值、37℃下和5％CO₂大气成分以模拟体内条件。一旦细胞达到80％的融合，它们通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤随后通过添加胰蛋白酶-EDTA重新悬浮来传代。细胞重新悬浮后，添加培养基以灭活胰蛋白酶，并且将细胞悬浮液稀释到新烧瓶中。向两个烧瓶中添加新鲜培养基。收获转染和未转染的细胞以用于进一步应用。SH-SY5Y细胞系是另一种广泛用于PD研究的细胞系，因为它显示出儿茶酚胺能表型。证实转染后也接受SH-SY5Y细胞。将细胞维持在与HEK293细胞相同的条件下。SH-SY5Y细胞用于MTT细胞活力测定。还研究在1-甲基-4-苯基吡啶碘化物(MPP+)(PD诱导剂)存在下LRP::FLAG过表达HEK293细胞。晚期结直肠癌细胞(DLD-1)细胞被用于某些帕金蛋白的共聚焦显微镜研究。

细胞转染

细胞的转染用于过表达感兴趣的蛋白。未转染的HEK293细胞将用作对照。在此研究中，通过使用DNA构建体、pCIneo-moLRP::FLAG(Vana&Weiss，2006年)，转染被用于稳定过表达LRP::FLAG。通过过表达LRP::FLAG，可确定对α-突触核蛋白的影响。按照ClontechXfectTM转染方案，一旦HEK293细胞达到50-70％融合，就在T25烧瓶(25cm²)中执行转染。简而言之，将10μg pCIneo-moLRP::FLAG质粒DNA制成最终体积为200μl的Xfect ReactionBuffer，随后添加3μl Xfect Polymer。然后将此溶液在室温下温育10分钟，以允许形成纳米颗粒复合物。然后将含有质粒DNA的纳米颗粒复合物添加亚融合细胞培养物中，随后再悬浮并在加湿培养箱中在37℃和5％CO₂下温育48小时。温育48小时后去除所有培养基并更换为新鲜的完全生长培养基。然后用作为选择性处理的800ng/ml Geneticin处理转染的细胞，且此后用400ng/ml处理以维持转染的细胞群。

共聚焦显微镜

共聚焦显微镜是可视化工具，其用于确定感兴趣的荧光标记蛋白的定位。在这项研究中使用共聚焦显微镜来确定LRP/LR是否与α-突触核蛋白共定位。在6孔板中，细胞以每孔1.2×10⁵个细胞的密度接种到盖玻片(Labocare-18X18 mm；0.19mm厚)上。然后将细胞在加湿培养箱中在37℃和5％CO₂下温育过夜以允许细胞附着。实验的其余部分在轻轻摇动下执行。温育后，将细胞在2ml 1X PBS中洗涤3分钟。然后将细胞在室温下用2ml 4％甲醛固定在盖玻片上20分钟。一旦细胞固定后，将细胞按上述洗涤3次，随后在室温下用3ml 0.1％Triton X-100透化20分钟。如上所述洗涤细胞，随后用2ml 0.5％牛血清白蛋白(BSA)的1XPBS溶液封闭25分钟。一旦细胞被封闭后，就执行用2ml PBS洗涤一次达2分钟。将一抗在500μl 0.5％BSA中稀释(1/200)并添加到细胞中，随后在4℃下温育过夜。温育后，将细胞用2ml0.5％BSA的1X PBS溶液洗涤3次，每次2分钟。然后将二抗在500μl 0.5％BSA中稀释(1/500)并添加到细胞中，随后在室温下在黑暗中温育一小时。然后在黑暗中将细胞用2ml 1X PBS洗涤3次，每次2分钟。为了染色细胞核，将1ml的0.1μl/ml二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)添加到细胞中。然后将盖玻片在室温下在黑暗中温育5分钟，随后在黑暗中用2ml 1X PBS洗涤4次，每次2分钟。然后将盖玻片安装在带有Sigma Fluoromount(Sigma)的玻璃显微镜载玻片上并在黑暗中温育一个半小时。然后将样品储存在4℃下，直到需要使用Zeiss LSM 780共聚焦显微镜进行可视化。有关所用的所有抗体的列表，请参见表1。

表1：共聚焦显微镜中所用的抗体的列表

从细胞中提取蛋白：

从细胞裂解物中提取蛋白样品以确定蛋白浓度并执行蛋白印迹分析。为了从细胞中提取蛋白样品，制备细胞裂解物。首先通过从烧瓶中去除所有培养基并用5ml 1XPBS洗涤来收获细胞。然后通过添加2ml胰蛋白酶/EDTA将细胞重新悬浮在培养瓶中并在37℃下温育5分钟。为了灭活胰蛋白酶/EDTA，向烧瓶中添加8ml培养基，并且将重悬细胞转移到15mlFalcon离心管中并以5000rpm离心10分钟。然后弃去上清液，随后将100-250μl 1X放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液添加到剩余的细胞沉淀中。RIPA缓冲液由1％Triton X-100、150mMNaCl、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5％脱氧胆酸钠、50mM Tris-HCl(pH 8.0)和5mM乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.0)组成。RIPA缓冲液的添加量取决于细胞沉淀的大小。然后将沉淀的细胞重新悬浮在RIPA缓冲液中，随后在4℃下温育15分钟。为了确定制备的细胞裂解物的蛋白浓度，在蛋白印迹分析之前执行BCA测定。

BCA测定

来自细胞裂解物的总蛋白浓度通过执行二辛可宁酸含量测定(BCA)来确定。此测定通过关注Cu²⁺离子来确定蛋白浓度。当Cu²⁺被蛋白中的肽键还原时，形成Cu⁺。然后，Cu⁺离子与BCA形成复合物，这产生可通过吸光度测量的紫色产物。简而言之，制备终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8和l mg/ml的BSA蛋白标准品。将10μl的每个标准品添加到96孔板的孔中，一式三份。未知浓度的蛋白样品然后以每孔3μl添加，一式三份。然后将蒸馏水添加到蛋白样品中以达到10μl的最终体积。BCA和CuSO₄分别以BCA和CuSO₄的29/30和1/30比例添加到每个孔中。然后将样品在37℃下温育30分钟。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)酶标仪读取562nm处的吸光度。使用BSA蛋白标准品的光密度构建BCA蛋白标准曲线。然后使用标准曲线来推断蛋白浓度。然后将样品标准化为2mg/ml，用于蛋白印迹分析。

SDS PAGE

执行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析以在蛋白印迹法之前根据蛋白分子量分离制备的蛋白样品。SDS与蛋白结合，引起蛋白变性并带上净负电荷。总净电荷将与蛋白的分子量成正比。蛋白的电泳会引起蛋白从负端迁移到正端。迁移允许蛋白根据其分子量通过孔。对提取的蛋白进行定量后，将蛋白样品添加到含有40mM二硫苏糖醇的Blue Loading Buffer中，以获得α-突触核蛋白和LRP::FLAG的25μg最终蛋白浓度以及针对LRP检测的10μg最终蛋白浓度。为了检测α-突触核蛋白和LRP::FLAG，15％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶和12％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶用于检测LRP。将PiNK Plus Prestained ProteinLadder(GeneDireX)与蛋白样品一起加载到每个凝胶上。然后将蛋白以每块凝胶150V的电压分离45分钟。然后执行蛋白印迹分析。

蛋白印迹法

为了确定LRP::FLAG的相对水平，执行LRP和α-突触核蛋白蛋白印迹法。蛋白印迹法用于通过使用标记抗体对蛋白进行免疫学检测。首先，执行蛋白提取，随后通过电泳在SDS PAGE凝胶上分离蛋白。蛋白分离后，将滤纸浸泡在1X转移缓冲液中且将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜切成一定大小并在甲醇中活化。转移缓冲液由192mM甘氨酸、20％(w/v)甲醇和25mM Tris碱组成。使用半干式电泳转移装置。三张滤纸放在转移装置上，随后放置PVDF膜。然后将聚丙烯酰胺凝胶置于PDVF膜的顶部，随后再放置三张滤纸。转移装置在用1X转移缓冲液填充至所需量后关闭。蛋白在300mA下转移50分钟。然后使用3％BSA的PBS-TWEEN溶液将膜封闭1小时，随后在0.1％PBS-TWEEN中洗涤五次，每次5分钟。膜在封闭前用0.4％的甲醛固定以检测α-突触核蛋白，因为它的分子量很小。将一抗在3％BSA的PBS-TWEEN溶液中稀释，添加到印迹并在4℃下温育过夜。执行另外五次(每次5分钟)洗涤且将二抗用3％BSA稀释，然后添加，随后在室温下温育1小时。然后执行五次洗涤，随后用Clarity^TMWestern ECLBlotting Substrate(Bio-Rad)和ChemiDocTM成像系统(Bio-Rad)进行可视化。使用ImageLab 5.1软件(Bio-Rad)执行光密度分析且所有值均针对加载对照β-肌动蛋白进行标准化。

表2：用于在蛋白印迹法中检测LRP::FLAG、α-突触核蛋白和LRP/LR的抗体

MTT测定

用特定物质或蛋白处理细胞对细胞活力的影响可通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)测定(Riss等人，2016年)来确定。MTT是呈黄色的四唑盐，通过线粒体酶琥珀酸脱氢酶转化为紫色甲臜结晶(Stockert等人，2012年)。琥珀酸脱氢酶仅在活细胞中有活性，因此只有活细胞才能将MTT转化为甲臜(Stockert等人，2012年)。由于其高通量筛选，MTT测定优于其他细胞活力测定，诸如ATP测定、天青蛋白还原测定和蛋白酶活力标记测定。对于此研究，HEK293细胞首先以每孔1.4×10⁴个细胞接种在24孔板中，而SH-SY5Y细胞因生长速度较慢而以1.8×10⁴个细胞接种。然后将细胞温育过夜以允许重新附着。然后用200nM和500nMα-突触核蛋白重新处理，以诱导PD样状态。处理后，将细胞温育48小时以确定α-突触核蛋白对细胞活力的影响并温育48小时。已知的凋亡诱导剂原儿茶酸(PCA)用作阳性对照。温育后，然后将200μl的1mg/ml MTT添加到每个孔中并在37℃温育2小时以允许形成甲臜结晶。丢弃剩余的MTT并通过添加200μl二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臜结晶。然后将样品一式两份地以100μl添加到96孔板中，并且使用ELISA读板器在570nm处读取吸光度。高吸光度指示有大量活细胞。

统计评估

数据的统计评估通过以95％的置信区间执行学生t检验进行，且因此，当p值低于0.05时，结果被认为是显著的(*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001)(Johnston，1970年)。

结果(实施例1)

LRP::FLAG在HEK293细胞中的过表达

LRP/LR在PD中的作用尚未确定。为了确定LRP/LR在PD中的作用，稳定转染HEK293细胞以过表达LRP::FLAG。pCIneo-moLRP::FLAG质粒用于实现这一点。细胞转染后，执行蛋白印迹分析以证实转染成功(图6A)。此外，在转染和未转染的HEK293细胞系和加载对照(使用β-肌动蛋白)中检查总LRP蛋白水平(图2A)。

执行蛋白印迹分析以检测LRP::FLAG并确定转染和未转染的HEK293细胞中的总LRP蛋白水平。LRP::FLAG仅在转染的HEK293细胞中检测到(图2A：泳道4-6)。因此，转染是成功的且HEK293转染的细胞过表达LRP::FLAG。在比较未转染(图2A：泳道1-3)和转染(图2A：泳道4-6)的HEK293细胞的LRP蛋白水平时，看到LRP/LR蛋白水平的增加。光密度和统计分析揭示总LRP水平显著增加并示出LRP::FLAG的过表达使LRP水平增加71.24％(图2B)。使用加载对照(β-肌动蛋白)。

LRP::FLAG在HEK293细胞中的过表达增加α-突触核蛋白水平且LRP/LR与α-突触核蛋白在HEK293细胞中共定位

为了确定α-突触核蛋白和LRP/LR是否共定位，执行共聚焦显微镜检查。在放大倍数为630的共聚焦显微镜下观察转染的HEK293和未转染的细胞。还在转染和未转染的HEK293细胞中检查和比较相对蛋白水平。α-突触核蛋白和LRP/LR的共定位发生在细胞质以及未转染和转染的HEK293细胞的细胞表面。此外，与图3A相比，发现LRP::FLAG转染的HEK293细胞表达更多α-突触核蛋白，如图3H中荧光强度的增加所示。共定位图像证实α-突触核蛋白和LRP/LR之间的共定位并揭示过表达LRP::FLAG的细胞具有更大程度的共定位。在图3G和图3N中的2D细胞荧光图中看到的对角线也证实α-突触核蛋白和LRP/LR之间的共定位。

α-突触核蛋白的10kDa CTD在LRP::FLAG过表达细胞中增加

为了确定过表达LRP::FLAG对α-突触核蛋白水平的影响，对转染和未转染的HEK293细胞系执行蛋白印迹分析(图4)。在比较未转染(图4A：泳道1-3)和转染(图4A：泳道4-6)HEK293细胞中的α-突触核蛋白蛋白水平时，未观察到19kDa全长α-突触核蛋白蛋白水平的差异。然而，α-突触核蛋白的10kDa CTD增加。蛋白印迹的光密度分析证实这一点并示出α-突触核蛋白水平的CTD增加165.22％(图4B)。

LRP::FLAG的过表达增加用200nM和500nMα-突触核蛋白处理的HEK293细胞和SH-SY5Y细胞的细胞活力

为了确定过表达LRP::FLAG对α-突触核蛋白处理细胞的细胞活力的影响，执行MTT测定。对HEK293和SH-SY5Y转染和未转染的细胞系执行MTT测定。细胞用200nM和500nMα-突触核蛋白处理以诱导PD样状态。MTT分析示出，当细胞用阳性对照PCA(已知凋亡诱导剂)处理时，HEK293和SH-SY5Y转染和未转染的细胞系的细胞活力显著降低(图5和6)，正如预期的那样。当我们用200nM和500nMα-突触核蛋白处理细胞时，HEK293未转染的细胞的细胞活力显著降低(图5)。然而，在用200nM和500nMα-突触核蛋白处理的SH-SY5Y未转染的细胞中没有看到显著增加或减少(图6)。在用200nM和500nMα-突触核蛋白处理的HEK293和SH-SY5YLRP::FLAG转染细胞中均看到细胞活力略有增加，然而，此增加不显著(图5和6)。由于时间限制，SH-SY5Y细胞系仅用于MTT细胞活力测定。

LRP::FLAG的过表达增加用500uM和750nM 1-甲基-4-苯基吡啶碘化物(MPP+)处理的HEK293细胞的细胞活力

仅进行pCIneo-moLRP::FLAG转染和未转染的HEK293细胞的MTT分析，指示在500uM和750nM 1-甲基-4-苯基吡啶碘化物(MPP+)存在达48小时和72小时下，LRP::FLAG过表达HEK293细胞的细胞活力显著增加(参见图7A和7B)。

论述(实施例1)

LRP::FLAG在HEK293体外PD模型中过表达，以确定LRP/LR和α-突触核蛋白之间是否存在关系以及LRP/LR和帕金蛋白退出。

LRP/LR与α-突触核蛋白和帕金蛋白共定位

一旦通过蛋白印迹分析证实HEK293细胞中的LRP::FLAG表达(图2)，就会检查LRP水平。蛋白印迹分析证实，与未转染的细胞相比，LRP::FLAG的过表达引起总LRP蛋白水平增加71.24％(图2)。此后，执行共聚焦显微镜检查以确定LRP/LR和α-突触核蛋白是否共定位。共聚焦显微镜证明LRP/LR和α-突触核蛋白在未转染的HEK293细胞的细胞质和细胞表面上均有共聚焦(图3)。通过2D细胞荧光图像中的合并、共定位和对角线证实共定位。一些研究证明，α-突触核蛋白主要存在于细胞质中(Guardia-Laguarta等人，2015年)。其他研究示出，α-突触核蛋白在受到刺激后能够与膜结合(Eliezer等人，2001年；Jao等人，2004年)。目前尚不清楚确切刺激是什么。这提供LRP/LR和α-突触核蛋白之间存在相互作用的证据，因为它们定位在相同的亚细胞区室中。不受理论的限制，LRP/LR可作为引起膜结合的刺激物。

共聚焦显微镜不仅揭示LRP/LR和α-突触核蛋白之间的共定位，而且还揭示LRP::FLAG转染后，LRP/LR和α-突触核蛋白蛋白水平均增加(图4)。由于α-突触核蛋白和LRP/LR的蛋白水平增加，LRP/LR和α-突触核蛋白之间的共定位在LRP::FLAG过表达HEK293细胞中与未转染的HEK293细胞相比更为明显。在LRP::FLAG转染的HEK293细胞中观察到的α-突触核蛋白水平增加是LRP/LR和α-突触核蛋白之间可能存在相互作用的进一步证据。

在图3中，所用的一抗是针对LRP和α-突触核蛋白产生的。Cy3偶联的一抗用于检测FLAG。二抗与FITC和Alexaflour 647偶联。小图A和H以红色表示α-突触核蛋白，而小图B和I以绿色表示LRP/LR。LRP::FLAG在小图C和J中表示。小图E和L表示α-突触核蛋白和LRP/LR的合并。黄色荧光指示α-突触核蛋白和LRP/LR之间存在重叠和可能的相互作用。小图A和B：LRP和α-突触核蛋白主要在共定位发生的细胞表面表达。小图H和I：pCIneo-LRP::FLAG转染后，LRP/LR和α-突触核蛋白水平增加。LRP/LR共定位于HEK293细胞中(小图E-F)且此效果在LRP::FLAG过表达细胞(L-N)中更明显。共定位发生在细胞表面和细胞内，如2D细胞荧光图(G和N)中的对角线所示。

图8示出放大倍数为630的共聚焦显微镜，指示LRP和帕金蛋白的表达水平和定位。所用的一抗针对LRP、帕金蛋白和hTERT产生。二抗与FITC、Cy3和Alexaflour 647偶联。小图A至F表示DLD-1细胞，而小图G至L表示已用pCIneo-LRP::FLAG质粒转染的DLD-1细胞。小图A和G以黄色表示帕金蛋白，而小图B和H以绿色表示LRP/LR。小图D和I表示帕金蛋白和LRP/LR的合并。小图E和K表示两种蛋白的共定位，其中白色指示帕金蛋白和LRP/LR之间存在重叠和可能的相互作用。共定位发生在细胞内，如2D细胞荧光图(F)中的对角线所示，其中在DLD-1细胞中，59％的帕金蛋白与54％的LRP/LR共定位，而在过表达LRP::FLAG的DLD-1细胞中，99％的帕金蛋白与22％的LRP共定位。这支持LRP/LR的过表达增加细胞中的帕金蛋白水平。

LRP::FLAG过表达增加α-突触核蛋白的CTD并增加帕金蛋白

蛋白印迹分析还用于证实共聚焦显微镜中观察到的α-突触核蛋白的增加。然而，在LRP::FLAG转染后，没有观察到全长19kDaα-突触核蛋白水平的增加(图5)。有趣的是，在LRP::FLAG转染的HEK293细胞中，全长19kDaα-突触核蛋白以下的第二条带中看到165.22％的增加。先前研究示出，α-突触核蛋白的CTD为10kDa并在全长19kDaα-突触核蛋白以下迁移(Xu等人，2015年)。CTD通过与NAC域相互作用，在防止α-突触核蛋白聚集方面起重要作用(Emamzadeh，2016年)。大多数研究均集中于α-突触核蛋白的NTD，因为在该结构域中发现许多突变，且因此对CTD的研究并不多(Xu&Pu 2016)。最近一项研究证明，CTD的截断改变α-突触核蛋白聚集的机制以及形成的原纤维的属性(van der Wateren等人，2018年)。同一项研究还证明，CTD的截断有利于α-突触核蛋白聚集(van der Wateren等人，2018年)。这指示这项研究中从蛋白印迹看到的结果是LRP/LR增加α-突触核蛋白的CTD的证据，这防止α-突触核蛋白聚集。

LRP::FLAG过表达增加细胞活力

为了确定α-突触核蛋白的CTD增加是阳性还是阴性，执行MTT细胞活力测定。对HEK293未转染和转染以及SH-SY5Y未转染和转染的细胞系执行MTT测定。SH-SY5Y细胞系广泛用于PD研究，因为它同时产生多巴胺和去甲肾上腺素，从而显示儿茶酚胺能表型(Xicoy等人，2017年)。用200nM和500nMα-突触核蛋白处理LRP::FLAG过表达和未转染的HEK293细胞引起细胞活力的略有降低，然而，在LRP::FLAG过表达和未转染的SH-SY5Y细胞中未观察到降低。有趣的是，当比较过表达LRP::FLAG的细胞与未转染的细胞的细胞活力时，在HEK293和SH-SY5Y细胞系中均观察到细胞活力略有增加。当过表达LRP::FLAG时，在细胞活力方面没有观察到负面影响。然而，这些结果可指示，LRP::FLAG转染及因此LRP::FLAG的过表达后α-突触核蛋白的CTD增加可使细胞免受α-突触核蛋白处理的影响。CTD对于维持全长α-突触核蛋白的结构至关重要并防止在纤维化过程中重要的构象变化(Hong等人，2011年)。需要研究这种保护背后的机制。

pCIneo-moLRP::FLAG转染和未转染的HEK293细胞的MTT测定分析指示，在500uM和750nM 1-甲基-4-苯基吡啶碘化物(MPP+)存在达48小时(如图7A所示)和72小时(如图7B所示)下，LRP::FLAG过表达HEK293细胞的细胞活力显著增加。

结论(实施例1)

总之，LRP/LR增加α-突触核蛋白的C-端，从而防止积累和/或聚集并由此提供治疗帕金森病(PD)的有效化合物。申请人证明LRP/LR不仅与α-突触核蛋白共定位，而且LRP::FLAG的过表达增加CTD的水平。任何观察到的CTD增加对用α-突触核蛋白处理的细胞均有保护作用。也示出LRP/LR与帕金蛋白共定位。因此，旨在提高LRP/LR蛋白水平的治疗方法可能成为PD的潜在治疗方法。

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申请人相信，本发明至少提供治疗和/或预防帕金森病(PD)的新的和创造性化合物、药物组合物和/或方法。

令申请人感到非常惊讶的是，向人或动物体提供LRP/LR，即上调其表达，增加α-突触核蛋白的C-端结构域(CTD)。由于现有技术教导在治疗另一种神经退行性疾病，即阿尔茨海默病(AD)时下调LRP/LR，申请人没有预期上调LRP/LR(或向人或动物体提供)将具有任何对神经退行性疾病(诸如PD)的积极影响。

提供LRP/LR作为PD治疗方案的一部分将显著限制任何不需要的副作用的机会，因为它是天然存在的蛋白/肽。这肯定会改善现有技术中已知的至少一个问题。虽然已关于特定实施方案和/或其实施例详细描述本发明，但应理解，本领域技术人员在获得对前述内容的理解后可容易地想到这些实施方案的改变、变型和等效物。因此，本发明的范围应被评估为权利要求及其任何等效物的范围，该权利要求附于本文。

序列表

<110> 约翰内斯堡威特沃特斯兰德大学

（University of the Witwatersrand, Johannesburg）

<120> 用于治疗帕金森病的化合物

<130> P1200PC

<140>

<141>

<150> 2018/08025

<151> 2018-11-28

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 295

<212> PRT

<213> 人类 （Homo sapiens）

<400> 1

Met Ser Gly Ala Leu Asp Val Leu Gln Met Lys Glu Glu Asp Val Leu

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<212> PRT

<213> 小家鼠 （Mus musculus）

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275 280 285

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<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 大肠杆菌 （Escherichia coli）

<400> 3

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<212> PRT

<213> 人类 （Homo sapiens）

<400> 4

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1 5 10 15

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<213> 小家鼠 （Mus musculus）

<400> 5

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