具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

需要说明的是，当部件被称为“固定于”或“设置于”另一个部件，它可以直接或者间接位于该另一个部件上。当一个部件被称为“连接于”另一个部件，它可以是直接或者间接连接至该另一个部件上。术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置为基于附图所示的方位或位置，仅是为了便于描述，不能理解为对本技术方案的限制。术语“第一”、“第二”仅用于便于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明技术特征的数量。“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

如图1和图2所示，本发明所述的ECM梯度微纤维管的制备装置包括微流控装置和装有质量浓度为2-5％的氯化钙的收集池3，该微流控装置包括方形毛细管1，该方形毛细管1用环氧树脂固定在玻片2的中央；所述的方形毛细管1中装载有注射池毛细管4和收集池毛细管5，所述的注射池毛细管4和收集池毛细管5同轴排列并用树脂固定；所述的注射池毛细管中插入有5孔毛细管，所述的5孔毛细管用树脂固定在所述的注射池毛细管中；所述的5孔毛细管的每个孔中插入一根毛细管作为外接管，所述的外接管用树脂固定在所述5孔毛细管的孔中；所述的微流控装置用夹子固定在装有2-5％氯化钙的收集池上，所述微流控装置下缘的收集池毛细管5浸在装有2-5％氯化钙的收集池中。

所述的5孔毛细管的尖端14与所述注射池毛细管的管壁13接触。

所述的5孔毛细管的每个孔中插入的外接管包括第一高浓度ECM外接管6、第一低浓度ECM外接管7、聚乙烯醇外接管8、第二高浓度ECM外接管9和第二低浓度ECM外接管10。

所述的第一高浓度ECM外接管6和第二高浓度ECM外接管9通过医用微管连接到高浓度ECM无菌注射器17的出口上。

所述的高浓度ECM无菌注射器17固定在高浓度ECM微量注射泵18上，所述的高浓度ECM无菌注射器17中吸取有5-10mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液(即5mg/ml去细胞支架的1％海藻酸钠水溶液，都为质量浓度)。

所述的第一低浓度ECM外接管7和第二低浓度ECM外接管10通过医用微管连接到低浓度ECM无菌注射器19的出口上。

所述的低浓度ECM无菌注射器19固定在低浓度ECM微量注射泵20上，所述的低浓度ECM无菌注射器19中吸取有1-3mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液(即1mg/ml去细胞支架的1％海藻酸钠水溶液，都为质量浓度)。

所述的聚乙烯醇外接管8通过医用微管连接到聚乙烯醇无菌注射器15的出口上。

所述的聚乙烯醇无菌注射器15固定在聚乙烯醇微量注射泵16上，所述的聚乙烯醇无菌注射器15中吸取有质量浓度为10-15％的聚乙烯醇。

本发明中所述的微流控装置的组装过程包括：

用环氧树脂将方形毛细管固定在玻片中央，将收集池毛细管和注射池毛细管装载在方形管中，调整位置确保它们同轴排列并用树脂将它们固定。将5孔毛细管插入装载好的注射池毛细管中使其尖端触碰到注射池毛细管壁，用树脂将其固定后，向每个孔中插入一根毛细管作为外接管，用树脂将其固定。微流控装置装载好后用乙醇浸泡晾干备用。

具体的，本发明中利用所述的ECM梯度微纤维管制备装置，来制备ECM梯度微纤维管的方法包括以下步骤：

将100mg/ml ECM凝胶与4％海藻酸钠溶液混合配制成终浓度为5-10mg/ml-1％以及1-3mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液，并配制2-5％氯化钙和10-15％聚乙烯醇(PVA)。用1ml无菌注射器分别吸取不同浓度的ECM-海藻酸钠溶液以及PVA，将注射器固定在微量注射泵上并使用医用微管按顺序连接在微流控装置上。连接完成后用夹子将微流控装置固定在装有2-5％氯化钙的收集池上，确保微流控装置下缘浸在收集池中。装置连接完成后，设置注射泵流速：内相PVA溶液注射泵(即聚乙烯醇微量注射泵16)流速为0.5-1.5ml/h，外相注射泵(即高浓度ECM微量注射泵18和低浓度ECM微量注射泵20)流速为2-5ml/h。首先同时打开三个注射泵(即聚乙烯醇微量注射泵16、高浓度ECM微量注射泵18和低浓度ECM微量注射泵20)使液体充满装置，待收集池中出现混合管后关闭高浓度ECM外相通道(即高浓度ECM微量注射泵18)只打开低浓度ECM通道(即低浓度ECM微量注射泵20)，待低浓度ECM11成管稳定后，关闭低浓度ECM通道打开高浓度ECM通道即可得到梯度浓度ECM微纤维管。图2中可以看出低浓度ECM11和高浓度ECM12成管后得到梯度浓度ECM微纤维管的状态。

本发明还提供一种ECM梯度微纤维管，该ECM梯度微纤维管采用上述的制备装置按照实施例1-3的工艺制备而成。

实施例是利用本发明装置制备ECM梯度微纤维管的方法技术方案。

具体的，本发明ECM是细胞外基质，实施例中ECM来源于健康成年猪坐骨神经。优选地，ECM样品的处理方法：来源于取新鲜猪坐骨神经，用手术剪剪成小段后浸泡于1％TrionX-100中以120rpm转速4℃振摇12h。用磷酸盐缓冲液PBS摇洗3遍后浸泡于1％十二烷基硫酸钠SDS溶液中继续振摇48h。接着用PBS摇洗12h洗去残留的SDS后将去细胞样品冷冻干燥。将冻干的去细胞样品用打粉机打成粗粉，并用1mg/ml胃蛋白酶常温消化48h，最后调节溶液pH值约为7.4后-80℃分装保存样品。

实施例1

一种ECM梯度微纤维管的制备方法，包括以下步骤：

第一步、将100mg/ml ECM凝胶与质量浓度为4％的海藻酸钠溶液混合配制成终浓度为5mg/ml-1％以及1mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液，并配制质量浓度为2％的氯化钙和质量浓度为10％的聚乙烯醇；

第二步、用1ml的无菌注射器分别吸取不同浓度的ECM-海藻酸钠水溶液以及聚乙烯醇，将无菌注射器固定在微量注射泵上并使用医用微管按顺序连接在微流控装置上；连接完成后用夹子将微流控装置固定在装有质量浓度为2％的氯化钙的收集池上，确保微流控装置下缘浸在收集池中；

第三步、连接完成后，设置注射泵流速：内相PVA溶液注射泵流速为0.5ml/h，外相注射泵流速为2ml/h；

第四步、所述的微量注射泵包括聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，首先同时打开所述的聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，使液体充满所述的微流控装置，待收集池中出现混合管后关闭高浓度ECM外相通道，只打开低浓度ECM通道，待低浓度ECM成管稳定后，关闭低浓度ECM通道打开高浓度ECM通道，得到梯度浓度ECM微纤维管。

实施例2

一种ECM梯度微纤维管的制备方法，包括以下步骤：

第一步、将100mg/ml ECM凝胶与质量浓度为4％的海藻酸钠溶液混合配制成终浓度为8mg/ml-1％以及1mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液，并配制质量浓度为3％的氯化钙和质量浓度为12％的聚乙烯醇；

第二步、用1ml的无菌注射器分别吸取不同浓度的ECM-海藻酸钠水溶液以及聚乙烯醇，将无菌注射器固定在微量注射泵上并使用医用微管按顺序连接在微流控装置上；连接完成后用夹子将微流控装置固定在装有质量浓度为3％的氯化钙的收集池上，确保微流控装置下缘浸在收集池中；

第三步、连接完成后，设置注射泵流速：内相PVA溶液注射泵流速为0.8ml/h，外相注射泵流速为5ml/h；

第四步、所述的微量注射泵包括聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，首先同时打开所述的聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，使液体充满所述的微流控装置，待收集池中出现混合管后关闭高浓度ECM外相通道，只打开低浓度ECM通道，待低浓度ECM成管稳定后，关闭低浓度ECM通道打开高浓度ECM通道，得到梯度浓度ECM微纤维管。

实施例3

一种ECM梯度微纤维管的制备方法，包括以下步骤：

第一步、将100mg/ml ECM凝胶与质量浓度为4％的海藻酸钠溶液混合配制成终浓度为5mg/ml-1％以及2mg/ml-1％的ECM-海藻酸钠水溶液，并配制质量浓度为2％的氯化钙和质量浓度为10％的聚乙烯醇；

第二步、用1ml的无菌注射器分别吸取不同浓度的ECM-海藻酸钠水溶液以及聚乙烯醇，将无菌注射器固定在微量注射泵上并使用医用微管按顺序连接在微流控装置上；连接完成后用夹子将微流控装置固定在装有质量浓度为2％的氯化钙的收集池上，确保微流控装置下缘浸在收集池中；

第三步、连接完成后，设置注射泵流速：内相PVA溶液注射泵流速为0.5ml/h，外相注射泵流速为3ml/h；

第四步、所述的微量注射泵包括聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，首先同时打开所述的聚乙烯醇微量注射泵、高浓度ECM微量注射泵和低浓度ECM微量注射泵，使液体充满所述的微流控装置，待收集池中出现混合管后关闭高浓度ECM外相通道，只打开低浓度ECM通道，待低浓度ECM成管稳定后，关闭低浓度ECM通道打开高浓度ECM通道，得到梯度浓度ECM微纤维管。

对于实施例制备的ECM梯度纤维管的物理性质和性能表征如表1所示。

表1

实施例4

ECM梯度微纤维管桥接大鼠1cm坐骨神经缺损实验

取8周龄SD大鼠，随机分组，适应性饲养后，将SD大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取右下肢股骨下缘切口，钝性分离肌肉暴露坐骨神经。用玻璃分针剥离神经后行坐骨神经横断形成1cm神经缺损。组1为将装载有实施例1的ECM梯度微纤维管的硅胶管以9/0国产尼龙线端对端缝合与神经断端；组2为将装载有对比例1的ECM梯度微纤维管的硅胶管以9/0国产尼龙线端对端缝合与神经断端；组3为将装载有对比例2的ECM梯度微纤维管的硅胶管以9/0国产尼龙线端对端缝合与神经断端。术后青霉素20万u/d肌注7天。其中，对比例1为仅注射浓度为5mg/ml-1％的ECM溶液制备的ECM纤维管(制备方法同实施例1)；对比例2为仅注射浓度为1mg/ml-1％的ECM溶液(制备方法同实施例1)。

术后2周、4周及8周，行行为学脚步印记检测，按照公式计算坐骨神经功能指数SFI。坐骨神经功能指数是通过测量分析大鼠行走时患侧和健侧脚印并通过公式计算来表示神经损伤后运动功能恢复情况的一项重要指标。SFI越小功能恢复越差反之恢复越好。术后8周，取出移植段标本，多聚甲醛固定，冰冻包埋，5um层厚纵向切片，行神经丝NF-200和髓鞘MBP免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察神经生长及对接情况。

结果评价：

各组术后2周、4周及8周的行为学指标SFI情况，如表2所示。

从上表可知，实施例1组的ECM梯度微纤维管促进了神经损伤后运动功能的恢复。术后8周移植段免疫荧光染色图3和图4中可知ECM梯度微纤维管促进神经纤维呈轴向排列生长和轴突再髓鞘化。

而对比例1的高浓度ECM纤维管在早期时运动功能恢复较差，在4周后明显好转，对比例2的低浓度ECM纤维管在早期运动功能恢复较好，随着时间延长运动功能指标改善较差。

实施例5

ECM梯度微纤维管浓度梯度表征

为验证本发明制备方法制备的产品对于ECM梯度浓度的有效性，以实施例1的产物为样品。对于实施例1中得到ECM梯度微纤维管，测试其沿径向的浓度梯度。首先获取特定长度的ECM纤维管，长度为1cm，接着通过纤维管中心线，(中心线选取纤维管的轴线并且垂直于血管横截面)，然后通过根据所确定的中心线，在纤维管上确定等分距离的5点，ABCDE，测量特定ECM的浓度，如图5所示。以标准5mgECM为参比，结果如表2。

表2

可以看出，本发明制备的ECM梯度微纤维管，具有明显ECM浓度梯度，具有良好的强度、柔软性和弹性，组织活性高，生物相容性高，能够满足作为组织工程血管的需要。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。