具体实施方式

在一个方面，提供了包括至少两种抗生活性成分的药物制剂，所述抗生活性成分选自：作为大麻环萜酚(CBC)、大麻二醇(CBD)和/或大麻萜酚(CBG)中的一种或多种的大麻素；作为α-律草烯和/或β-石竹烯之一或两者的倍半萜烯；和作为达托霉素或其类似物的脂肽抗生素。可以以协同有效的相对量提供所述抗生有效成分。例如，可以以仅在协同组合中具有抗生活性的浓度提供大麻素和倍半萜烯，如≤1μg/ml的大麻素和≤32μg/ml的萜烯。在协同组合中，同伴的抑制浓度可以(例如)降低(例如)两倍或更多倍，例如，2-16倍。作为另外一种选择，大麻素与倍半萜烯的相对重量比可以(例如)为约1:5至1:50，或者1:8至1:32，或者1:12至1:32。可以布置所述抗生活性成分在所述制剂中的相对浓度，从而所述制剂的有效量将在抑制屎肠球菌(Enterococcus faecium)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的生长和/或繁殖的测定中协同有效。提供这种协同制剂的制剂可以用于治疗肠球菌或其它微生物感染，例如，用于治疗与屎肠球菌(Enterococcus faecium)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的参考株相对密切相关的肠球菌种的感染(参见Zhong等人,2017)。例如，适合于治疗的肠球菌种对参考株的密切相关程度可以至少与屎肠球菌(E.faecium)和粪肠球菌(E.faecalis)的最远相关株相同。适合于治疗的微生物可以(例如)耐受抗生素，例如，耐受达托霉素的VRE株。例如，耐久肠球菌(Enterococcus durans)适合于治疗，例如，在兽医学疾病的背景中。与屎肠球菌(E.faecium)或粪肠球菌(E.faecalis)密切相关的其它肠球菌种可以(例如)包括蒙氏肠球菌(E.mundtii)、耐久肠球菌(E.durans)、海氏肠球菌(E.hirae)、鼠肠球菌(E.ratti)、绒毛肠球菌(E.villorum)、泰国肠球菌(E.thailandicus)和E.phoeniculicola、白蚁肠球菌(E.termitis)、魁北克肠球菌(E.quebecensis)、摩拉维亚肠球菌(E.moraviensis)、卡氏肠球菌(E.caccae)、溶过氧化肠球菌(E.haemoperoxidus)和西里西亚肠球菌(E.silesiacus)。

在所选实施方式中，使用低于每种组分的MIC，例如，稍低于MIC的抗生活性组分浓度，使协同和/或增强作用最大。因此，所述组分可以以接近所述组分各自的MIC的比的相对量存在。例如，这可以在萜烯/大麻素的摩尔比≥50时发生(反映所述组分的MIC比)。

大麻素与倍半萜烯的摩尔比可以(例如)在1:100至50:1之间。例如，协同组合可以具有1:8至1:32之间的大麻素与倍半萜烯的摩尔比。药学上可接受的赋形剂可以任选地包括在所述制剂中，并且可以将大麻素和倍半萜烯溶解、分散、混合或混悬在所述制剂中。一种制剂方法可以包括产生(例如)处于小瓶中用于复原的无菌冻干粉末。

所述大麻素和倍半萜烯可以(例如)得自植物提取物，如大麻(Cannabis sativa)或印度大麻(Cannabis indica)的提取物。生产大麻素和倍半萜烯的生物合成方法也是可用的，多种合成方法也是可用的(例如，基于用于合成THC/屈大麻酚的方法，参见，美国专利No.7,323,576和Trost and Dogra,2007)。替代方法包括在重组宿主，如重组酵母中表达大麻素生物合成基因(参见Luo等人,2019)。

达托霉素的衍生物或类似物可以(例如)用作脂肽抗生素，作为达托霉素本身的替代或除达托霉素本身的使用之外使用(参见Nguyen等人,2006；Baltz,2006；和Miao等人,2006；Nguyen等人,2010)。在所选实施方式中，达托霉素类似物是(例如)在对肠球菌种的抗生活性测定中，在本文所公开的制剂中具有与所述大麻素和/或倍半萜烯中的一种或多种协同的抗生活性的脂肽抗生素。达托霉素类似物或衍生物可以(例如)通过其中一个或多个氨基酸的替换，如通过保守替换，例如，其中1、2、3、4或5个氨基酸的替换，例如，用天然或非天然氨基酸的替换不同于达托霉素。达托霉素类似物可以(例如)包括环脂缩酚酸肽达托霉素或其衍生物，其中附接至Trp¹氨基的脂肪酸链是反异十一烷酰基、异十二烷酰基或反异十三烷酰基。

在替代制剂中，可以包括或具体地排除一种或多种其它化合物，其包括，例如：萜烯、萜类化合物、甾醇类、甘油三酯、烷烃、角鲨烯、维生素E、类胡萝卜素、叶绿素、黄酮苷或生物碱。

抗-微生物制剂可以用于预防性或治疗性治疗微生物感染，或另外抑制微生物生长或增殖。抗生素是对细菌具有活性的抗微生物剂，并且在该背景中，抗生素包括通过任何机制，包括抗菌或杀菌方式杀死或抑制细菌生长或增殖的天然存在的和合成的物质。

适合于治疗的受试者包括哺乳动物受试者，如人患者、实验室动物(例如，灵长类、大鼠、小鼠)、家畜(例如，牛、绵羊、山羊、猪、马、家禽)或者家养宠物(例如，狗、猫、啮齿类、鸟)，例如，其属于灵长类、犬、猫、牛、山羊、马、羊、猪、啮齿类、鸟类或兔类的分类群。要治疗的人患者可以(例如)是处于特定发育阶段：新生儿、婴儿、少儿、青年、成年和老年的男性或女性患者。适合于治疗的具体兽医学适应症可以(例如)包括禽类中的肠球菌感染，例如，鸡中盲肠肠球菌(Enterococcus cecorum)感染的治疗。

在替代实施方式中，可以以递送和/或维持协同有效量的活性成分的剂量或剂量形式施用制剂。

所述制剂的大麻素和/或倍半萜烯组分可以(例如)处于植物提取物的形式，或者来源于植物提取物，或者得自培养物，如重组宿主，如表达所述组分的重组酵母的培养物。律草烯和β-石竹烯是异构体，通常一起存在于多种植物中。另外，可以包括药学上可接受的赋形剂，并且可以以可滴定的剂量形式提供所述制剂。在所选实施方式中，可以作为大麻(Cannabis)属植物，例如，大麻(Cannabis sativa)或印度大麻(Cannabis indica)或者重组酵母宿主的培养物的提取物获得所述制剂的大麻素组分。多种方法可以用于制备这些植物提取物，其包括(但不限于)使用CO₂的超临界或亚临界提取、使用高温气体的提取和使用溶剂的提取。制剂还可以具体地不包括其它萜类化合物或萜烯，包括植物-来源的萜类化合物或萜烯，如虾青素或其它倍半萜烯、四萜、三萜、双萜或单萜。

可以(例如)调整可滴定剂量以允许患者以小于单位剂量的剂量采取药物治疗，其中将“单位剂量”定义为可以在任一时间或在具体剂量期内采取的最大药物治疗剂量。剂量滴定将允许不同患者逐渐提高剂量直至它们感到药物治疗有效，这是因为并非所有患者将需要相同剂量来实现相同益处。体型较大或代谢较快的人可能需要更大的剂量来实现与体型较小或代谢较慢的另一个人相同的效果。因此，可滴定剂量具有优于标准剂量形式的优势。

在所选实施方式中，可以调整制剂，从而以靶向以下中的一种或多种的方式递送：舌下、口腔、口服、直肠、鼻、肠胃外和通过肺系统。制剂可以(例如)处于以下形式中的一种或多种：凝胶、凝胶喷雾、片剂、液体剂、胶囊剂、通过注射或用于蒸发。

可以使用常规药物实践以提供适合的制剂或组合物以将所述制剂施用于受试者。施用途径可以(例如)包括肠胃外、静脉内、皮内、皮下、肌内、颅内、眶内、眼、心室内、囊内、脊柱内、鞘内、脑池内、腹膜内、鼻内、吸入、气溶胶、表面、舌下或口服施用。治疗性制剂可以处于液体溶液或混悬液的形式；对于口服施用，制剂可以处于片剂或胶囊剂的形式；对于鼻内制剂，处于粉末剂、滴鼻剂或气溶胶的形式；并且对于舌下制剂，处于滴剂、气溶胶或片剂形式。

本领域中熟知的用于制备制剂的方法存在于，例如，“Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy”(第21版),David Troy主编,2006,Lippincott Williams&Wilkins。用于肠胃外施用的制剂可以，例如，含有赋形剂、无菌水或盐水、聚亚烷基二醇，如聚乙二醇、植物来源的油剂或氢化萘。生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚环氧乙烷-聚氧化丙烯共聚物可以用于控制化合物的释放。其它潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-醋酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。用于吸入的制剂可以含有赋形剂，例如，乳糖，或者可以是含有(例如)聚环氧乙烷-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者可以是用于以滴鼻剂形式施用的油溶液，或者作为凝胶。

本发明的药物组合物可以处于允许将组合物施用于患者的任何形式。例如，所述组合物可以处于固体、液体或气体(气溶胶)的形式。配制本发明的药物组合物，从而一旦将所述组合物施用于患者，则允许其中所含的活性成分是生物可用的。将施用于患者的组合物可以采取一种或多种剂量单位的形式，其中，例如，片剂、胶囊剂或扁囊剂可以是单一剂量单位，并且处于气溶胶形式的化合物的容器可以容纳多个剂量单位。

在制备所述药物组合物中使用的材料应是药物纯的并且在所使用的量是无毒的。本发明的组合物可以包括对于特别期望的作用已知的一种或多种化合物(活性成分)。对于本领域那些技术人员将显而易见地，所述活性成分在药物组合物中的最优剂量将取决于多种因素。相关因素无限制地包括受试者(例如，人)的类型、所述活性成分的具体形式、施用方式和所使用的组合物。

通常，所述药物组合物包括与一种或多种载体混合的如本文所描述的本发明的制剂。所述载体可以是颗粒，从而所述组合物处于(例如)片剂或粉末形式。所述载体可以是液体，其中所述组合物是(例如)口服糖浆或可注射液体。另外，所述载体可以是气体，以提供在(例如)吸入施用中有用的气溶胶组合物。

当预期用于口服施用时，所述组合物优选地处于固体或液体形式，其中半固体、半液体、混悬液和凝胶形式包含在本文中认为是固体或液体的形式内。

作为用于口服施用的固体制剂，可以将所述组合物配制成粉末剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、口香糖、薄片剂、糖锭等形式。这种固体组合物通常将含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。另外，可以存在以下佐剂中的一种或多种：粘结剂，如糖浆、阿拉伯胶、山梨糖醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄芪胶或明胶及其混合物；赋形剂，如淀粉、乳糖或糊精、崩解剂，如海藻酸、海藻酸钠、羧甲基淀粉钠、玉米淀粉等；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotex；填充剂，如乳糖、甘露糖醇、淀粉、磷酸钙、山梨糖醇、甲基纤维素及其混合物；润滑剂，如硬脂酸镁、高分子聚合物，如聚乙二醇、高分子量脂肪酸，如硬脂酸、二氧化硅、润湿剂，如月桂基硫酸钠、助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精、调味剂，如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂和着色剂。当所述组合物处于胶囊剂的形式时，例如，胶囊，除上述类型的材料外，它可以含有液体载体，如聚乙二醇或脂油。

所述制剂可以处于液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、水或油乳液或混悬液，或甚至可以在使用前用水和/或其它液体媒介物复原的干粉。作为两种实例，所述液体可以用于口服施用或用于通过注射递送。当预期用于口服施用时，除本发明的化合物之外，优选的组合物含有甜味剂、增稠剂、防腐剂(例如，p-羟基苯甲酸烷基酯)、染料/着色剂和风味增强剂(香味素)中的一种或多种。在预期通过注射施用的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂(例如，p-羟基苯甲酸烷基酯)、润湿剂、分散剂、助悬剂(例如，山梨糖醇、葡萄糖或其它糖浆)、缓冲液、稳定剂和等张剂中的一种或多种。乳化剂可以选自卵磷脂或山梨糖醇单油酸酯。

无论它们是溶液、混悬液或其它类似形式，本发明的液体药物制剂可以包括以下佐剂中的一种或多种：无菌稀释剂，如注射用水、盐溶液，优选地生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、可以用作溶剂或混悬媒介物的固定油剂，如合成单甘油酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调整张度的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可以将胃肠外制剂封闭在玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是优选的佐剂。可注射用药物组合物优选地是无菌的。

所述药物制剂可以预期用于表面施用，在此情况下，所述载体可以适当地包括溶液、乳液、软膏剂、乳膏剂或凝胶基底。例如，所述基底可以包括以下中的一种或多种：石蜡油、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂，如水和醇，以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于表面施用的药物组合物中。如果预期用于透皮施用，则所述组合物可以包括透皮贴片或离子电渗装置。

所述制剂可以预期用于直肠施用，其处于(例如)将在直肠中融化并释放药物的栓剂形式。用于直肠施用的组合物可以含有作为适合的无刺激性赋形剂的油质基底。这些基底无限制地包括羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。低熔点蜡对于栓剂的制备是优选的，其中脂肪酸甘油酯和/或可可脂的混合物是适合的蜡。可以将所述蜡熔化，并且通过搅拌将氨基环己基醚化合物均匀分散其中。然后，将熔化的均匀混合物倾倒至适当尺寸的模具中，使其冷却并借此固化。

所述制剂可以包括改变固体或液体剂量单位的物理形式的多种材料。例如，所述组合物可以包括围绕所述活性成分形成涂层外壳的材料。形成涂层外壳的材料通常是惰性的，并且可以选自(例如)糖、虫胶和其它肠溶衣试剂。作为另外一种选择，所述活性成分可以包封在明胶胶囊剂或扁囊剂中。

所述药物制剂可以由气体剂量单位组成，例如，它可以处于气溶胶的形式。术语气溶胶用于表示从具有胶体性质的那些到由加压包装组成的系统的多种系统。可以通过液化或压缩气体或者通过分配活性成分的适合的泵系统递送。可以在单相、双相或三相系统中递送本发明的化合物的气溶胶以递送所述活性成分。气溶胶的递送包括必需的容器、触发器(activator)、阀门、子容器等，它们可以共同形成试剂盒。

一些生物学活性化合物可以处于游离碱的形式或者处于药学上可接受的盐的形式，如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、延胡索酸盐、甲烷磺酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐和本领域中已知的其它的盐。对于适合的使用模式(例如，口服或肠胃外施用途径)，将选择合适的盐来提高化合物的生物利用度或稳定性。

本发明还提供了含有药物制剂以及用于制剂使用的说明书的试剂盒。优选地，商品化包装将含有所述制剂的一个或多个单位剂量。光和/或空气敏感的制剂可能需要特殊的包装和/或制剂。例如，可以使用对光不透明，和/或密封以避免接触环境空气，和/或用适合的涂层或赋形剂配制的包装。

可以在存在载体或任何药物或生物学可用的载体的情况下，单独或与其它化合物(例如，小分子、核酸分子、肽或肽类似物)组合提供本发明的制剂。如本文所使用的“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散媒介物、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。所述载体可以适合于任何适合的施用形式。药学上可接受的载体通常包括无菌水溶液或分散系和无菌粉末。还可以将补充性活性化合物引入所述制剂中。

根据本发明的制剂的“有效量”包括治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是指以所必需的剂量和持续时间，对于实现所期望的治疗结果有效的量。制剂的治疗有效量可以根据以下因素改变，如疾病状态、个体的年龄、性别和体重以及化合物在个体中引起所期望的反应的能力。可以调节剂量方案以提供最优的治疗反应。治疗有效量还可以是其中治疗有益效果大于所述制剂或活性化合物的任何毒性或不利影响的量。“预防有效量”是指以所必需的剂量和持续时间，对于实现所期望的预防结果有效的量。通常，在疾病之前或在疾病早期，在受试者中使用预防剂量，从而预防有效量可以小于治疗有效量。对于任何特定受试者，可以根据个体需要和施用或监督所述组合物的施用的人的专业判断，随时间(例如，时间可以是每天、每隔一天、每周、每月)调整治疗时机和剂量。

对于抗生素治疗的有效量，尽管认为肠球菌的达托霉素敏感性拐点(breakpoint)为4mg/L，但是考虑到仅当MIC≤1mg/L时优化批准剂量，则对于这是否合适仍存在争论。例如，近期研究发现当MIC为4mg/L时，当施用6mg/kg的剂量时，在达托霉素-治疗的肠球菌败血症中获得目标药物动力学参数的概率仅达到1.5-5.5％(Avery,Lindsay M等人“Pharmacodynamic Analysis of Daptomycin-treated Enterococcal Bacteremia:It IsTime to Change the Breakpoint.”Clinical Infectious Diseases 68卷,10(2019):1650-1657)。

在治疗应用中，当所观察到的组合治疗效果大于单个活性成分的治疗效果之和或者产生了单独的活性成分不可以产生的新的治疗效果时，在活性成分之间发生了协同作用。因此，当制剂组分以协同有效量存在时，所述制剂获得了大于以相当剂量单独施用各个活性成分将实现的治疗效果的治疗效果。在这种背景中，治疗效果的增强可以采取提高的效力(efficacy)或效力(potency)和/或降低的不利影响的形式。可以完全或部分通过活性成分在受试者中的药物动力学和/或药效学来介导协同作用，从而所述制剂中成分的量和比例在体内可以是协同的。可以通过包含在体外效力测定中也是协同的量和比例的活性成分的制剂实现这种体内协同作用。因此，如本文所使用的，术语“协同有效量”是指体内和/或体外协同的量。通常将协同作用的数值定量表示为分级抑制浓度指数(FICI)，其表示所测试的每种药物的分级抑制浓度(FIC)之和，其中通过将组合使用时每种药物的最小抑制浓度(MIC，防止细菌在标准体外测定—基于刃天青的标准比色测定中明显生长的最低药物浓度)除以单独使用时每种药物的MIC确定每种药物的FIC。非常一般地，小于或大于1的FICI分别表示正相关活性(至少加和或增强)或不存在正相互作用。更确定地，可以将两种化合物的协同作用保守地定义为≤0.5的FICI(参见Odds,2003；其中加和性或增强对应于>0.5至≤0.75的FICI；无相互作用(无差别)对应于>1至≤4的FICI；并且拮抗作用对应于>>4的FICI)。已将3种化合物的协同作用定义为≤1.0的FICI。(Berenbaum,1978；Yu等人,1980)。为了估计三重组合中的最优浓度，将反式-石竹烯和大麻素的最优浓度与一系列达托霉素稀释液组合使用。

尽管本文公开了本发明的多种实施方式，但是根据本领域技术人员的一般常识，可以在本发明的范围内做出多种改进和修改。这些修改包括已知等价物对本发明的任何方面的替换，从而以基本相同的方式实现相同的结果。数值范围包括限定范围的数值。单词“包含”在本文中作为开放术语使用，其基本等价于术语“包括(但不限于)”并且单词“包含”具有相应含义。除非上下文明确规定，否则如本文所使用的，单数形式的“一个”和“所述”包括复数对象。因此，例如，对“一个事物”的提及包括不止一个该事物。

本文中对参考文献的引用不是对这些参考文献是本发明的现有技术的承认。在本说明书中引用的任何在先文档和所有专利公开，包括(但不限于)专利和专利申请作为参考并入本文。在本文引用的文档中引用或参考的所有文档以及在本文中或在作为参考并入本文的任何文档中提及的任何产品的任何生产商的说明书、描述、产品说明书和产品页一起借此作为参考并入本文并且可以用于本发明的实践。更具体地，所有参考的文档以每个单个的出版物具体且单独表明作为参考并入本文且在本文中完全说明的相同程度作为参考并入。本发明包括基本如上文所描述并且参考实施例和附图的所有实施方式和变化。在一些实施方式中，本发明不包括涉及医学或手术治疗的步骤。

实施例

实施例1：

如本实施例中所示，非精神治疗性大麻素大麻二醇、大麻萜酚和大麻环萜酚(即CBD、CBG和CBC)对屎肠球菌(E.faecium)和粪肠球菌(E.faecalis)，包括对万古霉素敏感或耐受，并且在一些情况下，对达托霉素也耐受的株具有抑菌(表1、2)和杀菌(图1)活性。以相等浓度的CBD、CBG或CBC，用CBG和CBC杀死屎肠球菌(E.faecium)的动力学比CBD更快(图1)。还表明大麻素还可以将达托霉素(MIC)的活性提高8-128倍(表3)。另外，我们证实每种大麻素对革兰氏阳性(而不是革兰氏阴性)细菌具有种特异性活性(表1)。

如本实施例中进一步显示的，非精神治疗性大麻素大麻二醇、大麻萜酚和大麻环萜酚(即CBD、CBG和CBC)、反式-石竹烯和达托霉素协同作用。大麻素(CBC、CBD、CBG)、反式石竹烯和达托霉素的所有配对以及三重组合之间的相互作用测定如表4所示。所有成对组合显示出协同(FICI≤0.5)或加强(FICI≥0.5，≤0.75)的相互作用。然而，尽管α-律草烯(β-石竹烯，数据未显示)和反式石竹烯与CBC、CBD或CBG具有协同活性(表4)，但是单独或组合的其它萜烯(α-蒎烯和R-(+)柠檬烯)不具有可检测的活性(MIC>32mg/L；数据未显示)。所有三重组合是协同的(FICI<1.0)。在这些条件下，达托霉素的MIC降低了256-倍(在存在CBD和反式石竹烯的情况下，从8降低至0.03μg/ml；表5)或者>512倍(在存在CBC和反式石竹烯的情况下，从>16降低至0.03，表7D)。

如表6和7中所示，对耐药性(达托霉素和万古霉素)株VRE 55A6的双重和三重组合的分析显示达托霉素/萜烯/大麻素的组合对该株更有效(与万古霉素/达托霉素敏感性株33D3相比)，其将达托霉素的MIC提高了>500倍(有效抑制达托霉素耐受性表型)。

如下所示获得了本实施例中所提供的数据。

除分枝杆菌属(Mycobacterium)的种以外，对所有细菌的MIC确定：

将在它们相应的液体培养基(如以下定义的)中生长的细菌的预培养物稀释至OD600为0.0025，并且将100μl加入至96-孔板中含有大麻素的连续2-倍稀释(在生长培养基中稀释大麻素储液，对于酸性形式，在甲醇或乙腈中)的100μl培养基中。然后，将板在37℃培育20-24h，并将生长在Thermo Scientific^TM Varioskan^TM Flash Multimode酶标仪中记录为OD600。

脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)ATCC 19977的MIC确定：

将在具有0.05％泰洛沙泊的MHII培养基中生长的预培养物在MHII培养基中稀释至OD600为0.005，并且将100μl加入至96-孔板中含有大麻素的连续2-倍稀释(在生长培养基中稀释大麻素储液，对于酸性形式在甲醇或乙腈中)的100μl MHII培养基中。然后，将板培育48h，接着添加30μl比色试剂刃天青水溶液(10mg/100ml)。将板培育另外24h，并且将生长记录为培养物颜色从蓝色向粉红色的转换。

结核分支杆菌(mycobacterium tuberculosis)H37Rv的MIC确定：

将在7H9培养基加0.05％泰洛沙泊中生长的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的预培养物生长至中对数期并用无泰洛沙泊的相同培养基稀释至OD600为0.0025。使用50μL稀释的培养物在含有具有大麻素的连续2-倍稀释(在生长培养基中稀释大麻素在甲醇或乙腈中的储液)的50μL相同培养基的96-孔板中的孔中接种。将板在37℃，5％CO2下培育5天，随后向每个孔中添加10μL PrestoBlue细胞存活力试剂。将板在37℃，5％CO2下培育另外24h，然后在Synergy HT酶标仪上读取荧光(激发530nm，发射590nm)。

用于多种生物的生长培养基：

屎肠球菌(Enterococcus faecium)：所有株(临床分离株33D3、69C6、58C9和 55A6)，MHII(Mueller Hinton II)

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)：MHII(Mueller Hinton II)

酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)ATCC 51878：BHI(脑心浸液*)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MRSA USA 300：LB(Luria-Bertani)

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC 14990：NB(营养肉汤)

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC 12228：NB(营养肉汤)

脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)ATCC 19977：MHII(Mueller HintonII)

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv：7H9

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv：PB(Proskauer and Beck+葡萄糖和丙酮酸钠)

鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii)ATCC 19606：NB(营养肉汤)

大肠杆菌(Escherichia coli)HB101：LB(Luria-Bertani)

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 27853：胰酶大豆肉汤

*酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)ATCC 51878在37℃，在三气体培育箱(tri-gas incubator)中生长。

图1的方法。

将预培养物在补充有适合浓度的大麻素的3ml MHII培养基中稀释至OD600为0.0025。在不同时间点，从每个管中除去100μl培养物并将连续10-倍稀释液点样到MHII琼脂平板上(10μl)，将其在37℃培育24h并对集落计数(CFU)。

表1-3的方法。如以上所描述的实施MIC的确定。

表4-7的方法。大麻素CBC、CBD和CBG与萜烯和达托霉素的相互作用：

使用MIC测定，在96孔棋盘形式中确定单独和组合的大麻素(化合物A)、萜烯(化合物B)和达托霉素(化合物C)的FICI值。在DMSO中制备萜烯储液并在生长培养基中稀释。如下计算每种化合物的分级抑制浓度：FIC_A＝(在存在化合物B的情况下的化合物A的MIC)/(单独的化合物A的MIC)。类似地，计算化合物B和C的FIC。将FICI计算为FIC_A加FIC_B加FIC_C。

表1：大麻素对不同的革兰氏阳性细菌，而不对革兰氏阴性细菌(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 27853、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii)ATCC19606、大肠杆菌(E.coli)HB101，数据未显示)具有活性。敏感性表示为MIC(mg/L)。

表2：大麻素对临床肠球菌株(万古霉素敏感性、万古霉素耐受性以及万古霉素和达托霉素两者耐受性)的活性，表示为MIC(mg/L)。

^*万古霉素耐受性

^#达托霉素耐受性(MIC大于4mg/L)

表3：大麻素增强达托霉素对屎肠球菌(E.faecium)的临床分离株的活性。

^*表示所述株是万古霉素耐受性的。

^#达托霉素耐受性株(MIC大于4mg/L)。

表4：大麻素(CBC、CBD或CBG)、反式-石竹烯和达托霉素的成对和三重组合抑制屎肠球菌(E.faecium)33D3生长的协同和增强相互作用。

A.CBC、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

4B.CBD、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

4C.CBG、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

4D.大麻素(CBC、CBD或CBG)、反式-石竹烯和达托霉素的三重组合的相互作用

*对于三重组合，FICI<1.0表示协同

表5：成对和三重组合中各个大麻素(CBC、CBD、CBG)、反式-石竹烯和达托霉素对屎肠球菌(E.faecium)33D3的活性的最大提高倍数。

5A.CBC、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

5B.CBD、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

5C.CBG、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

5D.大麻素(CBC、CBD或CBG)、反式-石竹烯和达托霉素的三重组合的相互作用

表6：大麻素(CBC、CBD或CBG)、反式-石竹烯和达托霉素抑制屎肠球菌(E.faecium)VRE 55A6生长的协同和增强成对或三重相互作用。

6A.CBC、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

6B.CBD、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

6C.CBG、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

6D.大麻素(CBC、CBD或CBG)、反式-石竹烯和达托霉素的三重组合的相互作用

^*对于三重组合，FICI<1.0表示协同

表7：成对或三重组合中各个大麻素(CBC、CBD、CBG)、反式-石竹烯或者达托霉素对屎肠球菌(E.faecium)VRE 55A6的活性的最大提高倍数。

7A.CBC、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

7B.CBD、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

7C.CBG、反式-石竹烯和达托霉素的成对相互作用

7D.大麻素(CBC、CBD或CBG)、反式-石竹烯和达托霉素的三重组合的相互作用

以上数据显示出与某些大麻素-达托霉素组合的特别重要的相互作用，其证实了协同作用：例如，表6A，对于CBC+达托霉素，FICI＝0.5；表6B，对于CBD+达托霉素，FICI＝0.5。除了产生协同作用的各个相对量外，该数据显示其它相对量对屎肠球菌(E.faecium)产生了意外且未预期到的显著生长抑制：例如，表5A显示达托霉素的MIC降低128-倍(MIC从4降低至0.03125mg/L)。当CBC以其1/2MIC存在时，发生了这种作用(即CBC MIC从1降低至0.5mg/L；数据未显示)。通过处于增强比，0.5：0.03125的相对量＝16：1的CBC：达托霉素的每种同伴发生了这种相互作用。

实施例2：大麻素对达托霉素的敏化。

如图2所示，大麻素使抗生素耐受性肠球菌株对达托霉素敏感。图2反映了显示达托霉素(Dap)以及与CBD、CBG或CBC组合的Dap对达托霉素耐受性屎肠球菌(E.faecium)VRE株58C9和55A6的影响的数据。屎肠球菌(E.faecium)株55A6耐受达托霉素，其中达托霉素MIC＝8mg/L。将屎肠球菌(E.faecium)株58C9和55A6与无大麻素(A、B)或者1/2×(0.5mg/L)MIC的CBD(C、D)、CBG(E、F)或CBC(G、H)以及1×(对于58C9，4mg/L；对于55A6，8mg/L)、1/2×(对于58C9，2mg/L；对于55A6，4mg/L)、1/4×(对于58C9，1mg/L；对于55A6，2mg/L)或者1/8×(对于58C9，0.5mg/L；对于55A6，1mg/L)MIC的达托霉素一起培育。在2、4、6、8和24h除去等份以用于CFU计数。数据点是来自3次重复的平均值，其中作为误差线表示标准偏差。如所示的，添加约1/2MIC的每种大麻素帮助以1/4-1/8×MIC的达托霉素，通过达托霉素的杀死。

为了进一步显示CBD、CBG和CBC与达托霉素的杀菌增强活性，使用屎肠球菌(E.faecium)株33D3(达托霉素敏感性，MIC＝1)产生了杀死曲线，如图3所示。将该数据有用地与图2中对于屎肠球菌(E.faecium)株58C9(达托霉素中等耐受性，MIC＝4)和55A6(达托霉素耐受性，MIC＝8)的数据相比较。如所示的，将株分别与1/8×至1×MIC达托霉素(对于33D3，0.25-1mg/L达托霉素，对于58C9 0.5-4mg/L达托霉素并且对于55A6，1-8mg/L达托霉素)以及与0.5×MIC的CBD、CBG或CBC一起培育。以1/2×MIC，通过大麻素或达托霉素在所有株中无有效生长抑制。值得注意地，尽管达托霉素的确在1×MIC抑制生长，但是CFU无减少。然而，与1×-1/8×MIC的达托霉素组合的1/2×MIC的CBD、CBG或CBC显著抑制所有株的生长并且减少CFU，借此证实了杀菌活性(图2和3)。这具有特别重要的临床相关性，因为通常不使用达托霉素治疗被分类为达托霉素耐受性(MIC>4mg/L)的株感染的患者。株58C9和55A6分别是达托霉素中等耐受性和耐受性的，但是在存在1/2×MIC的CBD、CBG或CBC的情况下，少至1mg/L的达托霉素(1/8×MIC)可以在24h显著减少CFU(图2)。

本实施例进一步显示广泛的相对大麻素-达托霉素的量可以提供意外且未预期到的结果，如通过图2和3中的杀死曲线所证实的。例如，在下列相对大麻素-达托霉素的量观察到了意外且临床有意义的作用：对于CBC:达托霉素1:1-4(图3，33D3株)、1:1-8(图2；58C9株)和1:4-16(图2，55A6株)；对于CBG:达托霉素2:1和1:1-4(图3，33D3株)、1:1-8(图2；58C9株)和1:2-16(图2；55A6株)；以及对于CBD:达托霉素2:1和1:1-4(图3，33D3株)、1:1-8(图2；58C9)和1:2-16(图2；55A6株)。

实施例3：CBD和CBG生物膜抑制

本实施例显示CBD和CBG对于抑制屎肠球菌(E.faecium)生物膜生长是意外有效的。通过将屎肠球菌(E.faecium)株33D3的生物膜在无大麻素的情况下生长48h，然后用大麻素处理所述生物膜72h产生了图4中的数据。通过结晶紫染色定量生物膜块。通过刮下生物膜，然后计数活细菌来定量生物膜中的活细菌。如所示的，CBD和CBG显示出对屎肠球菌(E.faecium)的株33D3的意外抗生活性程度。值得注意地，CBC对浮游肠球菌是杀菌的。

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