具体实施方式

下面对本发明作进一步说明：

核酸，包含下列目标片段，

所述目标片段与野生型JUP基因(一种如SEQ ID NO.1)相比，所述核酸具有c.958C>T突变。

多肽，与野生型JUP(一种如SEQ ID NO.2)相比，所述多肽具有p.R320C突变。

基因突变，与野生型JUP基因相比，所述基因突变具有c.958C>T突变。

上述野生型JUP，当JUP基因其他位点单核苷酸或氨基酸序列位点发生突变时，不影响本发明所涉及检测位点的保护，只要涉及本发明位点，其他位点相对于SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2发生变化时也应当在本发明范围内。

生物模型在制备筛查和/或防治心肌病试剂中的应用，所述生物模型至少携带下列之一：

a.具有c.958C>T突变的核酸，

b.具有p.R320C突变的多肽，

c.具有c.958C>T突变的基因突变；

优选的，所述心肌病为致心律失常性右室心肌病。

筛查心肌病的生物模型，包含有能检测JUP基因突变体的试剂，所述JUP基因突变体至少为下列之一：

a.具有c.958C>T突变的核酸，

b.具有p.R320C突变的多肽，

c.具有c.958C>T突变的基因突变；

优选的，所述心肌病为致心律失常性右室心肌病。

当在制备筛查试剂使用时，参考后续具体使用；当在制备防治试剂中使用时，一些方式为作为药物的作用靶点，或其他生物药物制备过程中作为测试、提取等步骤中应用，主要作为制药过程中的一些辅助试剂，比如在制药过程的测试抑制剂作用效果中。

一些方式中，所述能检测JUP基因突变体的试剂含有引物或核酸探针；

优选的，所述引物包括

核苷酸序列为aaccagctgtcgaagaagga的正向引物，和/或

核苷酸序列为ggacacacggatagcacctt的反向引物；

核酸探针一种方式可采用相近基因检测探针，可行即可，不做特别限定。

构建体，包括前述的核酸或前述得基因突变。

重组细胞，所述重组细胞通过前述构建体转化受体细胞或表达前述多肽而得。

用于制备防治心肌病药物的重组蛋白，由前述的重组细胞表达。

突变抑制剂在制备防治心肌病药物中的应用，所述突变抑制剂至少为下述之一：

JUP基因DNA序列c.958C>T突变抑制剂，

JUP基因蛋白序列p.R320C突变抑制剂。

防治心肌病药物，至少含有下述之一

JUP基因DNA序列c.958C>T突变抑制剂，

JUP基因蛋白序列p.R320C突变抑制剂。

一些情况中，所述药物为右心室心肌细胞凋亡抑制剂。

其中，前述抑制剂包含现有客观可行药物试剂的同样也应当包含后续新研制的一些药物试剂。

基因片段在制备心肌病药物中的应用，所述基因片段为JUP基因的c.958位点单核苷酸为C的基因片段，优选的，所述致心律失常性右室心肌病。

防治心肌病药物，包括基因载体，所述基因载体含有

能将JUP基因的c.958位点单核苷酸T替换为单核苷酸C并表达的基因片段，优选的，所述心肌病为致心律失常性右室心肌病；

基因载体一些表现形式为质粒，腺病毒载体。

通过替换突变基因，使其恢复成正常基因序列实现治疗，起到防、治目的。目前，基因载体优选考虑已知且成熟的，当然未来新出现能获得实践认可的也应当在本发明范围内。

下面结合一具体的研究项目进行说明，一种具体的研究流程如图4中所展示的。

一、家系收集

获得患者家属的知情同意后，收集先证者及家庭成员的临床资料，画家系图(图1)，先证者临床确诊为致心律失常性右室心肌病，其他家庭成员健康。黑色方框是指患病男性，白色方框是指健康男性，白色圆框是指健康女性，箭头是指先证者。用EDTA抗凝的采血管收集每位研究对象2-5ml外周血，-80℃保存。

二、DNA提取

用TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒提取外周血全基因组DNA。分别用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA的纯度与质量。

三、全外显子测序

先证者的DNA进行全外显子检测。外显子检测结果如下样本检测结果分类统计表：

四、数据筛选与分析

根据基因突变数据库(ExAC Browser)、千人基因组数据库(1000genome)、dbSNP数据库、Ensembl数据库、NCBI数据库、UCSC数据库查询基因突变信息和突变频率等。

根据SIFT，Polyphen2，MutationTaster等网站对突变进行有害性预测，并对突变位点的保守性进行分析，分析结果为致病性。

五、Sanger测序

引物设计

应用Genetool软件设计突变位点扩增引物：

正向引物：5'-aaccagctgtcgaagaagga-3'

反向引物：5'-ggacacacggatagcacctt-3'。

DNA扩增(PCR)

PCR反应体系共25ul：1ul样本DNA、正反向引物各0.5ul、12.5ul 2×TSINGKEMaster Mix和10.5ul ddH2O。

PCR扩增程序：样本上机，94℃预热3分钟,循环“94℃变性30s，59℃梯度温度退火30s，72℃延伸35s”35次，72℃保持10分钟后，终点温度4℃。

PCR产物检测

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。在凝胶成像仪下观察到Maker指示下，在500-1000的条带大小中间有比较亮的条带，位置在800左右，说明PCR扩增成功。

测序

用先证者及其家庭成员的DNA进行PCR扩增成功后，开展Sanger测序。

测序结果分析

Finch TV Version 1.4.0用于读取Sanger测序结果,如图2中。

六、健康人群突变筛查

选取30例健康人群进行突变筛查筛查，结果如图3中所示。

研究结果

先证者携带JUP基因突变，基因型为CT，如图2中测序图突变型，该突变位于6号外显子，c.958C>T，p.R320C:CGT>TGT(p.Arg320Cys)，导致第320位的精氨酸变成了半胱氨酸，如图5中所示。其他家庭成员不携带该突变，基因型均为CC，如图2中测序图野生型。

该突变类型为杂合突变，错义突变，又名rs200740462,突变频率为0.0002属于罕见变异，并且在中国人群中没有报道，在对30例健康人群进行筛查中未发现该突变，30例健康人群的基因型均为CC。如图5中，经有害性预测为：致病性(SIFT，Polyphen2，MutationTaster)，该突变区域为保守性且为JUP蛋白的重要结构域。RegulomeDB是一个对非编码区SNP和基因调控元件进行注释的数据库，注释包括表达数量性状基因座(Expression quantitative trait loci，eQTL)、DNA酶I超敏感结合区域(DNase)、转录因子合位点和已知启动子区域等。根据这些注释，网站会对SNP进行综合评分，，根据评分可以推测感兴趣SNP可能参与的调控机制，进而为研究提供思路。如图6中，经查阅突变位点功能分析为2b，说明该突变位点很有可能调控基因表达。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> JUP新突变蛋白、新突变基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2238

<212> DNA

<213> 人(Huma)

<400> 1

atggaggtga tgaacctgat ggagcagcct atcaaggtga ctgagtggca gcagacatac 60

acctacgact cgggtatcca ctcgggcgcc aacacctgcg tgccctccgt cagcagcaag 120

ggcatcatgg aggaggatga ggcctgcggg cgccagtaca cgctcaagaa aaccaccact 180

tacacccagg gggtgccccc cagccaaggt gatctggagt accagatgtc cacaacagcc 240

agggccaaac gggtgcggga ggccatgtgc cctggtgtgt caggcgagga cagctcgctt 300

ctgctggcca cccaggtgga ggggcaggcc accaacctgc agcgactggc cgagccgtcc 360

cagctgctca agtcggccat tgtgcatctc atcaactacc aggacgatgc cgagctggcc 420

actcgcgccc tgcccgagct caccaaactg ctcaacgacg aggacccggt ggtggtgacc 480

aaggcggcca tgattgtgaa ccagctgtcg aagaaggagg cgtcgcggcg ggccctgatg 540

ggctcgcccc agctggtggc cgctgtcgtg cgtaccatgc agaataccag cgacctggac 600

acagcccgct gcaccaccag catcctgcac aacctctccc accaccggga ggggctgctc 660

gccatcttca agtcgggtgg catccctgct ctggtccgca tgctcagctc ccctgtggag 720

tcggtcctgt tctatgccat caccacgctg cacaacctgc tcctgtacca ggagggcgcc 780

aagatggccg tgcgcctggc cgacgggctg caaaagatgg tgcccctgct caacaagaac 840

aaccccaagt tcctggccat caccaccgac tgcctgcagc tcctggccta cggcaaccag 900

gagagcaagc tgatcatcct ggccaatggt gggccccagg ccctcgtgca gatcatgcgt 960

aactacagtt atgaaaagct gctctggacc accagtcgtg tgctcaaggt gctatccgtg 1020

tgtcccagca ataagcctgc cattgtggag gctggtggga tgcaggccct gggcaagcac 1080

ctgaccagca acagcccccg cctggtgcag aactgcctgt ggaccctgcg caacctctca 1140

gatgtggcca ccaagcagga gggcctggag agtgtgctga agattctggt gaatcagctg 1200

agtgtggatg acgtcaacgt cctcacctgt gccacgggca cactctccaa cctgacatgc 1260

aacaacagca agaacaagac gctggtgaca cagaacagcg gtgtggaggc tctcatccat 1320

gccatcctgc gtgctggtga caaggacgac atcacggagc ctgccgtctg cgctctgcgc 1380

cacctcacta gccgccaccc tgaggccgag atggcccaga actctgtgcg tctcaactat 1440

ggcatcccag ccatcgtgaa gctgctcaac cagcccaacc agtggccact ggtcaaggca 1500

accatcggct tgatcaggaa tctggccctg tgcccagcca accatgcccc gctgcaggag 1560

gcagcggtca tcccccgcct cgtccaactg ctggtgaagg cccaccagga tgcccagcgc 1620

cacgtagctg caggcacaca gcagccctac acggatggtg tgaggatgga ggagattgtg 1680

gagggctgca ccggagcact gcacatcctc gcccgggacc ccatgaaccg catggagatc 1740

ttccggctca acaccattcc cctgtttgtg cagctcctgt actcgtcggt ggagaacatc 1800

cagcgcgtgg ctgccggggt gctgtgtgag ctggcccagg acaaggaggc ggccgacgcc 1860

attgatgcag agggggcctc ggccccactc atggagttgc tgcactcccg caacgagggc 1920

actgccacct acgctgctgc cgtcctgttc cgcatctccg aggacaagaa cccagactac 1980

cggaagcgcg tgtccgtgga gctcaccaac tccctcttca agcatgaccc ggctgcctgg 2040

gaggctgccc agagcatgat tcccatcaat gagccctatg gagatgacat ggatgccacc 2100

taccgcccca tgtactccag cgatgtgccc cttgacccgc tggagatgca catggacatg 2160

gatggagact accccatcga cacctacagc gacggcctca ggcccccgta ccccactgca 2220

gaccacatgc tggcctag 2238

<210> 2

<211> 745

<212> PRT

<213> 人(Huma)

<400> 2

Met Glu Val Met Asn Leu Met Glu Gln Pro Ile Lys Val Thr Glu Trp

1 5 10 15

Gln Gln Thr Tyr Thr Tyr Asp Ser Gly Ile His Ser Gly Ala Asn Thr

20 25 30

Cys Val Pro Ser Val Ser Ser Lys Gly Ile Met Glu Glu Asp Glu Ala

35 40 45

Cys Gly Arg Gln Tyr Thr Leu Lys Lys Thr Thr Thr Tyr Thr Gln Gly

50 55 60

Val Pro Pro Ser Gln Gly Asp Leu Glu Tyr Gln Met Ser Thr Thr Ala

65 70 75 80

Arg Ala Lys Arg Val Arg Glu Ala Met Cys Pro Gly Val Ser Gly Glu

85 90 95

Asp Ser Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gln Val Glu Gly Gln Ala Thr Asn

100 105 110

Leu Gln Arg Leu Ala Glu Pro Ser Gln Leu Leu Lys Ser Ala Ile Val

115 120 125

His Leu Ile Asn Tyr Gln Asp Asp Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ala Leu

130 135 140

Pro Glu Leu Thr Lys Leu Leu Asn Asp Glu Asp Pro Val Val Val Thr

145 150 155 160

Lys Ala Ala Met Ile Val Asn Gln Leu Ser Lys Lys Glu Ala Ser Arg

165 170 175

Arg Ala Leu Met Gly Ser Pro Gln Leu Val Ala Ala Val Val Arg Thr

180 185 190

Met Gln Asn Thr Ser Asp Leu Asp Thr Ala Arg Cys Thr Thr Ser Ile

195 200 205

Leu His Asn Leu Ser His His Arg Glu Gly Leu Leu Ala Ile Phe Lys

210 215 220

Ser Gly Gly Ile Pro Ala Leu Val Arg Met Leu Ser Ser Pro Val Glu

225 230 235 240

Ser Val Leu Phe Tyr Ala Ile Thr Thr Leu His Asn Leu Leu Leu Tyr

245 250 255

Gln Glu Gly Ala Lys Met Ala Val Arg Leu Ala Asp Gly Leu Gln Lys

260 265 270

Met Val Pro Leu Leu Asn Lys Asn Asn Pro Lys Phe Leu Ala Ile Thr

275 280 285

Thr Asp Cys Leu Gln Leu Leu Ala Tyr Gly Asn Gln Glu Ser Lys Leu

290 295 300

Ile Ile Leu Ala Asn Gly Gly Pro Gln Ala Leu Val Gln Ile Met Arg

305 310 315 320

Asn Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu Leu Trp Thr Thr Ser Arg Val Leu Lys

325 330 335

Val Leu Ser Val Cys Pro Ser Asn Lys Pro Ala Ile Val Glu Ala Gly

340 345 350

Gly Met Gln Ala Leu Gly Lys His Leu Thr Ser Asn Ser Pro Arg Leu

355 360 365

Val Gln Asn Cys Leu Trp Thr Leu Arg Asn Leu Ser Asp Val Ala Thr

370 375 380

Lys Gln Glu Gly Leu Glu Ser Val Leu Lys Ile Leu Val Asn Gln Leu

385 390 395 400

Ser Val Asp Asp Val Asn Val Leu Thr Cys Ala Thr Gly Thr Leu Ser

405 410 415

Asn Leu Thr Cys Asn Asn Ser Lys Asn Lys Thr Leu Val Thr Gln Asn

420 425 430

Ser Gly Val Glu Ala Leu Ile His Ala Ile Leu Arg Ala Gly Asp Lys

435 440 445

Asp Asp Ile Thr Glu Pro Ala Val Cys Ala Leu Arg His Leu Thr Ser

450 455 460

Arg His Pro Glu Ala Glu Met Ala Gln Asn Ser Val Arg Leu Asn Tyr

465 470 475 480

Gly Ile Pro Ala Ile Val Lys Leu Leu Asn Gln Pro Asn Gln Trp Pro

485 490 495

Leu Val Lys Ala Thr Ile Gly Leu Ile Arg Asn Leu Ala Leu Cys Pro

500 505 510

Ala Asn His Ala Pro Leu Gln Glu Ala Ala Val Ile Pro Arg Leu Val

515 520 525

Gln Leu Leu Val Lys Ala His Gln Asp Ala Gln Arg His Val Ala Ala

530 535 540

Gly Thr Gln Gln Pro Tyr Thr Asp Gly Val Arg Met Glu Glu Ile Val

545 550 555 560

Glu Gly Cys Thr Gly Ala Leu His Ile Leu Ala Arg Asp Pro Met Asn

565 570 575

Arg Met Glu Ile Phe Arg Leu Asn Thr Ile Pro Leu Phe Val Gln Leu

580 585 590

Leu Tyr Ser Ser Val Glu Asn Ile Gln Arg Val Ala Ala Gly Val Leu

595 600 605

Cys Glu Leu Ala Gln Asp Lys Glu Ala Ala Asp Ala Ile Asp Ala Glu

610 615 620

Gly Ala Ser Ala Pro Leu Met Glu Leu Leu His Ser Arg Asn Glu Gly

625 630 635 640

Thr Ala Thr Tyr Ala Ala Ala Val Leu Phe Arg Ile Ser Glu Asp Lys

645 650 655

Asn Pro Asp Tyr Arg Lys Arg Val Ser Val Glu Leu Thr Asn Ser Leu

660 665 670

Phe Lys His Asp Pro Ala Ala Trp Glu Ala Ala Gln Ser Met Ile Pro

675 680 685

Ile Asn Glu Pro Tyr Gly Asp Asp Met Asp Ala Thr Tyr Arg Pro Met

690 695 700

Tyr Ser Ser Asp Val Pro Leu Asp Pro Leu Glu Met His Met Asp Met

705 710 715 720

Asp Gly Asp Tyr Pro Ile Asp Thr Tyr Ser Asp Gly Leu Arg Pro Pro

725 730 735

Tyr Pro Thr Ala Asp His Met Leu Ala

740 745