一种生长激素原料药溶液、水针剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种生长激素原料药溶液、水针剂及其制备方法 (Growth hormone raw material medicine solution, water injection and preparation method thereof ) 是由 朱琪 上官春晓 王云 陈晓春 于 2020-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种生长激素原料药溶液,包括生长激素,所述的生长激素原料药溶液还包括缓冲液,所述的缓冲液中包括8.3～9.1g/L的氯化钠、9.5～10.5mM的柠檬酸钠,所述的缓冲液的pH为5.7～6.3。本发明的原料药溶液可以在冷冻状态下稳定保存和运输,且可在复溶后保持产品的纯度和质量,且本发明的制备方法方便、节能、高效,适合工业化生产。(The invention relates to a growth hormone bulk drug solution which comprises growth hormone and a buffer solution, wherein the buffer solution comprises 8.3-9.1 g/L of sodium chloride and 9.5-10.5 mM of sodium citrate, and the pH value of the buffer solution is 5.7-6.3. The bulk drug solution can be stably stored and transported in a frozen state, the purity and the quality of the product can be kept after redissolution, and the preparation method is convenient, energy-saving and efficient, and is suitable for industrial production.)
技术领域
本发明属于基因重组
技术领域
，具体涉及一种生长激素原料药溶液、水针剂及其制备方法。背景技术
重组人生长激素，是由基因工程方法制备的基因工程药物，具有与天然人脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的人生长激素完全一致的蛋白质序列和结构，含有191个氨基酸，是一种非糖基化的单链水溶性蛋白。人生长激素作用广泛，对人体多数组织(除神经组织外)起促生长功能，并能促使脂肪、糖类的降解，增进蛋白质和核酸的合成。
重组人生长激素传统上可以用于治疗儿童身材矮小、生长发育迟缓，每年可促进青少年身高增长5-10cm，使生长激素缺乏的儿童获得更好的成年身高，安全有效。还可治疗成人的生长激素缺乏症，如经历脑垂体手术、垂体前叶功能减退症、头部外伤、感染或脑部放疗及其他原因造成生长激素缺乏，患者出现肥胖、腹部脂肪堆积、肌肉体积减少、乏力、记忆力下降、骨质疏松和情绪低落等症状。给予适量重组人生长激素治疗，就可纠正上述症状，如减少腹部脂肪堆积，增加身体肌肉含量，降低心血管疾病的风险。长期用药还可改善自我感觉，提高情绪，从而全面提升患者的身心健康水平。此外，重组人生长激素还可辅助治疗烧伤、骨折、创伤、出血性溃疡、组织坏死、肌肉萎缩、骨质疏松、肥胖等疾病。生长激素在美容和抗衰老的临床应用也在不断开发中。
从1985年美国FDA首次批准重组人生长激素用于临床以来，全球重组人生长激素的需求量和销售额在基因工程药物中一直名列前茅。目前，重组人生长激素已被载入多国药典，全球年销售收入超过30亿美元。全球已上市销售的生长激素有粉针剂型和水针剂型两种。粉针制备过程需要加入赋形剂并经冷冻干燥处理，容易形成多聚体和高聚体，导致临床上出现全身或局部的免疫反应，降低药效和带来副作用，不利于患者长期使用。而且粉针剂需要复溶和混匀，混匀不当会形成浑浊，影响药物的取用和吸收，并会进一步增加药物的空间结构破坏和导致更多聚体的形成，对于患者而言，不仅使用不便，还可能出现给药量的不准确性。此外，由于冻干和复溶所添加非活性成分赋形剂体积占比高，导致患者注射体积较水针剂多，增加注射给药的不便性和更容易引起注射部位的局部不良反应。国内外已有临床数据显示，水针剂的免疫原性反应率极低，并可降低患者因使用冻干制剂而引起的抗药抗体水平，长期使用水针剂更加安全。
重组人生长激素国际主流产品是水针剂型，而我国已有的重组人生长激素产品多数是冻干粉针。开发稳定的适合商业化大规模生产的水针剂生产工艺，对于推进重组人生长激素产品的成功上市具有重要的意义。常规的生长激素水针剂或是不透露原料药溶液的成分、工艺和保存条件，或是将原料药制备成相同成分的溶液，保存在2-8℃(如美国专利5763394，5981485，6448225)。但是原料药生产完成后，各项检测尤其是微生物检测就需要2-3周，如果在原料药检测结果完成之前就进行制剂的制备，具有一定的风险，而在原料药检测放行后制备，已经接近原料药保存期，而且大体积的原料药溶液保存和转运不便，以这种方式生产和保存的原料药用于制剂的制备，不利于保证更高的制剂产品质量，也不利于方便的工业化生产。因此，需要一种更加简易、便利并且可以延长原料药保存期的方法来进行生长激素水针剂制剂的生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够延长原料药保存期的生长激素原料药溶液、水针剂及其制备方法。
发明人经研究发现生长激素水针剂需要保存在2-8℃的原因主要是由于水针剂一旦冻融会发生严重的浑浊，形成沉淀，二聚体和高聚体含量增加，产品纯度下降。为了解决上述问题，发明人研究了生长激素水针剂冻融后产生浑浊的原因，并发现了一种有效的可冻存型生长激素原料药，解决了生长激素原料药冻存的问题。通过该方法制备的生长激素水针剂，不仅具有和常规非冻存型原料药制备的生长激素水针剂一致的产品质量和稳定性，而且该生长激素原料药在-20℃可稳定保存2年，稳定性优于常规非冻存型原料药。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
本发明一方面提供一种生长激素原料药溶液，包括生长激素，所述的生长激素原料药溶液还包括缓冲液，所述的缓冲液中包括8.3～9.1g/L的氯化钠、9.5～10.5mM的柠檬酸钠，所述的缓冲液的pH为5.7～6.3。
本发明的缓冲液中不含有苯酚，若缓冲液中含有苯酚，则冻融后，原料药溶液将产生浑浊。
根据一种实施方式，所述的缓冲液中还包括1.9～2.1g/L的吐温20。
优选地，所述的生长激素的浓度为6～10g/L。
优选地，所述的生长激素为重组人生长激素、重组牛生长激素、重组猪生长激素中的一种或多种。
根据一种具体且优选实施方式，所述的缓冲液的成分为8.7g/L的氯化钠以及10mM的柠檬酸钠。
根据另一种具体且优选实施方式，所述的缓冲液的成分为8.7g/L的氯化钠、10mM的柠檬酸钠以及2g/L的吐温20。
本发明另一方面提供一种所述的生长激素原料药溶液的制备方法，将所述的生长激素加入所述的缓冲液中制得所述的生长激素原料药溶液。
优选地，将所述的生长激素加入所述的缓冲液中后，通过超滤将所述的生长激素的浓度浓缩到7～8g/L，然后再用所述的缓冲液将所述的生长激素的浓度稀释至6.2～6.8g/L。
优选地，所述的生长激素可通过大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞等发酵表达，经过收集、分离、粗纯和精纯获得。生长激素的具体制备方法采用本领域常规方法即可。
本发明通过将纯化后的生长激素置换到缓冲液中制成液体原料药，使其可以在冷冻状态下稳定保存和运输，并可在复溶后保持产品纯度和质量，制剂生产前将液体原料药融化后加入防腐剂，混匀分装成液体制剂。
本发明的第三方面提供一种所述的生长激素原料药溶液的储存方法，将所述的生长激素原料药溶液冻存。
优选地，所述的冻存温度为-15℃及以下。
本发明的第四方面是提供一种所述的生长激素原料药溶液或者所述的冻存后的原料药溶液在制备生长激素水针剂中的应用。
本发明的第五方面是提供一种生长激素水针剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述的储存方法冻存后的生长激素原料药溶液融化，或者，取所述的生长激素原料药溶液；
(2)加入含95～105g/L吐温的氯化钠-柠檬酸盐溶液，搅拌混匀；
(3)加入含浓度≤15g/L苯酚的氯化钠-柠檬酸盐溶液，搅拌混匀；
(4)选择性地采用氯化钠-柠檬酸盐溶液调整生长激素的浓度至所需浓度。
优选地，氯化钠-柠檬酸盐溶液与制备原料药的缓冲液相同。
本发明中，生长激素水针剂中生长激素的浓度根据具体规格调整，例如5.0g/L。
本发明中的水针剂在2～8℃下保存。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的原料药溶液可以在冷冻状态下稳定保存和运输，且可在复溶后保持产品的纯度和质量，且本发明的制备方法方便、节能、高效，适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例7的重组人生长激素原料药和制剂的分子排阻色谱法(SE C-HPLC)纯度分析结果图，其中上方的曲线为重组人生长激素原料药，纯度99.93％，下方的曲线为重组人生长激素制剂，纯度99.75％，标1的峰为重组人生长激素，标2的峰为柠檬酸钠，标3的峰为苯酚。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。
下文以重组人生长激素为例介绍本发明的技术方案，本发明所述工艺过程和成分也同样适用于其他类型重组生长激素，如重组牛生长激素、重组猪生长激素等。
实施例1
重组人生长激素通过大肠杆菌发酵表达，经收集、分离、粗纯和精纯，得到纯度不低于96％的重组人生长激素。
取纯化的重组人生长激素，将其置换至含有8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠，2.0g/L吐温20，pH6.0缓冲液中，使蛋白终浓度分别为6.0g/L、7.5g/L和10.0g/L。将各浓度蛋白溶液分别冻存在-20℃，冻存后取出室温融化，各重复5次，每次融化后取样进行澄清度和分子排阻色谱法(SE C-HPLC)检测，其中，澄清度检测采用目视法。
不同冻融次数的原料药澄清度检测结果见表1，由表1可知：在8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠，2.0g/L吐温20，pH6.0缓冲液中冻融5次后澄清度仍无变化，在0-0.5级之间，说明该缓冲液适合作为重组人生长激素液体原料药缓冲液，并可以耐受5次冻融。
表1
分子排阻色谱法检测不同冻融次数的原料药纯度的结果见表2，由分子排阻色谱法结果可知，在8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠，2.0g/L吐温20，pH6.0缓冲液(缓冲液1)中原料药可耐受5次冻融，二聚体不会明显增多。说明该缓冲液适合作为重组人生长激素液体原料药缓冲液，并可以耐受5次冻融。
表2
实施例2
重组人生长激素蛋白前体通过大肠杆菌发酵表达，经收集、分离、粗纯和精纯，得到纯度不低于96％的重组人生长激素。
取纯化的重组人生长激素，将其置换至含有8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠，2.5g/L苯酚，pH6.0缓冲液(缓冲液2)中，使蛋白终浓度分别为6.0g/L、7.5g/L和10.0g/L。将各浓度蛋白溶液分别冻存在-20℃，冻存后取出室温融化，各重复5次，每次融化后取样进行澄清度和分子排阻色谱法检测。
根据澄清度检测结果，在8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠，2.5g/L苯酚中冻融1次即出现浑浊，浊度>Ⅳ，故该缓冲液不适合作为液态原料药的保存溶液。
实施例3
重组人生长激素蛋白前体通过大肠杆菌发酵表达，经收集、分离、粗纯和精纯，得到纯度不低于96％的重组人生长激素。
取纯化的重组人生长激素，将其置换至含有8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠，pH6.0缓冲液(缓冲液3)中，使蛋白终浓度分别为6.0g/L、7.5g/L和10.0g/L。将各浓度蛋白溶液分别冻存在-20℃，冻存后取出室温融化，各重复5次，每次融化后取样进行澄清度和分子排阻色谱法检测。
不同冻融次数的原料药澄清度检测结果见表3，由表3可知：在8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠，pH6.0缓冲液中冻融5次后澄清度仍无变化，在0.5-Ⅰ级之间。说明该缓冲液适合作为重组人生长激素液体原料药缓冲液，并可以耐受5次冻融。
分子排阻色谱法检测不同冻融次数的原料药纯度的结果见表4，由分子排阻色谱法结果可知：在8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠，pH6.0缓冲液中冻融5次后二聚体并未明显增多，说明该缓冲液适合作为重组人生长激素液体原料药缓冲液，并可以耐受5次冻融。
表3
表4
实施例4
按实施例3制备重组人生长激素原料药溶液，将蛋白浓度分别调整为5.56g/L、6.0g/L、7.5g/L和10.0g/L，取样检测澄清度。将吐温20加入8.7g/L氯化钠,10mM柠檬酸钠,pH6.0缓冲液中，制成浓度为稀释到4g/L，6g/L,12g/L，20g/L的吐温20溶液。将苯酚分别加入吐温20溶液中，分别制成苯酚浓度为5g/L，7.5g/L，15g/L，25g/L的苯酚/吐温20溶液。向各浓度的生长激素溶液中分别加入所需浓度的苯酚/吐温20溶液，搅拌混匀，制备成重组人生长激素水针剂，生长激素、吐温20和苯酚终浓度分别为5.0g/L、2.0g/L和2.5g/L，取样进行澄清度检测。
澄清度检测结果见表5，由澄清度结果可知，制备苯酚/吐温20溶液时，当苯酚浓度大于15g/L时会产生浑浊，而且浊度随着苯酚浓度的增大而增加，之后再将苯酚/吐温20溶液加入到生长激素溶液中浊度会减弱并可在过滤后恢复澄清度，但是浑浊可能会对生长激素的质量产生影响，造成纯度的降低，因此，苯酚/吐温-20里的苯酚浓度不应高于15g/L。
表5
分子排阻色谱法分析结果见表6，由分子排阻色谱法结果可知，苯酚浓度≤15g/L，加入前后纯度基本一致，当苯酚浓度为25g/L时，纯度略有下降。
表6
实施例5
按实施例3制备重组人生长激素原料药溶液，将蛋白浓度分别调整为5.56g/L、5.80g/L、6.00g/L、6.12g/L和7.5g/L，取样检测澄清度。将吐温20加入8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠，pH6.0缓冲液中，制成浓度为100g/L的吐温20溶液。将苯酚加入8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠,pH6.0缓冲液中，分别制成浓度为7.5g/L，15g/L，16.7g/L，20.8g/L和25g/L的苯酚溶液。
向各浓度的生长激素溶液中分别加入100g/L的吐温20溶液，搅拌混匀。然后再分别加入不同浓度的苯酚溶液，搅拌混匀，制备成重组人生长激素水针剂，生长激素、吐温20和苯酚终浓度分别为5.0g/L、2.0g/L和2.5g/L，取样进行澄清度检测和分子排阻色谱法分析。
分子排阻色谱法分析结果见表7，当加入含7.5g/L苯酚的缓冲时，纯度基本无变化，到15g/L时纯度略有下降，随着加入苯酚浓度的增大，纯度进一步降低。
表7
实施例6
将层析纯化后得到的重组人生长激素溶液通过超滤置换到8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠，pH 6.0的缓冲液中，浓缩到7-8g/L，然后用8.7g/L氯化钠，10mM柠檬酸钠，pH 6.0的缓冲液将蛋白质浓度稀释到6.5g/L，0.22μm过滤后，分装至5mL西林瓶中，-20℃冻存。
将冻存的生长激素原料药溶液从-20℃中取出，分别在冰水混合物、2-8℃和30℃融化，记录完全融化所需要的时间。取样进行澄清度和纯度分析，分析结果见表8(不同条件下原料药融化所需时间及澄清度和分子排阻色谱法纯度)，从结果可见原料药融化温度对澄清度和纯度的影响不明显。
表8
实施例7
按实施例6制备重组人生长激素原料药溶液，无菌过滤后分装1L冻存瓶中，0.5L/瓶，-20℃保存。取样进行澄清度和分子排阻色谱法纯度等各项检测。经检测澄清度为0-0.5，其他各项指标均符合药典要求，纯度分析结果见图1。
将吐温20加入8.7 g/L氯化钠，10 mM柠檬酸钠，pH6.0缓冲液中，制成浓度为100g/L的吐温20溶液。将苯酚加入8.7 g/L氯化钠，10 mM柠檬酸钠，pH6.0缓冲液中，制成浓度为15g/L的苯酚溶液。
将生长激素原料药溶液从-20℃冻存后取出，2-8℃使之完全融化(约36小时)；分别加入100 g/L的吐温20溶液，200-300 rpm搅拌混匀；然后再加入苯酚溶液，200-300 rpm搅拌混匀；最后用8.7 g/L氯化钠，10 mM柠檬酸钠，pH 6.0的缓冲液将生长激素浓度稀释到5.0 g/L，制备成重组人生长激素水针剂，生长激素、吐温20和苯酚终浓度分别为5.0 g/L、2.0 g/L和2.5 g/L。取样进行澄清度检测和分子排阻色谱法纯度等各项检测。经检测澄清度为0-0.5，其他各项指标均符合药典要求，纯度分析结果见图1。
实施例8
按实施例6制备重组人生长激素原料药溶液，分别置于-20±5℃、5±3℃进行稳定性考察。运用目视观察法、分子排阻色谱法和反相高效液相色谱法检测重组人生长激素原料药原液在不同存储条件下澄清度、高分子量蛋白质和相关蛋白含量的变化。在-20±5℃和5±3℃条件下，所得稳定性数据分别如表9(原料药-20±5℃稳定性数据)和表10(原料药5±3℃稳定性数据)所示。稳定性数据表明，重组人生长激素原料药原液在-20±5℃条件下可稳定存放24个月，在5±3℃条件下可稳定存放1个月。
表9
表10
5±3℃时间点(月)
可接受标准
0
1
3
6
12
澄清度
澄清或微浊
澄清
澄清
澄清
澄清
澄清
高分子量蛋白含量(％)
≤4.0
0.1
0.2
0.4
0.5
0.5
相关蛋白含量(％)
≤6.0
2.4
3.1
5.6
6.5
6.4
按实施例7制备重组人生长激素水针剂，分别置于5±3℃、25±2℃进行稳定性考察。运用目视观察法、分子排阻色谱法和反相高效液相色谱法检测重组人生长激素制剂在不同存储条件下澄清度、高分子量蛋白质和相关蛋白含量的变化。5±3℃、25±2℃所得稳定性数据分别如表11(制剂5±3℃稳定性数据)和表12(制剂25±2℃稳定性数据)所示，稳定性数据表明，重组人生长激素制剂在5±3℃条件下可稳定存放24个月，在25±2℃条件下可稳定存放1个月。
表11
表12
本发明通过对不同溶液中重组人生长激素原料药的冻融稳定性考察，确定了一种可以耐受冻融的重组人生长激素原料药，其成分为6.5±0.3g/L重组人生长激素，8.7g/L氯化钠,10mM柠檬酸钠,pH6.0或6.5g/L重组人生长激素，8.7g/L氯化钠,10mM柠檬酸钠,2.0g/L吐温20，pH6.0。常规制备方法的原料药溶液需要保存在2-8℃并需要在1个月内用于制剂生产，而采用本发明方法制备的重组人生长激素原料药溶液可以稳定保存在-20℃，稳定性达到2年，进一步将该原料药溶液融化后，通过本发明的程序制备成重组人生长激素水针剂，产品质量可以满足欧洲、美国和中国药典的质量指标及稳定性要求。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
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