具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。

在本发明中，首先发现一些化合物在治疗例如老年性黄斑部病变(AMD)、糖尿病性视网膜病变(DR)，或黄斑部水肿(ME)等眼疾中具有显著效果。

本发明提供一种治疗眼疾的方法，该方法包含对一有此需求的个体施用一包含一治疗有效量的白僵菌素的组合物，该白僵菌素系由三个L-N-甲基苯基苯胺与三个D-2-羟基异戊酸偶联而成的环六肽，并具有以下结构式：

根据常规技术或方法，可以从真菌例如大蝉花(Cordyceps cicadae)、蝉蕈(Cordyceps sobolifera)、冬虫夏草(Cordyceps cicaicola)，以及玫烟色棒束孢(Isariafumosorosea)合成或分离本发明的化合物，例如白僵菌素。

于本发明中，该化合物被证实通过抑制VEGF诱导的血管生成而有效治疗眼疾。

于一具体实施例中，该眼疾系由新生血管形成的眼睛退化造成的。该眼疾的一些实例包括老年性黄斑部病变(AMD)、糖尿病性视网膜病变(DR)，以及黄斑部水肿(ME)。于本发明的较佳实施例中，该眼疾为非增生性糖尿病性视网膜病变(NPDR)或湿性老年性黄斑部病变(湿性AMD)。

如本文所用，“治疗有效量”一词系指一化合物或药剂的量，相较于未接受该量的相应个体，其导致一疾病、病症，或副作用的治疗、治愈、预防，或改善的效果，或一疾病或病症的进展速度的降低。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。

为了用于治疗，将该治疗有效量的化合物配制成用于施用的医药组合物。因此，本发明进一步提供一种医药组合物，包含一治疗有效量的化合物白僵菌素以及一种或多种医药上可接受的载体。

本文所用的“医药上可接受的载体”一词系指在与制剂的其他成分兼容且对与医药组合物一起施用的个体无害的意义上，可接受的载体、稀释剂或赋形剂。根据药物制剂的要求，本领域中通常已知或使用的任何载体、稀释剂或赋形剂均可用于本发明。

根据本发明，该医药组合物可适于通过任何适当的途径施用，包括但不限于口服、直肠、鼻、局部、阴道，或肠胃外途径。在本发明的一特定实施例中，将该医药组合物配制成用于口服给药。这样的制剂可通过药学领域中已知的任何方法来制备。

通过以下实施例进一步说明本发明，提供这些实施例系为了说明而非限制。

实施例

实施例1

体内基质胶栓塞血管生成测试

基质胶栓塞由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞(由Corning LifeSciences公司与BD Biosciences公司生产及销售)分泌的凝胶状蛋白混合物制成。基质胶类似于在许多组织中发现的复杂细胞外环境，并且被细胞生物学家用来作为培养测试的基质(基底膜基质)。

试验动物为5至8周龄的B57l/6小鼠。将基质胶与PBS以4∶1的比例混合以获得基质胶栓塞。对小鼠施用含有30IU肝素以及VEGF150ng/ml(500ul/小鼠)的基质胶栓塞，然后分成四组(每组四只小鼠)，以白僵菌素进行腹腔注射或口服(GYT-088组)，以索拉非尼(索拉非尼组)作为阳性对照，单独使用VEGF(载剂组)，以及未接受任何治疗(对照组)。一天后，对动物以腹腔注射30mg/kg剂量的索拉非尼，或腹腔注射2.4mg/kg剂量的白僵菌素(0.1c.c./小鼠/天)，或口服施用24mg/kg剂量的白僵菌素，每天一次，持续6天。在第7天，牺牲动物并取出基质胶栓塞以观察血管生成。并以Drabkin氏试剂套组测量每只小鼠的血红素。

结果如图1及图2中所提供的。如图1所示，在腹腔注射白僵菌素的组别(GYT-088组)或以索拉非尼(索拉非尼组)作为阳性对照的组别，VEGF诱导的血管生成被抑制。如图2所示，显示所测得的血红素含量，白僵菌素在抑制VEGF诱导的血管生成方面提供了较高的功效。

总结，白僵菌素提供抑制血管生成的功效，甚至优于索拉非尼。

实施例2

评估不同剂量的白僵菌素对改善恒河猕猴天然发生的糖尿病性黄斑部水肿60天的疗效，为临床试验剂量设计与安全性研究提供基础。

于评估中使用恒河猕猴(Rhesus Macaque)。

主要终点：

以OCT测量视网膜厚度以量化治疗前后的视网膜厚度。

视网膜厚度通过两种方法使用光学干涉断层扫描(Optical coherencetomography，OCT)进行评估：(1)在中央凹处，以及在中央凹的任一侧1.5mm(三点法)，以及(2)使用52点栅格决定不同厚度分组(250-300、301-350、351-400μm等)中黄斑部的厚度。这种方法是由Primed团队与Case Western Reserve University著名的糖尿病性视网膜病变专家Timothy Kern博士合作开发的。请参阅ARVO 2018海报：自发性糖尿病恒河猕猴的黄斑部增厚评估(Assessment of macular thickening in spontaneously diabetic rhesusmonkeys)。

次要终点与安全参数：

(1)眼底摄影(Fundus photography，FP)。检测治疗前后的出血、渗出液或血管病变的变化；以及

(2)药物对新陈代谢、脂肪轮廓、肝肾功能的影响。

非人类灵长类动物(Non-human primates，NHP)在生理功能及眼睛结构方面与人类极为相似。PriMed具有独特大量的具有自发性代谢疾病，具有5年的历史临床/代谢数据的非人类灵长类动物(NHP)群体(n＝约1500)，包括空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、胰岛素抗性、身体质量指数(body mass index，BMI)、三酸甘油酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoproteincholesterol，LDL-c)，以及高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoproteincholesterol，HDL-c)。彩色多普勒超音波、Kowa眼底照相机、海德堡光学干涉断层扫描(Heidelberg OCT)、裂隙灯，以及检眼镜被用于诊断非人类灵长类动物(NHP)的糖尿病状态，显示恒河猕猴的自发性糖尿病性黄斑部水肿(diabetic macular edema，DME)的疾病特征与临床患者非常相似，表现出血管渗漏、视网膜增厚、渗出，或出血。患有自发性糖尿病性黄斑部水肿(DME)的恒河猕猴为人类糖尿病性黄斑部水肿(DME)/糖尿病性视网膜病变(DR)研究与新药开发提供了理想的模型。

入选标准

(1)雌性，年龄13-18岁(相当于40-60岁的人类成人)，体重6-7公斤；

(2)糖尿病病程：3年以上；

(3)单眼/双眼患有糖尿病性黄斑部水肿(DME)；

(4)糖尿病性黄斑部水肿(DME)：最近半年由海德堡频域式光学干涉断层扫描(Heidelberg Spectralis OCT)测量并通过眼底摄影(FP)/荧光素眼底血管造影(Fluorescein Fundus Angiography，FFA)以Kowa VX-20眼底照相机诊断的视网膜厚度；

(5)中央凹厚度(Central Foveal Thickness，CRT)≥260μm及/或早期糖尿病性视网膜病变治疗研究(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study，ETDRS)区域的平均厚度≥319μm。(视网膜增厚由正常猕猴的CRT平均值及标准偏差(standard deviations，SD)与ETDRS厚度所定义)。视网膜增厚定义为厚度超出正常平均值2个标准偏差。非糖尿病弥猴：非糖尿病动物视网膜的中央凹平均厚度为192±11μm，在距离颞侧与鼻侧中央凹1.5mm处测得的分别为307±15与328±13。这种方法是由Primed团队与Case WesternReserve University著名的糖尿病性视网膜病专家Timothy Kern博士合作开发的。请参阅ARVO 2018海报：自发性糖尿病恒河猕猴的黄斑部增厚评估；以及

(6)有/无血管渗漏或非灌注区域。

排除标准

(1)第三期及以上高血压；

(2)进行性眼或全身发炎或感染；眼内高压：眼压(Intraocular pressure，IOP)>21mmHg；

(3)实验室检查显示肾脏或肝脏功能明显受损；

(4)任何其他可能影响疗效的病史。

群组大小

将提供6只自发性糖尿病性黄斑部水肿(DME)恒河猕猴(一年内有病历)，且在研究前期(4周)在治疗前将该6只猴子中的4只进行眼底血管造影(FA)、眼底摄影(FP)、光学干涉断层扫描(OCT)，以及裂隙灯检查，并进行血液生化检查。光学干涉断层扫描(OCT)会根据视网膜厚度将这4只猴子分为两组：

(1)第一组，载剂组，N＝1；

(2)第2组，试验组，N＝3；

(给药途径：口服，每天一次；剂量：总基础剂量(total basal dose，TBD))。

结果测量：

主要功效参数：

视网膜厚度包括中心视网膜厚度(central subfield thickness，CST)以及ETDRS厚度。给药前与给药后第14天(D14)、第30天(D30)，以及第60天(D60)各一次；根据D14与D30的结果确定是否在第45天(D45)增加检测。

次要功效参数与安全性参数：

(1)眼底照相：以给药前为基线，给药后第30天(D30)、第60天(D60)各一次，共3次；

(2)荧光素眼底血管造影(FFA)：以给药前一次为基线；

(3)眼压与血压测量：给药前与给药后各一次，共2次；

(4)通过每日笼侧观察评估眼睛的临床征状；

(5)代谢参数、肝肾功能的测定：FPG、FRA、LDL、HDL、TC、TG：给药前与给药后第14天(D14)、第30天(D30)、第45天(D45)，以及第60天(D60)各一次；

(6)裂隙灯：给药前1次，给药后1次，共2次；

(7)体重：给药前与给药后第30天(D30)、第60天(D60)各一次；

(8)食物摄取/临床观察：包括异常征状、症状，以及行为，每天一次。

眼底摄影(FP)与荧光素眼底血管造影(FFA)

(1)频率：给药前进行荧光素眼底血管造影(FFA)一次。

(2)仪器：KOWA VX-20。

(3)目的：检查视网膜血管的损伤及渗漏。

(4)FFA影像采集程序：

在获取影像之前，通过肌内注射氯胺酮：甲苯噻嗪混合物(1:1，8mg/kg氯胺酮)麻醉动物。麻醉后，向每只眼睛施用2滴托品酰胺(Tropicamide)苯肾上腺素滴眼液，以扩大瞳孔。麻醉后，将动物放在黑暗的房间里，直到瞳孔直径大于6毫米。将自保留眼睑光谱置于眼睛中。摄影主眼的眼底后极聚焦良好。

(5)当通过股静脉以0.075mL/kg的剂量注射10％荧光素钠(Alcon Laboratories公司，美国)时开始计时。在最初的30秒中每秒对主眼拍摄一系列后极照片，在接下来的30秒中每2-3秒拍摄一次。在5分钟与10-15分钟为两只眼睛拍照。

结果

载剂组：#6189在给药前显示轻度非增生性糖尿病性视网膜病变(NPDR)。如表1所示，以眼底摄影(FP)分析给药前后没有发现明显变化。GYT-088组：#251，#2003，以及#3536显示出轻度或中度非增生性糖尿病性视网膜病变(NPDR)。以眼底摄影(FP)分析给药后第28天(D28)改善了#2003中非增生性糖尿病性视网膜病变(NPDR)的特性。以眼底摄影(FP)分析在任何时间点给其他动物给药前后均未见明显变化，请参阅表1。

表1治疗后非增生性糖尿病性视网膜病变(NPDR)相关变化

结果提供于图4中。在给药后第14天，在#2003实验动物(NPDR组)中发现，中央黄斑部厚度(central macular thickness，CMT)从左眼与右眼的204μm与210μm变为197μm与202μm，分别减小了7μm与8μm；中央凹的厚度从左眼与右眼的257μm与260μm变为249μm与251μm，分别减小了8μm与9μm。另一方面，发现在施用载剂的动物#6189(载剂组)中，与正常动物中正常发现的一样，中央黄斑部厚度或中央凹厚度的变化在±2μm的范围内。在给药后第56天，中央黄斑部厚度减少了6μm与8μm，左眼与右眼黄斑部厚度分别减少了3μm与5μm。因此，可以得出结论，GYT-088在糖尿病性黄斑部水肿中提供了功效。

表2糖尿病性黄斑部水肿(DME)厚度的变化

尽管本说明书包含许多细节，但这些细节不应被解释为对本发明范围或可要求保护的范围的限制，而应理解为对本发明的特定具体实施例或示例特定的特征的描述。在本说明书中在单独的具体实施例或示例的上下文中描述的某些特征亦可在单个具体实施例中组合实现。