阅读说明：本技术 干扰素λ在新型冠状病毒(2019-nCoV)感染治疗中的应用 (Use of interferon lambda in the treatment of infections with novel coronaviruses (2019-nCoV) ) 是由 杨柳 李岩 冯静 郭万军 潘海 于 2020-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及IFN-λ在制备治疗新冠病毒感染患者药物中的应用,可以有效降低感染者中的新冠病毒水平,并在控制治疗过程中引起的细胞因子风暴,减缓由此造成的呼吸窘迫综合征方面表现更为卓越。(The invention relates to application of IFN-lambda in preparing a medicine for treating patients infected by new coronavirus, which can effectively reduce the level of the new coronavirus in infected patients, and has more remarkable performance in controlling cytokine storm caused in the treatment process and relieving respiratory distress syndrome caused by the cytokine storm.)

具体实施方式

：

实施实例1：干扰素λ表达工程菌的构建

使用化学合成的方式获得人干扰素λ1/λ2/λ3/λ4基因片段 (NM_172140.2/NM_172138.2/NM_172139.2)，通过Node I和Xho I位点，将上述片段插入原核表达质粒pET-30a中并测序验证。得到的用于转化测定的表达质粒。

将上述获得的含目的基因的质粒转化BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen)，将BL21感受态细胞50μl置于冰浴上融化，加入目的DNA，轻轻摇匀，并在冰浴中放置30分钟。继而 42℃水浴热激30秒，然后快速将离心管转移到冰浴中放置2分钟，该过程不要摇动离心管。向离心管中加入500μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，180rpm培养1小时，使细菌复苏。吸取200μl已转化的感受态细胞加到含有卡那霉素抗性的LB琼脂培养基平板上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。次日，使用接种环挑取转化平皿中的单克隆菌落，并接种于15ml的无菌LB培养基(含抗生素)， 30℃过夜培养。

实施实例2：干扰素λ的表达和纯化

向50ml的LB培养基中加入50μl菌液(表达干扰素λ的菌液)，同时加入50μl卡那霉素，混匀后放30℃恒温振荡器中，接种过夜。取过夜接种的菌液10ml加入1000ml的LB培养基中，同时加入1000μl卡那霉素。摇匀后放于37℃摇床内，200rpm，培养至菌液OD600 为0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mM IPTG诱导，继续培养4h后收集菌体。表达的IL29突变体约占菌体总蛋白的30-50％，主要以包涵体形式存在。

将发酵菌体以TE(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 6.5)溶液(m:V＝1:10)洗涤菌体3次，然后60Mpa高压匀浆破碎，匀浆后，镜检破菌率。当菌体破碎率约95％时(约破菌2～3次)，8000rpm离心15min，收集破碎菌体沉淀。取破碎菌体沉淀置于烧杯中，加入包涵体洗涤液(10mMTris-HCl+1mM EDTA+0.5％Triton-X100，pH 6.5，m:V＝1:10)，于磁力搅拌机上搅拌30min，洗涤3～5次。(包涵体SDS-PAGE图见附图1)包涵体用包涵体裂解液裂解(7M盐酸胍+50mMTris-HCl+10mM DTT，pH 6.5，m:V＝1:10)，室温搅拌，过夜。裂解的蛋白慢速加入复性液(100mMTris-HCl，0.5M Arginine，0.5％PEG3350(m:V)，2mM GSH:0.5mM GSSG，pH8.5)中，使蛋白终浓度为0.2mg/ml，室温搅拌，过夜。

复性液8000rpm离心5min，收集上清。利用超滤膜包，超滤膜孔径为10kDa，用20mM磷酸盐缓冲液pH7.0平衡超滤膜，然后将1L上清液浓缩10倍。浓缩液加入5倍体积的注射用水稀释，最终收集样品溶液600ml。将浓缩液上样到用20mM磷酸盐缓冲液pH7.0冲洗, 上样，然后用50mmol/LTris-HCl,pH8.5,0.15mol/LNaCl进行洗脱,收集洗脱峰组分；

Sepharose FF填料装柱，20mmol/L磷酸盐,pH7.4,0.05mol/LNaCl平衡，上样，直到检测器基线平稳。用20mmol/LPB,pH7.4,0.2mol/L NaCl冲洗,收集洗脱峰组分。

G25Media填料装柱，20mM磷酸氢二钠缓冲液平衡，上样，收集洗脱峰组分，经以上纯化流程后，最后得到的干扰素λ的纯度在95％以上。

实施实例3：新型冠状病毒体外药效

细胞：VeroE6细胞，由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心保存。

病毒：2019-nCoV，滴度为10⁵TCID₅₀/ml，由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心-80℃保存。使用病毒滴度为100TCID₅₀。

无菌96孔培养板，每孔加入200μl浓度为5×10⁴cell/ml Vero E6细胞，37℃5％CO₂培养 24小时；

(2)受试药物稀释成2个浓度，每个浓度5个复孔，每孔加入100μl，作用24h；

(3)每孔加入100μl100 TCID₅₀病毒；

(4)同时设立细胞对照、空白对照(溶剂对照)和病毒对照(阴性对照)；

(5)细胞37℃，5％CO₂孵箱孵育4-5天；

(6)光学显微镜下观察细胞病变(CPE)，细胞完全病变记录为“++++”，75％病变记录为“+++”，50％病变记录为“++”，25％病变记录为“+”，未病变记录为“－”。

IFNλ1抗新型冠状病毒2019-nCoV效果

结论：在实验条件下IFNλ1/λ2/λ3/λ4在10ng/ml(0.5nmol/L)浓度下100％保护了细胞免受新冠病毒侵染，显示了非常好的治疗潜力。

实施实例4：新型冠状病毒体外药效

实验操作：

细胞：VeroE6细胞，干扰素λ1/λ2/λ3。

病毒：2019-nCoV，滴度为10⁵TCID₅₀/ml，由中国医学科学院医学实验动物研究所病原中心-80℃保存。使用病毒滴度为100TCID₅₀。

(1)无菌96孔培养板，每孔加入200μl浓度为5×10⁴cell/ml Vero E6细胞，37℃5％CO₂培养24小时；

(2)受试药物稀释成9个浓度，每个浓度2个复孔，每孔加入100μl，作用24h；

(3)每孔加入100μl100 TCID₅₀病毒；

(4)同时设立细胞对照、空白对照(溶剂对照)和病毒对照(阴性对照)；

(5)细胞37℃，5％CO₂孵箱孵育4-5天；光学显微镜下观察细胞病变(CPE)，继续培养至病毒对照组病变达4+时观察结果,并用Reed-Muenc法计算半数有效浓度EC₅₀。

通过抗病毒实验可以看出，干扰素λ1对新冠病毒的EC50为2.087ng/ml，而细胞毒性实验显示，IC₅₀大于200μg/ml。SI大于100,000。有着非常大的安全窗口。

实施例5

根据相关研究结果，新冠病毒感染患者在病毒感染后，引起的细胞因子风暴，造成了呼吸窘迫综合征(ARDS)，因此在治疗的过程中能要控制这些并发症状的发生。

实验动物：雄性C57小鼠，18-22g，30只，上海灵畅生物科技有限公司

模型建立：

动物麻醉后，剪开皮肤暴露气管；经气管缓慢注射LPS溶液(50ul/只，0.3mg/kg)复制急性肺损伤模型；监测动物体重及健康状况，自建模开始到实验结束共计24h。

实验设计：

实验结果见图3-5

结果表明：在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中研究显示，在组织学评价中，与模型组相比，干扰素给药组有显著性的减轻肺损伤和炎症反应的疗效，与模型组相比，治疗组差异具有显著性；在降低肺泡损伤总评分及对肺损伤总评分方面，干扰素λ1雾化给药方式均要明显优于干扰素α2b组，证明在用干扰素治疗由新冠病毒感染患者过程中，干扰素λ1可以更好地控制治疗过程中引起的细胞因子风暴，并减缓由此造成的呼吸窘迫综合征(ARDS)。

序列表

<110> 杭州先为达生物科技有限公司

<120> 干扰素λ在新型冠状病毒（2019-nCoV）感染治疗中的应用

<130> 背景技术中

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 200

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys

20 25 30

Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala

35 40 45

Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys

50 55 60

Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg

65 70 75 80

Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala

85 90 95

Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp

100 105 110

Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu

115 120 125

Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly

130 135 140

Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu

145 150 155 160

Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu

165 170 175

Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg

180 185 190

Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr

195 200

<210> 2

<211> 200

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Lys Leu Asp Met Thr Gly Asp Cys Thr Pro Val Leu Val Leu Met

1 5 10 15

Ala Ala Val Leu Thr Val Thr Gly Ala Val Pro Val Ala Arg Leu His

20 25 30

Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser

35 40 45

Leu Ser Pro Gln Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu

50 55 60

Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys Arg Cys His Ser Arg Leu Phe

65 70 75 80

Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Met

85 90 95

Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr

100 105 110

Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Val Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His

115 120 125

Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Phe Arg Ala Cys Ile Gln Pro Gln

130 135 140

Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr

145 150 155 160

Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala

165 170 175

Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys

180 185 190

Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val

195 200

<210> 3

<211> 196

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Thr Gly Asp Cys Met Pro Val Leu Val Leu Met Ala Ala Val Leu

1 5 10 15

Thr Val Thr Gly Ala Val Pro Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro

20 25 30

Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln

35 40 45

Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu

50 55 60

Leu Leu Lys Asp Cys Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp

65 70 75 80

Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala

85 90 95

Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp

100 105 110

Pro Ala Leu Gly Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His

115 120 125

Ile Leu Ser Gln Leu Arg Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly

130 135 140

Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu

145 150 155 160

Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe

165 170 175

Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly

180 185 190

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195

<210> 4

<211> 179

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Arg Pro Ser Val Trp Ala Ala Val Ala Ala Gly Leu Trp Val Leu

1 5 10 15

Cys Thr Val Ile Ala Ala Ala Pro Arg Arg Cys Leu Leu Ser His Tyr

20 25 30

Arg Ser Leu Glu Pro Arg Thr Leu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Arg Asp

35 40 45

Arg Tyr Glu Glu Glu Ala Leu Ser Trp Gly Gln Arg Asn Cys Ser Phe

50 55 60

Arg Pro Arg Arg Asp Pro Pro Arg Pro Ser Ser Cys Ala Arg Leu Arg

65 70 75 80

His Val Ala Arg Gly Ile Ala Asp Ala Gln Ala Val Leu Ser Gly Leu

85 90 95

His Arg Ser Glu Leu Leu Pro Gly Ala Gly Pro Ile Leu Glu Leu Leu

100 105 110

Ala Ala Ala Gly Arg Asp Val Ala Ala Cys Leu Glu Leu Ala Arg Pro

115 120 125

Gly Ser Ser Arg Lys Val Pro Gly Ala Gln Lys Arg Arg His Lys Pro

130 135 140

Arg Arg Ala Asp Ser Pro Arg Cys Arg Lys Ala Ser Val Val Phe Asn

145 150 155 160

Leu Leu Arg Leu Leu Thr Trp Glu Leu Arg Leu Ala Ala His Ser Gly

165 170 175

Pro Cys Leu