一种视网膜保护剂、视网膜保护方法以及保护剂的应用
阅读说明：本技术 一种视网膜保护剂、视网膜保护方法以及保护剂的应用 (Retina protective agent, retina protective method and application of protective agent ) 是由 白洁 张永明 杨帆 于 2021-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种视网膜保护剂、视网膜保护方法以及保护剂的应用,属于视网膜领域,一种视网膜保护剂,主要用于对糖尿病患者引起的视网膜损伤进行改善,相比于传统的抗VEGF药物和激素类药物对糖尿病视网膜病变的治疗,不易出现治疗终止,病变复发的问题,且本保护剂安全无毒,具有抑制细胞凋亡、抑制氧化损伤、延缓组织衰老等多重功效,市面上的价格也更低廉。(The invention discloses a retina protective agent, a retina protection method and application of the protective agent, belongs to the field of retinas, and the retina protective agent is mainly used for improving retina injury caused by diabetic patients, is less prone to the problems of treatment termination and recurrence compared with the traditional treatment of diabetic retinopathy by anti-VEGF (vascular endothelial growth factor) medicines and hormone medicines, is safe and non-toxic, has multiple effects of inhibiting apoptosis, inhibiting oxidative damage, delaying tissue aging and the like, and is lower in price in the market.)
技术领域
本发明涉及视网膜领域，更具体地说，涉及一种视网膜保护剂、视网膜保护方法以及保护剂的应用。
背景技术
糖尿病患者体内长期高血糖状态及血液成分的改变破坏了血-视网膜屏障，视网膜毛细血管周细胞坏死，内皮功能障碍，导致血管中的液体成分渗漏至视网膜组织间隙中，引起视网膜组织一系列的改变：出血、水肿、渗出、缺血等。
虽然近年来抗VEGF药物和激素类药物已经用于糖尿病视网膜病变的治疗，但是，治疗目标主要针对糖尿病性黄斑水肿，需要长期持续给药，治疗期间可以阶段性的提高视力，一旦停止治疗，很容易引起黄斑水肿复发，该治疗方法不能从根本上解决糖尿病视网膜损伤的问题。因此探索糖尿病视网膜病变的早期分子生物学改变机制，并寻找潜在的治疗方法具有重大的临床意义。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的第一目的在于提供一种视网膜保护剂，它的内部含有生长激素释放肽成分，能够对糖尿病患者可能引起的视网膜损伤进行保护改善，相比于传统的抗VEGF药物和激素类药物对糖尿病视网膜病变的治疗，不易出现治疗终止，病变复发的问题，且市面上的价格也更低廉；
第二目的在于提供一种视网膜的保护方法，其使用了上述视网膜保护剂来保护视网膜，安全无毒，具有抑制细胞凋亡、抑制氧化损伤、延缓组织衰老等多重功效；
第三目的在于提供一种视网膜保护剂的应用，本视网膜保护剂可以应用于制备保护糖尿病性视网膜病中感光细胞凋亡、制备保护糖尿病性视网膜病中感光细胞活力、制备保护糖尿病性视网膜病中视网膜神经纤维层厚度、制备改善糖尿病性视网膜病中视网膜感光细胞层中TUNEL染色阳性细胞数量、制备改善糖尿病性视网膜病中细胞核和细胞质结构以及制备抑制糖尿病性黄斑水肿等药物中。
一种视网膜保护剂，所述保护剂包括生长激素释放肽，所述保护剂使用时经过细胞培养液培养。
进一步的，所述细胞培养液的成分包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清。
进一步的，所述生长激素释放肽购自Sigma Chemical(St.Louis,MO,USA)。
进一步的，所述保护剂应用于眼部组织。
进一步的，所述眼部组织包括晶状体、小梁网和视神经中的一种或多种。
一种视网膜保护方法，使用上述视网膜保护剂。
一种视网膜保护剂在制备保护糖尿病性视网膜病中感光细胞凋亡的药物中的应用。
一种视网膜保护剂在制备保护糖尿病性视网膜病中感光细胞活力的药物中的应用。
一种视网膜保护剂在制备保护糖尿病性视网膜病中视网膜神经纤维层厚度的药物中的应用。
一种视网膜保护剂在制备改善糖尿病性视网膜病中视网膜感光细胞层中TUNEL染色阳性细胞数量的药物中的应用。
一种视网膜保护剂在制备改善糖尿病性视网膜病中细胞核和细胞质结构的药物中的应用。
一种视网膜保护剂在制备抑制糖尿病性黄斑水肿的药物中的应用。
相比于现有技术，本发明的优点在于：
本方案的视网膜保护剂内部含有生长激素释放肽（Ghrelin）成分，主要用于对糖尿病患者可能引起的视网膜损伤进行保护改善，相比于传统的抗VEGF药物和激素类药物对糖尿病视网膜病变的治疗，不易出现治疗终止，病变复发的问题，且本保护剂安全无毒，具有抑制细胞凋亡、抑制氧化损伤、延缓组织衰老等多重功效，市面上的价格也更低廉。
附图说明
图1为本发明的对照组视网膜组织图；
图2为本发明的模型组视网膜组织图；
图3为本发明的ghrelin组视网膜组织图；
图4为本发明的对照组视网膜TUNEL染色结果图；
图5为本发明的模型组视网膜TUNEL染色结果图；
图6为本发明的ghrelin组视网膜TUNEL染色结果图；
图7为本发明的对照组视网膜色素上皮层透射电镜观察图；
图8为本发明的模型组视网膜色素上皮层透射电镜观察图；
图9为本发明的ghrelin组视网膜色素上皮层透射电镜观察图；
图10为本发明的大鼠视网膜组织病理改变（×200）柱形图。
具体实施方式
本专利以高糖诱导的视网膜色素上皮细胞及db/db小鼠为研究对象，体外给予Ghrelin后，观察视网膜色素上皮细胞NLRP3炎症体活化、炎症因子释放的变化规律及视网膜损伤情况，阐明Ghrelin减轻糖尿病性视网膜损伤的新机制，从而为Ghrelin防治糖尿病视网膜病变提供新的理论依据。
实施例1（研究外源性Ghrelin对db/db小鼠视网膜组织的保护作用）：
步骤如下：
步骤一：二型糖尿病小鼠db/db分组及处理方法：取10周龄db/db小鼠，利用鼠尾动脉测血糖的方法（血糖≥16.6 mmol/L）鉴定糖尿病模型是否成功。动物分组：对照组、模型组和Ghrelin组。Ghrelin组：在模型组最后两周开始给予皮下置入微量泵持续泵入Ghrelin（5μg/kg/d）两周。。
步骤二：HE染色检查视网膜结构：视网膜组织用二甲苯进行脱蜡处理，制备石蜡切片，梯度酒精脱水，蒸馏水反复冲洗，苏木素染液浸泡10 min后氨水及酸水分色，置于梯度酒精溶液浸泡10 min，HE染色30 s，封片后拍照。
步骤三：电镜观察视网膜组织：取出戊二醛固定液中的视网膜组织，蒸馏水反复冲洗后四氧化锇（OsO4）固定2 h，梯度酒精脱水，染色后环氧树脂包埋，制备超薄切片，透射电镜观察大鼠视网膜组织并拍照。
步骤四：检测Ghrelin及受体表达：通过高效液相色谱法检测房水中Ghrelin表达；RT-PCR及Western blot法检测视网膜组织中 Ghrelin、GHSR-1a表达。
步骤五：检测视网膜组织 NLRP3炎症体表达及活化：取视网膜组织制成冰冻切片，采用免疫荧光法检测视网膜组织和RPE细胞内NLRP3炎症体表达。用ELISA法检测ICAM-1、TNF-α因子表达，通过western blot技术检测视网膜组织中NLRP3炎症体蛋白（NLRP3、pro-caspase-1）表达情况。
步骤六：检测视网膜组织中P2X7R表达：取视网膜组织，利用real-time PCR方法检测视网膜组织中P2X7R表达。
实施例2（HE染色观察视网膜组织病理形态学变化）：
每组随机取3只大鼠，摘除左侧眼球后将部分视网膜组织用4%多聚甲醛固定2小时，将5μm的视网膜切片置于载玻片上，梯度酒精冲洗后H&E染色，光镜（200×）拍摄图像。
S视网膜组织病理改变：
如图1-3所示，图1对照组视网膜组织完整，结构清晰；图2模型组视网膜厚度明显降低，内、外核层细胞排布疏松；图3ghrelin组视网膜厚度较模型组增加，结构相对规整。
实施例3（TUNEL染色检测大鼠视网膜细胞凋亡）：
视网膜切片脱蜡后用二甲苯浸洗两次，酒精梯度脱水后加入TUNEL反应混合液，湿盒内孵育2 h，甩干切片并入DAB显色液，显微镜下观察细胞核呈棕黄色的为TUNEL阳性，磷酸盐缓冲液洗切片终止显色，中性树胶封片，光镜（200×）拍摄图像。
视网膜TUNEL染色结果：
如图4-6所示，图4对照组大鼠视网膜感光细胞层偶见深棕色的TUNEL染色阳性细胞。图5模型组TUNEL染色阳性细胞数明显增多。图6ghrelin干预后，TUNEL染色阳性细胞数量减少。
实施例4（透射电镜观察视网膜）：
每组取3只大鼠，摘除左侧眼球后将视网膜组织用2%戊二醛固定24 h，醋酸铀溶液染色，乙醇-丙酮梯度溶液脱水，用柠檬酸铅-醋酸铀对制备视网膜的超薄切片（80nm）染色5min，透射电子显微镜观察RPE层超微结构，电镜（×7000-10000）。
视网膜色素上皮层透射电镜观察：
如图7-9所示，图7对照组细胞形态正常，细胞核呈圆形或椭圆形，细胞之间界限清晰。图8模型组细胞胞浆空泡化明显，细胞膜不完整或破裂，可见大量空泡及脂滴。图9ghrelin干预后的细胞核和细胞质结构有所改善，细胞内仍有大量空泡存在。
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