具体实施方式

尽管下面详细描述了本公开，但是应当理解，本公开不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制本公开的范围，本公开的范围仅由所附权利要求限定。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

优选地，本文使用的术语定义为“生物技术术语的多语言词汇表：(IUPAC建议)”，H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,and H.Eds.,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)所描述的那些。

除非另有说明，本公开的实施采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，其在本领域的文献中有解释(参见，例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。

在下文中，将描述本公开的元素。这些元素与特定实施方案一起列出，然而应当理解，它们可以以任何方式和以任何数量组合以产生额外的实施方案。各种描述的实例和实施方案不应解释为将本公开仅限于明确描述的实施方案。本公开的描述应当被理解为公开并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的公开元素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则所有描述的元素的任何排列和组合都视为由本说明书所公开。

术语“约”指大约或几乎，并且本文中在一实施方案中阐述的数值或范围的上下文中指所引或声称的数值或范围的±20％、±10％、±5％或±3％。

除非本文另有说明，或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个”、“一种”和“该”以及类似的指代解释为涵盖单数和复数。本文对数值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值都并入说明书中，就如同它在本文中单独引用。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本公开而不对权利要求的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为表示对本公开的实施至关重要的任何未要求保护的元素。

除非另有明确说明，否则在本文的上下文中使用的术语“包含”表示除了“包含”所介绍的列表成员之外，还可以任选地存在其他成员。然而，预期作为本公开的具体实施方案，术语“包含”涵盖不存在其他成员的可能性，即，为了该实施方案的目的，“包含”应理解为可以具有以下含义：“由...组成”。

在本说明书的全文中引用了若干文件。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明等)，无论是上文还是下文，均援引加入本文。本文中的任何内容均不应解释为承认本公开并不早于此类公开。

在下文中，将提供适用于本公开的所有方面的定义。除非另有说明，以下术语具有以下含义。任何未定义的术语都有本领域公认的含义。

根据本公开，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且指包含约2个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且达约50个、约100个或约150个通过肽键彼此连接的连续氨基酸的物质。术语“蛋白”或“多肽”指大的肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但术语“肽”、“蛋白”和“多肽”在本文中通常用作同义词。

当以治疗有效量提供给受试者时，“治疗性蛋白”对受试者的疾病状况或疾病状态具有积极或有利的影响。在一实施方案中，治疗性蛋白具有治愈性或姑息性性质，并且可以给药以改善、缓解、减轻、逆转、延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或减轻其严重性。治疗性蛋白可具有预防特性，并可用于延迟疾病的发作或减轻此类疾病或病理状况的严重性。术语“治疗性蛋白”包括完整的蛋白或肽，也可以指其治疗活性片段。它还可以包括蛋白的治疗活性变体。治疗活性蛋白的实例包括但不限于细胞因子。

关于氨基酸序列(肽或蛋白)的“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即代表在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。在C端缩短的片段(N端片段)是可获得的，例如，通过翻译缺少开放阅读框的3'端的截短的开放阅读框。在N端缩短的片段(C端片段)是可获得的，例如，通过翻译缺少开放阅读框的5'端的截短的开放阅读框，只要截短的开放阅读框包含用于启动翻译的起始密码子。氨基酸序列的片段包含例如，来自氨基酸序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。

出于本公开的目的，氨基酸序列(肽或蛋白)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。术语“变体”特别包括氨基酸序列的片段。

氨基酸插入变体包含在特定氨基酸序列中插入单个或者两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或多个氨基酸残基被插入到氨基酸序列中的特定位点，尽管随机插入并适当筛选所得产物也是可能的。氨基酸添加变体包含一个或多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸的氨基端和/或羧基端融合。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或多个氨基酸，例如去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白质的任何位置。包含蛋白N端和/或C端缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。氨基酸取代变体的特征在于序列中的至少一个残基被移除，并且另一个残基被插入到其位置。优选在同源蛋白或肽之间不保守的氨基酸序列位置的修饰和/或用具有相似性质的其他氨基酸替换氨基酸。优选地，肽和蛋白变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即类似带电或不带电氨基酸的取代。保守的氨基酸变化涉及在其侧链中相关的氨基酸家族中之一的取代。天然存在的氨基酸一般分为四个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香族氨基酸。

优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性程度，优选相同性程度为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地，对于参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出相似性或相同性程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选对于至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸，优选连续氨基酸给出相似性或相同性程度。在优选的实施方案中，对于参考氨基酸序列的全长给出相似性或相同性程度。用于确定序列相似性、优选序列相同性的比对可以用本领域已知的工具完成，优选使用最佳序列比对，例如，使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5。

“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列相同性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。

术语“百分比相同性”旨在表示在最佳比对后获得的待比较的两个序列之间相同的氨基酸残基的百分比，该百分比纯粹是统计的，并且两个序列之间的差异随机分布在其全长上。两个氨基酸序列之间的序列比较通常通过在将它们最佳比对之后比较这些序列来进行，所述比较通过区段或“比较窗”进行以鉴定和比较序列相似性的局部区域。除了手动之外，用于比较的序列的最佳比对可以通过以下产生：通过Smith and Waterman,1981,AdsApp.Math.2,482的局部同源性算法；通过Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源算法；通过Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85,2444的相似性检索方法；或通过使用这些算法的计算机程序(Wisconsin Genetics软件包(Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)。

通过确定被比较的两个序列之间相同位置的数目，将该数目除以比较的位置数目并将所得结果乘以100，从而获得这两个序列之间的百分比相同性来计算百分比相同性。

根据本公开，同源氨基酸序列表现出至少40％，特别是至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，优选至少95％，至少98或至少99％的氨基酸残基相同性。

本领域技术人员可以容易地制备本文所述的氨基酸序列变体，例如，通过重组DNA操作。例如，Sambrook et al.(1989)详细描述了用于制备具有取代、添加、插入或缺失的肽或蛋白的DNA序列的操作。此外，本文所述的肽和氨基酸变体可以借助于已知肽合成技术容易地制备，例如通过固相合成和类似方法。

在一实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白)的片段或变体优选为“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”指表现出一种或多种功能特性的任何片段或变体，所述功能特性与其来源的氨基酸序列的那些特性相同或相似，即，其在功能上是等同的。关于细胞因子，一个特定的功能是由片段或变体来源的氨基酸序列显示的一种或多种免疫调节活性和/或与片段或变体来源的氨基酸序列的受体结合。

氨基酸序列(肽或蛋白)“源自”指定氨基酸序列(肽或蛋白)是指第一个氨基酸序列的起源。优选地，源自特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本相同或同源的氨基酸序列。源自特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是那个特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员会理解，适用于本文的抗原和细胞因子(例如，IL2、IL7或IL21)可以进行改变，使得它们的序列不同于天然存在的序列或它们所源自的天然序列，同时保留了天然序列的期望活性。

T细胞

T细胞属于一组称为淋巴细胞的白细胞，在细胞介导的免疫中发挥核心作用。它们可以通过其细胞表面存在的称为T细胞受体(TCR)的特殊受体与其他淋巴细胞类型(如B细胞和自然杀伤细胞)区分。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了几个不同的T细胞亚群，每个具有不同的功能。

大多数T细胞具有T细胞受体(TCR)，其以若干蛋白的复合物存在。实际的T细胞受体包括两条独立的肽链，它们由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并且称为α-和β-TCR链。γδT细胞(gamma delta T细胞)代表T细胞的小亚群，其表面具有独特的T细胞受体(TCR)。然而，在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链构成。这组T细胞比αβT细胞更少(T细胞总数的2％)。

所有T细胞均来源于骨髓中的造血干细胞。源自造血干细胞的造血祖细胞位于胸腺，并通过细胞分裂扩增以产生大量未成熟胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，因此归类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着它们的发育，它们会变成双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+)，并且最后成熟为单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后从胸腺释放到外周组织。

术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和包括细胞溶解性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL、CD8+T细胞)。术语“抗原特异性T细胞”或类似术语指识别T细胞靶向的抗原的T细胞，特别是当呈递在抗原呈递细胞或患病细胞(例如癌细胞)的表面时，并优选发挥T细胞的效应子功能。如果细胞杀死表达抗原的靶细胞，则认为T细胞对抗原具有特异性。可以使用多种标准技术中的任何一种来评估T细胞特异性，例如，在铬释放测定或增殖测定中。或者，可以测量淋巴因子(如干扰素-γ)的合成。

T辅助细胞在免疫过程中协助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活，以及其他功能。这些细胞也称为CD4+T细胞，因为它们在其表面表达CD4蛋白。辅助性T细胞在抗原呈递细胞(APC)表面表达的MHC II类分子呈递肽抗原时激活。一旦激活，它们迅速分裂并分泌称为细胞因子的小蛋白，其调节或协助活性免疫应答。

细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还与移植排斥有关。这些细胞也称为CD8+T细胞，因为它们在其表面表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与MHC I类相关的抗原来识别它们的靶标，MHC I类几乎存在于身体的每个细胞表面。

T细胞介导的效应子功能包括在辅助性T细胞(CD4⁺T细胞)的情况下释放细胞因子和/或激活CD8⁺淋巴细胞(CTL)和/或B细胞，并且在CTL的情况下消除细胞，即特征在于抗原表达的细胞，例如，通过细胞凋亡或穿孔素介导的细胞溶解，细胞因子(如IFN-γ和TNF-α)的产生，以及表达抗原的靶细胞的特异性细胞溶解性杀伤。

根据本发明，术语“T细胞”还包括在合适的刺激下可以成熟为T细胞的细胞。

通常可以使用标准程序体外或离体制备T细胞。例如，可以使用市售的细胞分离系统从哺乳动物(例如患者)的骨髓、外周血或骨髓或外周血的部分中分离T细胞。或者，T细胞可源自相关或不相关的人、非人动物、细胞系或培养物。包含T细胞的样品可以是，例如外周血单个核细胞(PBMC)。

本发明所用的T细胞可表达内源性T细胞受体或者可以缺乏内源性T细胞受体的表达。

CAR

可以将核酸如(编码CAR的RNA)引入T细胞或其他具有裂解潜力的细胞，特别是淋巴样细胞。

根据本公开，如上所述，当存在于T细胞上时，CAR识别诸如抗原呈递细胞或患病细胞(例如癌细胞)表面上的抗原，使得T细胞被刺激、引发和/或扩增或者发挥效应子功能。

根据本发明，术语“嵌合抗原受体(CAR)”与术语“嵌合T细胞受体”和“人工T细胞受体”同义。

优选地，所述CAR在细胞表面表达。

根据本发明，术语“CAR”(或“嵌合抗原受体”)涉及包含单分子或分子复合物的人工受体，其识别，即结合，靶细胞如癌细胞(例如通过抗原结合结构域与靶细胞表面表达的抗原结合)上的靶结构(例如抗原)，并且可以赋予免疫效应细胞(例如在细胞表面表达所述CAR的T细胞)特异性。这样的细胞不一定需要处理和呈递抗原来识别靶细胞，而是可以优选特异性地识别靶细胞上存在的任何抗原。优选地，CAR对靶结构的识别导致表达所述CAR的免疫效应细胞的激活。CAR可以包含一个或多个蛋白单元，其包含一个或多个本文所述的结构域。术语“CAR”不包括T细胞受体。

根据本发明，CAR通常可以包含几个结构域。在本发明所有方面的一实施方案中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和T细胞信号传导结构域。

结合结构域识别并结合抗原。在一实施方案中，来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)用作结合结构域。也可以使用的抗原识别结构域包括T细胞受体(TCR)α和β单链等。事实上，以高亲和力结合给定靶标的几乎任何物质都可以用作抗原识别结构域。在本发明所有方面的一实施方案中，CAR包含抗原结合结构域。在一实施方案中，CAR的外结构域(exodomain)包含抗原结合结构域。在一实施方案中，抗原结合结构域包含针对抗原的抗体的单链可变片段(scFv)。在一实施方案中，抗原结合结构域包含对抗原(VH(抗原))具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区(VH)以及对抗原(VL(抗原))具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区(VL)。在一实施方案中，所述重链可变区(VH)和相应的轻链可变区(VL)通过肽接头连接，优选包含氨基酸序列(GGGGS)3的肽接头。

在本发明所有方面的一实施方案中，CAR包含跨膜结构域。在一实施方案中，跨膜结构域为跨膜的疏水α螺旋。在一实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域或其片段。

激活信号传导结构域(或T细胞信号传导结构域)用于在CAR与抗原结合后激活细胞毒性淋巴细胞。激活信号传导结构域的特性仅限于其能够在CAR结合抗原后诱导所选细胞毒性淋巴细胞的激活。合适的激活信号传导结构域包括T细胞CD3[ζ]链和Fc受体[γ]。本领域技术人员会理解，可以使用这些提到的激活信号传导结构域的序列变体而不会对本发明产生不利影响，其中所述变体具有与其建模的结构域相同或相似的活性。此类变体与其来源的结构域的氨基酸序列会具有至少约80％的序列相同性。

在一实施方案中，T细胞信号传导结构域位于细胞内。在一实施方案中，T细胞信号传导结构域包含CD3-ζ(zeta)，优选CD3-ζ的内结构域，任选地与CD28组合。

可以存在的另一结构域是共刺激结构域。共刺激结构域用于在CAR与靶向部分结合后增强细胞毒性淋巴细胞的增殖和存活。共刺激结构域的特性仅限于其能够通过CAR结合靶向部分后增强细胞增殖和存活。合适的共刺激结构域包括CD28、CD137(4-1BB)，肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员、CD134(OX40)，TNFR受体超家族成员、以及CD278(ICOS)，在活化的T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子。本领域技术人员会理解，可以使用这些提到的共刺激结构域的序列变体而不会不利地影响本发明，其中所述变体具有与其建模的结构域相同或相似的活性。此类变体与其来源的结构域的氨基酸序列会具有至少约80％的序列相同性。在本发明的一些实施方案中，CAR构建体包含两个共刺激结构域。虽然特定组合包括四个提到的结构域的所有可能变体，但具体实例包括CD28+CD137(4-1BB)和CD28+CD134(OX40)。

本发明的CAR可以以融合蛋白的形式一起包含上述结构域。这样的融合蛋白通常包含以N端至C端方向连接的结合结构域、一个或多个共刺激结构域和激活信号传导结构域。然而，本发明的CAR不限于这种排列并且其他排列也是可接受的，并且包括结合结构域、激活信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。应当理解，因为结合结构域必须能够自由结合抗原，所以融合蛋白中结合结构域的放置通常会实现该区域在细胞外部的展示。以同样的方式，因为共刺激和激活信号传导结构域用于诱导细胞毒性淋巴细胞的活性和增殖，所以融合蛋白通常会在细胞内部展示这两个结构域。CAR可以包括其他元件，例如确保融合蛋白正确输出到细胞表面的信号肽、确保融合蛋白维持为整合膜蛋白的跨膜结构域和铰链结构域(或间隔区)，其赋予结合结构域灵活性并允许与抗原的强结合。

在本发明所有方面的一实施方案中，CAR包含引导新生蛋白质进入内质网的信号肽。在一实施方案中，信号肽先于抗原结合域。

在本发明所有方面的一实施方案中，CAR包含将抗原结合结构域连接到跨膜结构域的间隔区。在一实施方案中，间隔区允许抗原结合结构域在不同方向上朝向以促进抗原识别。在一实施方案中，间隔区包含来自IgG1的铰链区。

在本发明所有方面的一实施方案中，CAR包括以下结构：

NH2-信号肽-抗原结合结构域-间隔区-跨膜结构域-T细胞信号传导结构域-COOH。

在本发明所有方面的一实施方案中，CAR优选对其靶向的抗原具有特异性，特别是当存在于细胞(例如患病细胞或抗原呈递细胞)的表面时。

在本发明所有方面的一实施方案中，CAR可以由T细胞，优选细胞毒性T细胞，表达和/或存在于其表面。在一实施方案中，T细胞对CAR靶向的抗原具有反应性。

与本发明的CAR系统结合使用的细胞优选为T细胞，特别是细胞毒性淋巴细胞，优选选自T细胞，特别是细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。激活后，这些细胞毒性淋巴细胞中的每一种触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞通过以下任一方式或两种方式触发靶细胞的破坏。首先，激活后，T细胞释放细胞毒素，例如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中形成孔，并且颗粒酶进入细胞并触发细胞质中的胱天蛋白酶级联反应，其诱导细胞凋亡(程序性细胞死亡)。其次，可以通过T细胞和靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导凋亡。尽管可以使用异源细胞或同种异体细胞，但细胞毒性淋巴细胞优选为自体细胞。

使用表达嵌合抗原受体的T细胞的过继性细胞转移疗法是一种很有前途的抗癌疗法，因为CAR修饰的T细胞可以设计为针对几乎任何肿瘤抗原。例如，患者的T细胞可以进行遗传工程化(遗传修饰)以表达特异性针对患者肿瘤细胞上抗原的CAR，然后输回患者中。

根据本发明，CAR可以替代T细胞受体的功能，并且特别是可以赋予细胞(如T细胞)的反应性例如细胞溶解活性。然而，与T细胞受体结合抗原肽-MHC复合物相比，CAR可以与抗原结合，尤其是在细胞表面表达时。

各种方法可用于将CAR构建体引入T细胞，包括基于非病毒的DNA转染、基于转座子的系统和基于病毒的系统。基于非病毒的DNA转染具有低插入诱变的风险。基于转座子的系统可以比不含整合元件的质粒更有效地整合转基因。基于病毒的系统包括使用γ-逆转录病毒和慢病毒载体。γ-逆转录病毒相对容易产生，有效且永久地转导T细胞，并且从整合原代人T细胞的角度初步证明是安全的。慢病毒载体也能有效且永久地转导T细胞，但制造成本更高。它们还可能比基于逆转录病毒的系统更安全。

在本发明所有方面的一实施方案中，所述方法进一步包括用编码CAR的核酸离体或体内转染T细胞或T细胞祖细胞，以提供遗传修饰以表达CAR的T细胞。

CAR T细胞可以在体内产生，因此使用靶向T细胞的纳米颗粒，几乎是瞬时的。例如，基于聚(β-氨基酯)的纳米颗粒可以与抗CD3e f(ab)片段偶联，以结合T细胞上的CD3。为此目的，抗CD3e f(ab)片段可以与聚谷氨酸(PGA)共价连接。PGA围绕包含核酸和过量聚(β-氨基酯)(PBAE)聚合物的颗粒核心，并通过电荷相互作用与其相连。与T细胞结合后，这些纳米颗粒被内吞。由于包含与PBAE聚合物共价连接的含有微管相关序列(MTAS)和核定位信号(NLS)的肽，它们的内容物，例如编码抗肿瘤抗原CAR的质粒DNA，可以会定向到T细胞核。包含CAR基因表达盒侧翼的转座子和编码高活性转座酶的单独质粒，可以允许将CAR载体有效整合到染色体中。允许在纳米颗粒输注后体内产生CAR T细胞的此类系统描述于Smith etal.(2017)Nat.Nanotechnol.12:813-820。

另一种可能是使用CRISPR/Cas9方法有意将CAR编码序列放置在特定基因座。例如，可以将现有的T细胞受体(TCR)敲除，而敲入CAR并将其置于内源性启动子的动态调节控制之下，否则会弱化TCR的表达；参见，例如Eyquem et al.(2017)Nature543:113-117。

在本发明所有方面的一实施方案中，遗传修饰以表达CAR的T细胞被编码CAR的核酸稳定或瞬时转染。因此，编码CAR的核酸整合或不整合到T细胞的基因组中。

在本发明所有方面的一实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞来自要治疗的受试者。在本发明所有方面的一实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞来自与要治疗的受试者不同的受试者。

在本发明所有方面的一实施方案中，T细胞对于要治疗的受试者可以是自体的、同种异体的或同基因的。T细胞可以体外进行遗传修饰，以表达靶向抗原的嵌合抗原受体(CAR)。

在本发明所有方面的一实施方案中，灭活遗传修饰以表达CAR的T细胞的内源性T细胞受体和/或内源性HLA的表达。

术语“自体的”用于描述源自相同受试者的任何物质。例如，“自体移植”指来自相同受试者的组织或器官的移植。这样的程序是有利的，因为它们克服了会导致排斥的免疫屏障。

术语“同种异体的”用于描述来自相同物种不同个体的任何物质。当一个或多个基因座上的基因不相同时，两个或多个个体称为彼此是同种异体的。

术语“同基因的”用于描述源自具有相同基因型的个体或组织的任何物质，即，相同近交品系的同卵双胞胎或动物，或其组织。

术语“异源的”用于描述由多个不同元件组成的物质。例如，将一个体的骨髓移植到不同个体构成异源移植。异源基因是来自受试者以外的来源的基因。

RNA

本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”旨在包括DNA和RNA，例如基因组DNA、cDNA、mRNA，重组产生的和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。RNA包括体外转录的RNA(IVT RNA)或合成RNA。根据本发明，多核苷酸优选为分离的。

核酸可以包含在载体中。本文使用的术语“载体”包括本领域技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体(如λ噬菌体)载体、病毒载体(如腺病毒或杆状病毒载体)，或者人工染色体载体(如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC))。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包括质粒以及病毒载体，并且通常含有在特定宿主生物体(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)中或在体外表达系统中表达可操作连接的编码序列所需的期望编码序列和适当的DNA序列。克隆载体通常用于工程化和扩增特定的期望DNA片段，并且可以缺乏表达期望DNA片段所需的功能性序列。

在本发明所有方面的一实施方案中，编码细胞因子或编码抗原或其变体的核酸在接受治疗的受试者的细胞中表达以提供细胞因子或抗原或其变体。在本发明所有方面的一实施方案中，核酸在哺乳动物细胞中瞬时表达。因此，在一实施方案中，核酸不整合到细胞的基因组中。在本发明所有方面的一实施方案中，核酸为RNA，优选体外转录的RNA。在本发明所有方面的一实施方案中，抗原或其变体在细胞表面表达。

在本发明所有方面的一实施方案中，编码抗原或其变体的核酸在哺乳动物细胞中表达，以提供由遗传修饰以表达CAR的T细胞所结合的抗原或其变体，所述结合导致遗传修饰以表达CAR的T细胞的刺激、引发和/或扩增。

根据本发明，术语“表达”以其最一般的含义使用，并且包括RNA和/或肽或蛋白的产生，例如通过转录和/或翻译。表达可以是短暂的或稳定的。根据本发明，术语表达还包括“非正常表达”或“异常表达”。

根据本发明，术语“核酸编码”指核酸，如果存在于合适的环境中，例如细胞内，则可以表达以产生其编码的蛋白或肽。

本文所述的核酸可以是重组和/或分离的分子。

如本文所用，“分离的分子”指基本上不含其他分子例如其他细胞材料的分子。

本发明上下文中的术语“重组”指“通过遗传工程制备”。优选地，“重组对象”例如本发明上下文中的重组细胞不是天然存在的。

本文所用的术语“天然存在”指物体可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从自然界的来源中分离并且未经人在实验室中有意修饰的肽或核酸是天然存在的。

术语“转染”指将核酸，特别是RNA，引入细胞。出于本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞或由此类细胞摄取核酸，其中所述细胞可以存在于受试者例如患者中。因此，根据本发明，用于转染本文所述核酸的细胞可以存在于体外或体内，例如细胞可以形成患者器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于某些转染应用，转染的遗传物质仅瞬时表达就是足够的。由于在转染过程中引入的核酸通常不会整合到核基因组中，因此外源核酸会通过有丝分裂而稀释或降解。允许核酸游离扩增的细胞大大降低稀释率。如果期望转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须进行稳定的转染。可以将RNA转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白。

在本发明所有方面的一实施方案中，编码细胞因子或编码抗原或其变体的核酸在递送载体(如颗粒)中配制。在一实施方案中，递送载体包含至少一种脂质。在一实施方案中，至少一种脂质包含至少一种阳离子脂质。在一实施方案中，脂质与核酸形成复合物和/或包裹核酸。在一实施方案中，脂质包含在包裹核酸的囊泡中。在本发明所有方面的一实施方案中，核酸配制在脂质体中。

在本公开中，术语“RNA”涉及包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选的实施方案中，RNA含有全部或大部分核糖核苷酸残基。如本文所用，“核糖核苷酸”指在β-D-呋喃核糖基的2'-位具有羟基的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同的修饰的RNA。这些改变可以指将非核苷酸材料添加到内部RNA核苷酸或添加到RNA的末端。本文还预期RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开，这些改变的RNA被认为是天然存在的RNA的类似物。

在本公开的某些实施方案中，RNA为与编码肽或蛋白的RNA转录物相关的信使RNA(mRNA)。如本领域所确立的，mRNA通常包含5'非翻译区(5'-UTR)、肽编码区和3'非翻译区(3'-UTR)。在一些实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成产生。在一实施方案中，mRNA使用DNA模板通过体外转录产生，其中DNA指含有脱氧核糖核苷酸的核酸。

在一实施方案中，RNA为体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过恰当的DNA模板的体外转录获得。控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的合适载体中来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。

在一实施方案中，RNA可以具有修饰的核糖核苷酸。修饰的核糖核苷酸的实例包括但不限于5-甲基胞苷、假尿苷和/或1-甲基-假尿苷。

在一些实施方案中，本公开的RNA包含5'-帽。在一实施方案中，本公开的RNA不具有未加帽的5'-三磷酸。在一实施方案中，RNA可以被5'-帽类似物修饰。术语“5'-帽”指在mRNA分子的5'端发现的结构，并且通常由通过5'至5'三磷酸键连接到mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。提供具有5'-帽或5'-帽类似物的RNA可以通过体外转录实现，其中5'-帽被共转录表达到RNA链中，或者可以利用加帽酶转录后连接到RNA。

在一些实施方案中，本公开的RNA包含5'-UTR和/或3'-UTR。术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中转录但未翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子如mRNA分子中的相应区域。非翻译区(UTR)可以存在于开放阅读框的5'(上游)(5'-UTR)和/或开放阅读框的3'(下游)(3'-UTR)。5'-UTR，如果存在，位于蛋白编码区起始密码子上游的5'端。5'-UTR位于5'-帽(如果存在)的下游，例如，直接与5'-帽相邻。3'-UTR，如果存在，位于蛋白编码区终止密码子下游的3'端，但术语“3'-UTR”优选不包括poly(A)尾。因此，3'-UTR位于poly(A)序列(如果存在)的上游，例如，与poly(A)序列直接相邻。

在一些实施方案中，本公开的RNA包含3'-poly(A)序列。术语“poly(A)序列”涉及腺苷酸(A)残基的序列，其通常位于RNA分子的3'-端。根据本公开，在一实施方案中，poly(A)序列包含至少约20、至少约40、至少约80或至少约100，并且达约500、达约400、达约300、达约200，或达约150个A核苷酸，特别是约120个A核苷酸。

在本公开的上下文中，术语“转录”涉及将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，RNA可以被翻译成肽或蛋白。

关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过该过程，mRNA链指导氨基酸序列组装以制造肽或蛋白。

根据本公开，术语“RNA编码”指RNA，如果存在于合适的环境中，例如靶组织的细胞内，可以指导氨基酸的组装以在翻译过程中产生其编码的肽或蛋白。在一实施方案中，RNA能够与细胞翻译机制相互作用，允许翻译肽或蛋白。细胞可以在细胞内(例如在细胞质和/或细胞核中)产生编码的肽或蛋白，可以分泌编码的肽或蛋白，或者可以在表面产生编码的肽或蛋白。

本文所用的术语“连接的”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指将两个或更多个元件或组件或结构域连接在一起。

如本文所用，“半衰期”指肽或蛋白的血清或血浆浓度在体内降低50％所需的时间，例如由于自然机制的降解和/或清除或隔离。适用于本文的延长PK的细胞因子，例如延长PK的白细胞介素(IL)在体内稳定，并且其半衰期通过例如与血清白蛋白(例如，HSA或MSA)融合而增加，其抵抗降解和/或清除或隔离。半衰期可以以任何本身已知的方式确定，例如通过药代动力学分析。合适的技术对于本领域技术人员来说是清楚的，并且可以例如通常包括以下步骤：将合适剂量的氨基酸序列或化合物适当地给药至受试者；以规律间隔从受试者收集血液样品或其他样品；确定所述血液样品中氨基酸序列或化合物的水平或浓度；以及从由此获得的数据(的绘图)计算直到氨基酸序列或化合物的水平或浓度与剂量给药时的初始水平相比降低50％的时间。进一步的细节提供于，例如标准手册，如Kenneth,A.et al.,Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists andin Peters et al.,Pharmacokinetic Analysis:A Practical Approach(1996)。还可以参见Gibaldi,M.et al.,Pharmacokinetics,2nd Rev.Edition,Marcel Dekker(1982)。

细胞因子

细胞因子是一类在细胞信号传导中很重要的小蛋白(～5-20kDa)。它们的释放会影响其周围细胞的行为。细胞因子作为免疫调节剂参与自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子，但通常不包括激素或生长因子(尽管术语有些重叠)。细胞因子由多种细胞产生，包括免疫细胞如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞。给定的细胞因子可以由一种以上类型的细胞产生。细胞因子通过受体发挥作用，在免疫系统中尤为重要；细胞因子调节体液和细胞免疫应答之间的平衡，并且它们调节特定细胞群的成熟、生长和反应性。一些细胞因子以复杂的方式增强或抑制其他细胞因子的作用。

IL2

白细胞介素2(IL2)是一种细胞因子，其诱导抗原激活的T细胞增殖并刺激自然杀伤(NK)细胞。IL2的生物学活性通过跨细胞膜的三个多肽亚基的多亚基IL2受体复合物(IL2R)介导：p55(IL2Rα，α亚基，在人中也称为CD25)，p75(IL2Rβ，β亚基，在人中也称为CD122)和p64(IL2Rγ，γ亚基，在人中也称为CD 132)。T细胞对IL2的应答取决于各种因素，包括：(1)IL2的浓度；(2)细胞表面IL2R分子的量；(3)IL2占据的IL2R的量(即IL2与IL2R之间结合相互作用的亲和力(Smith,"Cell Growth Signal Transduction is Quantal"InReceptor Activation by Antigens,Cytokines,Hormones,and Growth Factors 766:263-271,1995))。IL2:IL2R复合物在配体结合后被内化，并且不同的组分进行差异分选。当作为静脉内(i.v.)推注给药时，IL2具有快速的全身清除(初始清除阶段的半衰期为12.9分钟，然后是较慢的清除阶段，半衰期为85分钟)(Konrad et al.,Cancer Res.50:2009-2017,1990)。

癌症患者全身IL2给药的结果远非理想。虽然15-20％的患者对高剂量IL2客观上有响应，但大多数患者没有响应，而且许多患者会出现严重的、危及生命的副作用，包括恶心、意识模糊、低血压和感染性休克。与高剂量IL2治疗相关的严重毒性主要归因于自然杀伤(NK)细胞的活性。已经尝试通过减少剂量和调整给药方案来降低血清浓度，虽然毒性较小，但此类治疗也不太有效。

根据本公开，在某些实施方案中，IL2与药代动力学修饰基团相连。所得分子，以下称为“延长药代动力学(PK)的IL2”，相对于游离IL2具有延长的循环半衰期。延长PK的IL2的延长的循环半衰期允许体内血清IL2浓度维持在治疗范围内，可能导致许多类型免疫细胞(包括T细胞)的活化增强。由于其有利的药代动力学谱，与未修饰的IL2相比，延长PK的IL2的给药频率可以更低，并且持续时间更长。

根据本公开，IL2(任选地作为延长PK的IL2的一部分)可以是天然存在的IL2或其片段或变体。IL2可以是人IL2，并且可以源自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物。在一实施方案中，IL2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一实施方案中，IL2或IL2片段或变体与IL2受体或IL2受体的亚基如α亚基和/或β/γ亚基结合。

在某些实施方案中，延长PK的IL2的IL2部分为人IL2。在其他实施方案中，延长PK的IL2的IL2部分为人IL2的片段或变体。

在本文所述的某些实施方案中，IL2与异源多肽(即，不是IL2的多肽)融合。异源多肽可以增加IL2的循环半衰期。如以下进一步详细讨论的，增加循环半衰期的多肽可以为血清白蛋白，例如人(例如，SEQ ID NO:4)或小鼠(例如，SEQ ID NO:8，11)血清白蛋白。

IL7

IL7是一种造血生长因子，由骨髓和胸腺中的基质细胞分泌。其也由角质形成细胞、树突细胞、肝细胞、神经元和上皮细胞产生，但不由正常淋巴细胞产生。IL7是对B细胞和T细胞发育重要的细胞因子。IL7细胞因子和肝细胞生长因子形成异二聚体，其作为前祖(pre-pro)B细胞生长刺激因子发挥作用。小鼠基因敲除研究表明IL7在淋巴样细胞存活中起重要作用。

IL7结合IL7受体，由IL7受体α和共同γ链受体组成的异源二聚体。结合导致对T细胞胸腺内发育和外周存活重要的信号级联。遗传缺乏IL7受体的敲除小鼠表现出胸腺萎缩、T细胞发育停滞在双阳性阶段和严重的淋巴细胞减少。向小鼠给药IL7导致新近胸腺迁出细胞增加、B细胞和T细胞增加，以及在给药环磷酰胺后或骨髓移植后T细胞的恢复增加。

根据本公开，在某些实施方案中，IL7与药代动力学修饰基团相连。所得分子，以下称为“延长药代动力学(PK)的IL7”，相对于游离IL7具有延长的循环半衰期。延长PK的IL7延长的循环半衰期允许体内血清IL7浓度维持在治疗范围内，可能导致许多类型免疫细胞(包括T细胞)的存活增强。由于其有利的药代动力学谱，与未修饰的IL7相比，延长PK的IL7的给药频率可以更低，并且持续时间更长。

根据本公开，IL7(任选地作为延长PK的IL7的一部分)可以是天然存在的IL7或其片段或变体。IL7可以是人IL7，并且可以源自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物。在一实施方案中，IL7包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一实施方案中，IL7或IL7片段或变体与IL7受体结合。

在某些实施方案中，延长PK的IL7的IL7部分为人IL7。在其他实施方案中，延长PK的IL7的IL7部分为人IL7的片段或变体。

在本文所述的某些实施方案中，IL7与异源多肽(即，不是IL7的多肽)融合。异源多肽可以增加IL7的循环半衰期。如以下进一步详细讨论的，增加循环半衰期的多肽可以为血清白蛋白，例如人(例如，SEQ ID NO:4)或小鼠(例如，SEQ ID NO:8，11)血清白蛋白。

IL21

白细胞介素-21(IL21)是一种细胞因子，其对免疫系统的细胞具有有效的调节作用，包括自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞。这种细胞因子在其靶细胞中诱导细胞分裂/增殖。IL21在活化的人CD4+T细胞中表达，但不在大多数其他组织中表达。此外，IL21表达在T辅助细胞的Th2和Th17亚群以及T滤泡细胞中上调。另外，IL21在NK T细胞中表达，调节这些细胞的功能。白细胞介素21也由霍奇金淋巴瘤(HL)癌细胞产生。

IL21受体(IL21R)在T、B和NK细胞表面表达。IL21R在结构上与其他I型细胞因子(如IL2或IL-15)的受体相似，并且需要与共同γ链(γc)二聚化以结合IL-21。当与IL21结合时，IL21受体通过Jak/STAT途径起作用，利用Jak1和Jak3以及STAT3同二聚体来激活其靶基因。

根据本公开，在某些实施方案中，IL21与药代动力学修饰基团相连。所得分子，以下称为“延长药代动力学(PK)的IL21”，相对于游离IL21具有延长的循环半衰期。延长PK的IL21的延长的循环半衰期允许体内血清IL21浓度维持在治疗范围内，可能导致许多类型免疫细胞(包括T细胞)的激活增强。由于其有利的药代动力学谱，与未修饰的IL21相比，延长PK的IL21的给药频率可以更低，持续时间更长。

根据本公开，IL21(任选地作为延长PK的IL21的一部分)可以是天然存在的IL21或其片段或变体。IL21可以是人IL21，并且可以源自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物。在一实施方案中，IL21包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一实施方案中，IL21或IL21片段或变体与IL21受体结合。

在某些实施方案中，延长PK的IL21的IL21部分为人IL21。在其他实施方案中，延长PK的IL21的IL21部分为人IL21的片段或变体。

在本文所述的某些实施方案中，IL21与异源多肽(即，不是IL21的多肽)融合。异源多肽可以增加IL21的循环半衰期。如以下进一步详细讨论的，增加循环半衰期的多肽可以为血清白蛋白，例如人(例如，SEQ ID NO:4)或小鼠(例如，SEQ ID NO:8，11)血清白蛋白。

延长PK的基团

细胞因子，例如本文所述的白细胞介素，如IL2、IL7或IL21，可以与延长PK的基团融合，从而增加循环半衰期。延长PK的基团的非限制性实例在下文中描述。应当理解，增加细胞因子或其变体的循环半衰期的其他PK基团也适用于本公开。在某些实施方案中，延长PK的基团为血清白蛋白结构域(例如，小鼠血清白蛋白，人血清白蛋白)。

本文所用的术语“PK”是“药代动力学”的首字母缩写词并且涵盖化合物的性质，包括例如受试者的吸收、分布、代谢和消除。如本文所用，“延长PK的基团”指当与生物活性分子融合或与生物活性分子一起给药时增加生物活性分子的循环半衰期的蛋白、肽或部分。延长PK的基团的实例包括血清白蛋白(如，HSA)、Fc或Fc片段及其变体、转铁蛋白及其变体，以及人血清白蛋白(HSA)结合剂(如美国公开号2005/0287153和2007/0003549所公开)。其他示例性延长PK的基团公开于Kontermann et al.,Current Opinion in Biotechnology2011；22:868-876，其整体援引加入本文。如本文所用，“延长PK的细胞因子”指与延长PK的基团组合的细胞因子部分。在一实施方案中，延长PK的细胞因子为融合蛋白，其中细胞因子部分与延长PK的基团连接或融合。如本文所用，“延长PK的IL”指与延长PK的基团组合的白细胞介素(IL)部分。在一实施方案中，延长PK的IL为融合蛋白，其中IL部分与延长PK的基团连接或融合。示例性融合蛋白有HSA/IL2融合蛋白，其中IL2部分与HSA融合。另一种示例性融合蛋白是HSA/IL7融合蛋白，其中IL7部分与HSA融合。另一种示例性融合蛋白是HSA/IL21融合蛋白，其中IL21部分与HSA融合。

在某些实施方案中，相对于单独的细胞因子(即，细胞因子未与延长PK的基团融合)，延长PK的细胞因子的血清半衰期增加。在某些实施方案中，相对于单独的细胞因子的血清半衰期，延长PK的细胞因子的血清半衰期长至少20、40、60、80、100、120、150、180、200、400、600、800或1000％。在某些实施方案中，延长PK的细胞因子的血清半衰期为单独细胞因子的血清半衰期的至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍或50倍。在某些实施方案中，延长PK的细胞因子的血清半衰期为至少10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时或200小时。

在某些实施方案中，延长PK的基团包括血清白蛋白或其片段，或者血清白蛋白或其片段的变体(出于本公开的目的，所有这些都包含在术语“白蛋白”中)。本文所述的多肽可与白蛋白(或其片段或变体)融合以形成白蛋白融合蛋白。这样的白蛋白融合蛋白描述于美国公开号20070048282。

如本文所用，“白蛋白融合蛋白”指通过至少一分子白蛋白(或其片段或变体)与至少一分子蛋白例如治疗性蛋白，特别是IL2、IL7或IL21(或其片段或变体)融合而形成的蛋白。白蛋白融合蛋白可以通过核酸的翻译产生，其中编码治疗性蛋白的多核苷酸与编码白蛋白的多核苷酸阅读框内(in-frame)连接。治疗性蛋白和白蛋白，一旦成为白蛋白融合蛋白的一部分，可各自称为白蛋白融合蛋白的“一部分”、“区域”或“部分”(例如“治疗性蛋白部分”或“白蛋白部分”)。在一个特别优选的实施方案中，白蛋白融合蛋白包含至少一分子治疗性蛋白(包括但不限于治疗性蛋白的成熟形式)和至少一分子白蛋白(包括但不限于白蛋白的成熟形式)。在一实施方案中，白蛋白融合蛋白由宿主细胞，例如给药RNA的靶器官的细胞加工(例如，肝细胞)并分泌到循环中。在用于表达RNA的宿主细胞的分泌途径中发生的新生白蛋白融合蛋白的加工可以包括但不限于信号肽切割；二硫键形成；正确折叠；碳水化合物的添加和加工(例如N-和O-连接的糖基化)；特异性蛋白水解切割；和/或组装成多聚蛋白。白蛋白融合蛋白优选由未加工形式的RNA编码，其特别是在其N端具有信号肽，并且在细胞分泌后优选以加工形式存在，其中特别是信号肽已被切掉。在最优选的实施方案中，“白蛋白融合蛋白的加工形式”指进行N端信号肽切割的白蛋白融合蛋白产品，本文也称为“成熟白蛋白融合蛋白”。

在优选的实施方案中，与未与白蛋白融合的相同治疗性蛋白的血浆稳定性相比，包含治疗性蛋白的白蛋白融合蛋白具有更高的血浆稳定性。血浆稳定性通常指治疗性蛋白体内给药并进入血流与治疗性蛋白降解并从血流中清除进入器官(例如肾或肝)，最终从身体清除治疗性蛋白之间的时间段。血浆稳定性根据血流中治疗性蛋白的半衰期计算。血流中治疗性蛋白的半衰期可以通过本领域已知的常用测定容易地确定。

如本文所用，“白蛋白”整体上指具有白蛋白的一种或多种功能活性(例如，生物学活性)的白蛋白蛋白或氨基酸序列，或者白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”指人白蛋白或者其片段或变体，尤其是人白蛋白的成熟形式，或者来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子的变体。白蛋白可以来自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人、牛、羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于鸡和鲑鱼。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以与治疗性蛋白部分来自不同的动物。

在某些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白(HSA)，或者其片段或变体，例如以下公开的那些：US 5,876,969、WO 2011/124718、WO 2013/075066、和WO2011/0514789。

术语，人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)在本文中互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”更广泛，并且涵盖人血清白蛋白(及其片段和变体)以及其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。

如本文所用，足以延长治疗性蛋白的治疗活性或血浆稳定性的白蛋白片段指在长度或结构上足以稳定或延长蛋白的治疗活性或血浆稳定性的白蛋白片段，从而与非融合状态的血浆稳定性相比，白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的血浆稳定性得以延长或扩展。

白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包含白蛋白序列的全长，或者可以包含其一个或多个能够稳定或延长治疗活性或血浆稳定性的片段。这样的片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可以包含来自白蛋白序列的约15、20、25、30、50或更多个连续氨基酸，或者可以包含部分或全部白蛋白的特定结构域。例如，可以使用一个或多个HAS的片段，跨越前两个免疫球蛋白样结构域。在优选的实施方案中，HSA片段为HSA的成熟形式。

一般而言，白蛋白片段或变体的长度为至少100个氨基酸，优选至少150个氨基酸。

根据本公开，白蛋白可以是天然存在的白蛋白或者其片段或变体。白蛋白可以是人白蛋白，并且可以源自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物。在一实施方案中，白蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:4至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

优选地，白蛋白融合蛋白包含白蛋白作为N端部分，以及治疗性蛋白作为C端部分。或者，也可以使用白蛋白融合蛋白，其包含白蛋白作为C端部分和治疗性蛋白作为N端部分。在其他实施方案中，白蛋白融合蛋白具有与白蛋白的N端和C端融合的治疗性蛋白。在优选的实施方案中，在N和C端融合的治疗性蛋白是相同的治疗性蛋白。在另一优选的实施方案中，在N和C端融合的治疗性蛋白是不同的治疗性蛋白。在一实施方案中，不同的治疗性蛋白可以用于治疗或预防相同或相关的疾病、病症或疾病状况。在一实施方案中，不同的治疗性蛋白都是细胞因子。

在一实施方案中，治疗性蛋白通过肽接头与白蛋白相连。融合部分之间的接头肽可以提供部分之间更大的物理分离，从而使治疗性蛋白部分的可接近性最大化，例如，对于结合其同源受体而言。接头肽可以由氨基酸组成，从而使其是柔性或更刚性的。接头序列可以被蛋白酶或化学切割。

本文所用的术语“Fc区”指由其两条重链的相应Fc结构域(或Fc部分)形成的天然免疫球蛋白的部分。本文所用的术语“Fc结构域”指单条免疫球蛋白(Ig)重链的部分或片段，其中Fc结构域不包含Fv结构域。在某些实施方案中，Fc结构域开始于就在木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区，并且结束于抗体的C端。因此，完整的Fc结构域包含至少铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方案中，Fc结构域包含以下至少一种：铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域，或者其变体、部分或片段。在某些实施方案中，Fc结构域包含完整的Fc结构域(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在某些实施方案中，Fc结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)。在某些实施方案中，Fc结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)。在某些实施方案中，Fc结构域由CH3结构域或其部分组成。在某些实施方案中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，Fc结构域由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在某些实施方案中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，Fc结构域缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。本文的Fc结构域通常指包含免疫球蛋白重链的全部或部分Fc结构域的多肽。这包括但不限于包含整个CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域的多肽，以及仅包含例如铰链、CH2和CH3结构域的此类肽的片段。Fc结构域可源自任何物种和/或任何亚型的免疫球蛋白，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体。Fc结构域涵盖天然Fc和Fc变体分子。如本文所述，本领域普通技术人员会理解，可以修饰任何Fc结构域，使得其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子的天然Fc结构域不同。在某些实施方案中，Fc结构域具有降低的效应子功能(例如，FcγR结合)。

本文所述的多肽的Fc结构域可以源自不同免疫球蛋白分子。例如，多肽的Fc结构域可以包含源自IgG1分子的CH2和/或CH3结构域以及源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，Fc结构域可以包含部分源自IgG1分子且部分源自IgG3分子的嵌合铰链区。在另一实例中，Fc结构域可以包含部分源自IgG1分子且部分源自IgG4分子的嵌合铰链。

在某些实施方案中，延长PK的基团包括Fc结构域或其片段或者Fc结构域或其片段的变体(出于本公开的目的，所有这些都包含在术语“Fc结构域”中)。Fc结构域不包含与抗原结合的可变区。适用于本公开的Fc结构域可以从一些不同的来源获得。在某些实施方案中，Fc结构域源自人免疫球蛋白。在某些实施方案中，Fc结构域源自人IgG1恒定区。然而，应当理解，Fc结构域可以源自另一哺乳动物物种，包括例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴)物种的免疫球蛋白。

此外，Fc结构域(或其片段或变体)可以源自任何免疫球蛋白类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何免疫球蛋白同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

多种Fc结构域基因序列(例如，小鼠和人恒定区基因序列)可以以公众可得的保藏物形式获得。可以选择包含Fc结构域序列的恒定区结构域，其缺乏特定的效应子功能和/或具有降低免疫原性的特定修饰。许多抗体和抗体编码基因的序列已经公开，并且合适的Fc结构域序列(例如铰链、CH2和/或CH3序列，或者其片段或变体)可以使用本领域公认的技术从这些序列中获得。

在某些实施方案中，延长PK的基团为血清白蛋白结合蛋白，例如以下中公开的那些：US2005/0287153、US2007/0003549、US2007/0178082、US2007/0269422、US2010/0113339、WO2009/083804和WO2009/133208，其整体援引加入本文。在某些实施方案中，延长PK的基团为转铁蛋白，如US 7,176,278和US 8,158,579(其整体援引加入本文)公开的那些。在某些实施方案中，延长PK的基团为血清免疫球蛋白结合蛋白，如US2007/0178082(其整体援引加入本文)公开的那些。在某些实施方案中，延长PK的基团为基于纤连蛋白(Fn)的支架结构域蛋白，其结合血清白蛋白，如US2012/0094909(其整体援引加入本文)公开的那些。US2012/0094909中还公开了制备基于纤连蛋白的支架结构域蛋白的方法。基于Fn3的延长PK的基团的非限制性实例有Fn3(HSA)，即，结合人血清白蛋白的Fn3蛋白。

在某些方面，适合根据本公开使用的延长PK的细胞因子例如延长PK的IL可以使用一种或多种肽接头。本文所用的术语“肽接头”指在多肽链的线性氨基酸序列中连接两个或更多个结构域(例如，延长PK的部分和IL部分，如IL2、IL7或IL21)的肽或多肽序列。例如，肽接头可用于将IL2部分连接到HSA结构域。在另一实施方案中，肽接头可以用于将IL7部分连接到HSA结构域。在另一实施方案中，肽接头可以用于将IL21部分连接到HSA结构域。

适合将延长PK的基团融合到例如IL2、IL7或IL21的接头是本领域公知的。示例性接头包括甘氨酸-丝氨酸多肽接头、甘氨酸-脯氨酸多肽接头和脯氨酸-丙氨酸多肽接头。在某些实施方案中，接头为甘氨酸-丝氨酸多肽接头，即，由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。

抗原

适用于本公开的肽和蛋白抗原，即抗原或其变体，通常包括肽或蛋白，其包含用于诱导免疫应答的表位。肽或蛋白或表位可以源自靶抗原，即要引发针对其的免疫应答的抗原。例如，肽或蛋白抗原或包含在肽或蛋白抗原中的表位可以是靶抗原或者靶抗原的片段或变体。

给药的或由核酸编码的肽和蛋白抗原，特别是给药的RNA，即疫苗抗原，优选导致给药肽或蛋白抗原或核酸的受试者中遗传修饰以表达CAR的T细胞的刺激、引发和/或扩增。所述刺激、引发和/或扩增的T细胞优选针对靶抗原，特别是由患病细胞、组织和/或器官表达的靶抗原，即疾病相关抗原。因此，疫苗抗原可以包含疾病相关抗原，或者其片段或变体。在一实施方案中，这样的片段或变体在免疫学上等同于疾病相关抗原。在本公开的上下文中，术语“抗原的片段”或“抗原的变体”指导致CAR工程化的T细胞的刺激、引发和/或扩增的物质，刺激、引发和/或扩增的T细胞靶向抗原，即，疾病相关抗原，特别是当由患病细胞、组织和/或器官呈递时。因此，疫苗抗原可以对应于或可以包含疾病相关抗原，可以对应于或可以包含疾病相关抗原的片段，或者可以对应于或可以包含与疾病相关抗原或其片段同源的抗原。如果疫苗抗原包含疾病相关抗原的片段或与疾病相关抗原的片段同源的氨基酸序列，则所述片段或氨基酸序列可以包含疾病相关抗原的表位(CAR工程化的T细胞的CAR靶向所述表位)，或者包含与疾病相关抗原的表位同源的序列。因此，根据本公开，疫苗抗原可以包含疾病相关抗原的免疫原性片段或与疾病相关抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。本公开的“抗原的免疫原性片段”优选涉及能够刺激、引发和/或扩增T细胞的抗原片段，所述T细胞携带与抗原或表达抗原的细胞结合的CAR。优选地，疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)可以在细胞(例如抗原呈递细胞)的表面表达，以提供由CAR工程化的T细胞结合的相关表位。疫苗抗原可以是重组抗原。

术语“免疫学等同”表示免疫学等同的分子，例如免疫学等同的氨基酸序列，其表现出相同或基本相同的免疫学性质和/或发挥相同或基本相同的免疫学作用，例如，对于免疫学作用的类型。在本公开的上下文中，优选对于用于免疫的抗原或抗原变体的免疫学作用或性质使用术语“免疫学等同”。例如，如果氨基酸序列在暴露于受试者的免疫系统，例如与参考氨基酸序列结合的T细胞或表达参考氨基酸序列的细胞时，诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列在免疫学上等同于参考氨基酸序列。因此，免疫学上等同于抗原的分子，就T细胞的刺激、引发和/或扩增而言，表现出与T细胞所靶向的抗原相同或基本相同的特性和/或发挥相同或基本相同的作用。

术语“引发”指T细胞第一次与其特异性抗原接触并导致分化为效应T细胞的过程。

术语“克隆扩增”或“扩增”指其中特定实体倍增的过程。在本公开的上下文中，该术语优选用于免疫应答的上下文中，其中淋巴细胞被抗原刺激、增殖，并且识别所述抗原的特异性淋巴细胞被扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。

术语“抗原”涉及包含表位的物质，可以针对表位产生免疫应答。术语“抗原”尤其包括蛋白和肽。在一实施方案中，抗原存在于免疫系统细胞的表面，例如抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞的表面。在一实施方案中，抗原或其加工产物(如T细胞表位)被CAR分子结合。因此，抗原或其加工产物可以与T淋巴细胞(T细胞)特异性反应。在一实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位源自这样的抗原。

术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是包含表位的分子，所述表位刺激宿主的免疫系统，以产生针对疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答。因此，疾病相关抗原或其表位可以用于治疗目的。疾病相关抗原可能与微生物感染有关，通常是微生物抗原，或与癌症有关，通常是肿瘤。

术语“肿瘤抗原”指癌细胞的成分，其可以来自细胞质、细胞表面和细胞核。特别地，其指那些在细胞内产生或作为肿瘤细胞表面抗原的抗原。肿瘤抗原通常优先由癌细胞表达(例如，其在癌细胞中的表达水平高于非癌细胞)，并且在一些情况下，其仅由癌细胞表达。肿瘤抗原的实例包括但不限于，p53、ART-4、BAGE、β-连环蛋白(beta-catenin)/m、Bcr-abL CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、紧密连接蛋白家族的细胞表面蛋白，如CLAUDIΝ-6、CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A，优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A 10、MAGE-A 1 1或MAGE-A12、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、pl90小BCR-abL、Pml/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE、WT和WT-1。

术语“病毒抗原”指任何具有抗原性质(即能够在个体中引起免疫应答)的病毒成分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。

术语“细菌抗原”指任何具有抗原性质(即能够在个体中引起免疫应答)的细菌成分。细菌抗原可以源自细菌的细胞壁或细胞质膜。

术语“表位”指被免疫系统识别的分子(例如抗原)的部分或片段。例如，表位可以被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可以包括抗原的连续或不连续部分并且长度可以为约5至约100个氨基酸，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位的长度可以优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包括T细胞表位。

术语“T细胞表位”指当在MHC分子的情况下呈递时被T细胞识别的蛋白的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞和抗原呈递细胞或患病细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并将它们呈递以由T细胞上的T细胞受体识别。MHC编码的蛋白在细胞表面表达，并向T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽的长度通常为约8至约10个氨基酸，但更长或更短的肽可以是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽的长度通常为约10至约25个氨基酸，特别是约13至约18个氨基酸，但更长和更短的肽可以是有效的。

在一实施方案中，靶抗原为肿瘤抗原，并且疫苗抗原或其片段(例如，表位)源自所述肿瘤抗原。肿瘤抗原可以为“标准”抗原，其通常已知在各种癌症中表达。肿瘤抗原也可以为“新抗原”，其对个体的肿瘤具有特异性并且之前未被免疫系统识别。新抗原或新表位可能由癌细胞基因组中的一个或多个癌症特异性突变引起，导致氨基酸变化。如果肿瘤抗原为新抗原，则疫苗抗原优选包含所述新抗原的表位或片段，所述新抗原包含一个或多个氨基酸变化。

肽和蛋白抗原的长度可以为2-100个氨基酸，包括例如5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸或50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可以大于50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可以大于100个氨基酸。

根据本发明，抗原或其变体应当可被CAR识别。优选地，如果被CAR识别，抗原或其变体能够在适当的共刺激信号的存在下诱导T细胞的刺激、引发和/或扩增，所述T细胞携带识别抗原或其变体的CAR。在本发明实施方案的上下文中，抗原或其变体优选存在于细胞表面，优选抗原呈递细胞表面。识别患病细胞表面的抗原可以导致针对抗原(或表达抗原的细胞)的免疫反应。

根据本发明的各个方面，目的优选是提供针对表达肿瘤抗原(例如CLDN6或CLDN18.2)的癌细胞的免疫应答和治疗涉及表达肿瘤抗原(例如CLDN6或CLDN18)的细胞的癌症疾病。优选地，本发明涉及给药靶向表达肿瘤抗原(例如CLDN6或CLDN18.2)的癌细胞的CAR工程化的T细胞。

“细胞表面”根据其在本领域中的通常含义使用，因此包括易于被蛋白和其他分子结合的细胞外部。如果抗原位于细胞的表面并且可以通过例如添加到细胞的抗原特异性抗体而接近结合，则抗原在所述细胞表面上表达。在一实施方案中，在细胞表面表达的抗原是整合膜蛋白，具有被CAR识别的细胞外部分。

在本发明的上下文中，术语“细胞外部分”或“外结构域”指分子(例如蛋白)的一部分，其面向细胞的细胞外空间并且优选可从所述细胞的外部接近，例如，由位于细胞外的结合分子，如抗体。优选地，该术语指一个或多个细胞外环或结构域或其片段。

在本发明所有方面的一实施方案中，抗原在患病细胞(如癌细胞)中表达。在一实施方案中，抗原在患病细胞(如癌细胞)的表面表达。在一实施方案中，CAR结合抗原或其变体的胞外结构域或胞外结构域中的表位。在一实施方案中，CAR结合存在于活细胞表面的抗原或其变体的天然表位。在一些实施方案中，所述抗原是紧密连接蛋白，特别是紧密连接蛋白6或紧密连接蛋白18.2，并且所述CAR结合所述紧密连接蛋白的第一胞外环。在一实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，所述CAR与存在于细胞例如抗原呈递细胞上的抗原或其变体的结合导致所述T细胞的刺激、引发和/或扩增。在一实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，所述CAR与存在于患病细胞(例如癌细胞)上的抗原的结合导致患病细胞的细胞溶解和/或凋亡，其中所述T细胞优选释放细胞毒性因子，例如穿孔素和颗粒酶。

免疫检验点抑制剂

在某些实施方案中，免疫检验点抑制剂与本文所述的其他治疗剂联合使用。

如本文所用，“免疫检验点”指调节T细胞受体识别抗原的幅度和质量的共刺激和抑制信号。在某些实施方案中，免疫检验点为抑制信号。在某些实施方案中，抑制信号为PD-1与PD-L1之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号为CTLA-4与CD80或CD86之间的相互作用以代替CD28结合。在某些实施方案中，抑制信号为LAG3与MHC II类分子之间的相互作用。在某些实施方案中，抑制信号为TIM3与半乳凝素9之间的相互作用。

如本文所用，“免疫检验点抑制剂”指完全或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种检验点蛋白的分子。在某些实施方案中，免疫检验点抑制剂阻止与免疫检验点相关的抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检验点抑制剂为破坏与免疫检验点相关的抑制性信号传导的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检验点抑制剂为破坏抑制性信号传导的小分子。在某些实施方案中，免疫检验点抑制剂为防止检验点阻断蛋白之间相互作用的抗体、其片段或抗体模拟物，例如防止PD-1与PD-L1之间相互作用的抗体、其片段或抗体模拟物。在某些实施方案中，免疫检验点抑制剂为防止CTLA-4与CD80或CD86之间相互作用的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂为防止LAG3与其配体或者TIM-3与其配体之间的相互作用的抗体或其片段。检验点抑制剂也可以为分子(或其变体)本身的可溶形式，例如，可溶性PD-L1或PD-L1融合蛋白。

“程序性死亡-1(PD-1)”受体指属于CD28家族的免疫抑制受体。PD-1主要在体内先前激活的T细胞上表达，并与两种配体PD-L1和PD-L2结合。本文所用的术语“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)、hPD-1的变体、同种型和物种同源物，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。

“程序性死亡配体1(PD-L1)”为PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是PD-L2)，其与PD-1结合后下调T细胞活化和细胞因子分泌。本文所用的术语“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1的变体、同种型和物种同源物，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。

“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)”为T细胞表面分子，并且是免疫球蛋白超家族的成员。这种蛋白通过与CD80和CD86结合来下调免疫系统。本文所用的术语“CTLA-4”包括人CTLA-4(hCTLA-4)、hCTLA-4的变体、亚型(isoform)和物种同源物，以及与hCTLA-4具有至少一个共同表位的类似物。

“淋巴细胞活化基因-3(LAG3)”为抑制性受体，其通过与MHC II类分子结合而与抑制淋巴细胞活性相关。这种受体增强Treg细胞的功能，并且抑制CD8+效应T细胞功能。本文所用的术语“LAG3”包括人LAG3(hLAG3)、hLAG3的变体、亚型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。

“T细胞膜蛋白-3(TIM3)”为抑制性受体，其通过抑制TH1细胞应答参与抑制淋巴细胞活性。它的配体为半乳凝素9，其在各种类型的癌症中上调。本文所用的术语“TIM3”包括人TIM3(hTIM3)、hTIM3的变体、亚型和物种同源物，以及具有至少一个共同表位的类似物。

“B7家族”指具有未定义受体的抑制性配体。B7家族涵盖B7-H3和B7-H4，两者都在肿瘤细胞和肿瘤浸润细胞上上调。

在某些实施方案中，适用于本文公开的方法的免疫检验点抑制剂是抑制信号的拮抗剂，例如，靶向如PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、B7-H3、B7-H4或TIM3的抗体。Pardoll,D.,Nature.12:252-264,2012对这些配体和受体进行了综述。

在某些实施方案中，免疫检验点抑制剂为抗体或其抗原结合部分，其破坏或抑制来自抑制性免疫调节剂的信号传导。在某些实施方案中，免疫检验点抑制剂是小分子，其破坏或抑制来自抑制性免疫调节剂的信号传导。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是PD-1/PD-L1信号传导通路的组分。因此，本公开的某些实施方案提供向受试者给药破坏PD-1受体与其配体PD-L1之间相互作用的抗体或其抗原结合部分。结合PD-1并破坏PD-1与其配体PD-L1之间相互作用的抗体是本领域已知的。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与PD-L1特异性结合并抑制其与PD-1的相互作用，从而增加免疫活性。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是CTLA4信号传导通路的组分。因此，本公开的某些实施方案提供向受试者给药靶向CTLA4并破坏其与CD80和CD86相互作用的抗体或其抗原结合部分。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是LAG3(淋巴细胞激活基因3)信号通路的组分。因此，本公开的某些实施方案提供向受试者给药靶向LAG3并破坏其与MHC II类分子相互作用的抗体或其抗原结合部分。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是B7家族信号传导通路的组分。在某些实施方案中，B7家族成员为B7-H3和B7-H4。因此，本公开的某些实施方案提供向受试者给药靶向B7-H3或H4的抗体或其抗原结合部分。B7家族没有任何确定的受体，但这些配体在肿瘤细胞或肿瘤浸润细胞上上调。临床前小鼠模型表明，阻断这些配体可以增强抗肿瘤免疫。

在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂是TIM3(T细胞膜蛋白3)信号传导通路的组分。因此，本公开的某些实施方案提供向受试者给药靶向TIM3并破坏其与半乳凝素9相互作用的抗体或其抗原结合部分。

本领域普通技术人员应当理解，其他免疫检验点靶标也可以被拮抗剂或抗体靶向，只要靶向导致免疫应答的刺激，例如抗肿瘤免疫应答，如反映在，例如T细胞增殖增加、T细胞活化增强和/或细胞因子(例如，IFN-γ、IL2)产生增加。

根据本公开，术语“抗体”指包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。每条重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。

抗体可以源自不同物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。

本文所述的抗体包括IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM和IgD抗体。在各种实施方案中，抗体为IgGl抗体，更具体地，IgGl，κ或IgGl，λ同种型(即，IgGl，κ，λ)、IgG2a抗体(例如，IgG2a，κ，λ)、IgG2b抗体(例如，IgG2b，κ，λ)、IgG3抗体(例如，IgG3，κ，λ)或IgG4抗体(例如，IgG4，κ，λ)。

术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“结合部分”)或抗体的“抗原结合片段”(或简称为“结合片段”)或类似术语指抗体的一个或多个片段，其保留与抗原特异性结合的能力。已经证实，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546)，由VH结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)，和(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可以任选地通过合成接头连接。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，这使它们能够制备为单个蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird et al.(1988)Science 242:423-426；and Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内。进一步实例有结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)结合结构域多肽，其与免疫球蛋白铰链区多肽融合；(ii)免疫球蛋白重链CH2恒定区，其与铰链区融合；和(iii)免疫球蛋白重链CH3恒定区，其与CH2恒定区融合。结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。结合结构域免疫球蛋白融合蛋白进一步公开于US 2003/0118592和US2003/0133939。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。

RNA靶向

根据本公开，在给药本文所述的RNA之后，至少一部分RNA被递送至靶细胞。在一实施方案中，至少一部分RNA被递送到靶细胞的胞质溶胶中。在一实施方案中，RNA被靶细胞翻译以产生编码的肽或蛋白。

本公开的一些方面涉及本文公开的RNA(例如，编码细胞因子的RNA和编码抗原或其变体的RNA)的靶向递送。

在一实施方案中，本公开涉及靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。如果给药的RNA是编码抗原或其变体的RNA，则特别优选靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。

在一实施方案中，靶细胞为脾细胞。在一实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一实施方案中，靶细胞为脾中的树突细胞。

“淋巴系统”是循环系统的一部分，并且是免疫系统的重要部分，包括携带淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管传导网络和循环淋巴组成。初级或中央淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成初级淋巴器官。次级或外周淋巴器官，包括淋巴结和脾，维持成熟的幼稚淋巴细胞并启动适应性免疫应答。

RNA可以通过所谓的lipoplex制剂递送至脾，其中RNA与包含阳离子脂质和任选存在的额外或辅助脂质的脂质体结合以形成可注射的纳米颗粒制剂。脂质体可以通过将脂质的乙醇溶液注射到水或合适的水相中来获得。RNA lipoplex颗粒可以通过将脂质体与RNA混合来制备。脾靶向的RNA lipoplex颗粒描述于WO 2013/143683，其援引加入本文。已经发现，具有净负电荷的RNA lipoplex颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在给药RNA lipoplex颗粒之后，脾中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA lipoplex颗粒可用于在脾中表达RNA。在一实施方案中，在给药RNAlipoplex颗粒之后，在肺和/或肝中不发生或基本上不发生RNA积累和/或RNA表达。在一实施方案中，在给药RNA lipoplex颗粒之后，在抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA lipoplex颗粒可以用于在此类抗原呈递细胞中表达RNA。在一实施方案中，抗原呈递细胞为树突细胞和/或巨噬细胞。

在本公开的上下文中，术语“RNA lipoplex颗粒”涉及含有脂质，特别是阳离子脂质和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体与带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNAlipoplex颗粒的复合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可以使用阳离子脂质(例如，DOTMA)和额外的脂质(例如，DOPE)合成。在一实施方案中，RNA lipoplex颗粒为纳米颗粒。

如本文所用，“阳离子脂质”指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过静电相互作用将带负电荷的RNA与脂质基质结合。通常，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头部通常带有正电荷。阳离子脂质的实例包括但不限于，1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、2,3-二(十四烷基氧基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基氮鎓(2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium)(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、l,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(DORIE)和2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙铵(DOSPA)。优选DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在具体实施方案中，阳离子脂质为DOTMA和/或DOTAP。

可以加入额外的脂质以调整RNA lipoplex颗粒的整体正负电荷比和物理稳定性。在某些实施方案中，额外的脂质为中性脂质。如本文所用，“中性脂质”指净电荷为零的脂质。中性脂质的实例包括但不限于，1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在具体的实施方案中，额外的脂质为DOPE、胆固醇和/或DOPC。

在某些实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含阳离子脂质和额外的脂质。在示例性实施方案中，阳离子脂质为DOTMA，并且额外的脂质为DOPE。

在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种额外的脂质的摩尔比为约10:0-约1:9、约4:1-约1:2或约3:1-约1:1。在具体的实施方案中，摩尔比可为约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1或约1:1。在示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种额外脂质的摩尔比为约2:1。

在一实施方案中，本文所述的RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200nm-约1000nm、约200nm-约800nm、约250-约700nm、约400-约600nm、约300nm-约500nm或约350nm-约400nm。在具体的实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm或约1000nm。在一实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约250nm-约700nm。在另一实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约300nm-约500nm。在示例性实施方案中，RNA lipoplex颗粒的平均直径为约400nm。

本公开的RNA lipoplex颗粒的电荷是存在于至少一种阳离子脂质中的电荷与存在于RNA中的电荷之和。电荷比是存在于至少一种阳离子脂质中的正电荷与存在于RNA中的负电荷之比。存在于至少一种阳离子脂质中的正电荷与存在于RNA中的负电荷的电荷比通过以下等式计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中正电荷的总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中负电荷的总数)]。

在生理pH下本文所述的脾靶向RNA lipoplex颗粒优选具有净负电荷，例如约1.9:2-约1:2的正电荷与负电荷的电荷比。在具体的实施方案中，在生理pH值下，RNA lipoplex颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.9:2.0、约1.8:2.0、约1.7:2.0、约1.6:2.0、约1.5:2.0、约1.4:2.0、约1.3:2.0、约1.2:2.0、约1.1:2.0或约1:2.0。

细胞因子，例如延长PK的细胞因子，特别是延长PK的白细胞介素，例如本文所述的那些，可以递送至受试者的靶器官或靶组织，包括在制剂中向受试者给药编码细胞因子的RNA，用于将RNA优先递送至所述靶器官或组织。

在一实施方案中，靶器官为淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更具体地脾，并且靶组织是淋巴系统的组织，特别是次级淋巴器官的组织，更具体地脾组织。将细胞因子递送到这样的靶组织是优选的，特别是，如果期望在该器官或组织中存在细胞因子(例如，用于诱导免疫应答，特别是在T细胞引发期间或用于激活常驻免疫细胞所需的细胞因子的情况下)，同时不期望细胞因子全身性存在，特别是大量存在(例如，因为细胞因子具有全身毒性)。合适的细胞因子的特别优选的实例有参与T细胞引发的细胞因子。

在将细胞因子递送至受试者的靶器官或靶组织的另一实施方案中，靶器官为肝并且靶组织是肝组织。将细胞因子递送到这样的靶组织是优选的，特别是，如果期望在这个器官或组织中存在细胞因子，和/或如果期望表达大量的细胞因子，和/或如果期望或要求全身性存在细胞因子，特别是大量存在。

在一实施方案中，编码细胞因子的RNA在用于靶向肝的制剂中给药。这样的制剂在本文中有描述。合适的细胞因子的实例包括IL2、IL7或IL21、其片段和变体，以及这些细胞因子、片段和变体的融合蛋白，例如延长PK的细胞因子，例如本文描述的那些。合适的细胞因子的特别优选的实例有涉及T细胞增殖和/或维持的细胞因子。

RNA递送系统对肝有固有的偏好。这涉及基于脂质的颗粒、阳离子和中性纳米颗粒，特别是脂质纳米颗粒，例如生物缀合物中的脂质体、纳米胶束和亲脂性配体。肝蓄积是由肝脉管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。

为了在体内将RNA递送到肝，可以使用药物递送系统通过防止RNA降解来将其运输到肝中。例如，由聚(乙二醇)(PEG)包被的表面和含mRNA的核心组成的polyplex纳米胶束是有用的系统，因为纳米胶束在生理条件下为RNA提供优异的体内稳定性。此外，包含致密PEG栅栏(palisade)的polyplex纳米胶束表面提供的隐身性质有效地逃避宿主免疫防御。

药物组合物

本文所述的物质可以以药物组合物或药物给药，并且可以任何合适的药物组合物给药。

在本发明所有方面的一实施方案中，本文所述的组分，例如遗传修饰以表达CAR的T细胞、编码细胞因子的核酸或编码抗原或其变体的核酸，可以一起或彼此分开，在药物组合物中给药，所述药物组合物可以包含药学上可接受的载剂，并且可以任选地包含一种或多种佐剂、稳定剂等。在一实施方案中，药物组合物用于治疗性或预防性治疗，例如，用于治疗或预防涉及抗原的疾病，例如癌症疾病，例如本文所述的那些。

术语“药物组合物”涉及包含治疗有效物质的制剂，优选包含药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。所述药物组合物用于通过向受试者给药所述药物组合物来治疗、预防或降低疾病或病症的严重性。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。

本公开的药物组合物优选包含一种或多种佐剂，或者可以与一种或多种佐剂一起给药。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包括一组异质的化合物，例如油乳剂(例如，弗氏佐剂)、矿物化合物(例如，明矾)、细菌产物(例如，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)毒素)或免疫刺激复合物。佐剂的实例包括但不限于LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白细胞介素、趋化因子。趋化因子可以为IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-a。其他已知的佐剂有氢氧化铝、弗氏佐剂或油，例如ISA51。用于本公开的其他合适的佐剂包括脂肽，例如Pam3Cys。

本公开的药物组合物通常以“药学有效量”和“药学可接受的制剂”应用。

术语“药学可接受的”指不与药物组合物的活性成分的作用相互作用的材料的无毒性。

术语“药学有效量”或“治疗有效量”指单独或与其他剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选涉及疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应也可以是延迟所述疾病或所述疾病状况的发作或预防所述疾病或所述疾病状况的发作。本文所述组合物的有效量会取决于待治疗的疾病状况、疾病的严重性、患者的个体参数，包括年龄、生理状况、大小和体重、治疗持续时间、伴随的治疗类型(如果存在)、具体给药途径以及类似因素。因此，本文所述组合物的给药剂量可取决于各种此类参数。在初始剂量患者的反应不足的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的给药途径实现有效的更高剂量)。

本公开的药物组合物可以包含盐、缓冲剂、防腐剂以及任选存在的其他治疗剂。在一实施方案中，本公开的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。

用于本公开的药物组合物的合适防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。

本文所用的术语“赋形剂”指可以存在于本公开的药物组合物中但并非活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于载剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、调味剂或着色剂。

术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或稀释剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任何一种或多种。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。

术语“载剂”指可以是天然、合成、有机、无机的组分，其中结合活性组分以促进、增强或使得能给药药物组合物。本文使用的载体可以是一种或多种适合向受试者给药的相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载剂包括但不限于无菌水、林格(Ringer)溶液、林格乳酸溶液、无菌氯化钠溶液、等渗盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘，尤其是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一实施方案中，本公开的药物组合物包含等渗盐水。

用于治疗用途的药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.RGennaro edit.1985)。

药物载剂、赋形剂或稀释剂可以根据预期的给药途径和标准药物实践进行选择。

在一实施方案中，本文所述的药物组合物可以静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌肉内给药。在某些实施方案中，药物组合物配制为局部给药或全身给药。全身给药可以包括肠给药，其涉及通过胃肠道吸收，或肠胃外给药。如本文所用，“肠胃外给药”指以除通过胃肠道以外的任何方式给药，例如通过静脉内注射。在优选的实施方案中，药物组合物配制为全身给药。在另一优选实施方案中，全身给药通过静脉内给药进行。

在本发明所有方面的一实施方案中，编码细胞因子或者编码抗原或其变体的核酸全身给药。在本发明所有方面的一实施方案中，在全身给药编码抗原或其变体的核酸后，所述抗原或其变体在脾中表达。在本发明所有方面的一实施方案中，在全身给药编码抗原或其变体的核酸后，所述抗原或其变体在抗原呈递细胞，优选专职抗原呈递细胞中表达。在一实施方案中，抗原呈递细胞选自树突细胞、巨噬细胞和B细胞。在本发明所有方面的一实施方案中，在全身给药编码抗原或其变体的核酸后，在肺和/或肝中没有或基本上没有抗原或其变体的表达。在本发明所有方面的一实施方案中，在全身给药编码抗原或其变体的核酸后，脾中抗原或其变体的表达量是肺中表达量的至少5倍。

本文所用的术语“共同给药”指将不同的化合物或组合物(例如，编码白细胞介素的RNA和编码抗原或其变体的RNA)同时、基本上同时或依次向同一患者给药的过程。如果同时给药，不同的化合物或组合物不需要在同一组合物中给药。

治疗

本文所述的物质、组合物和方法可用于治疗患有疾病的受试者，例如，特征在于存在表达抗原的患病细胞的疾病。特别优选的疾病有癌症疾病。例如，如果抗原源自病毒，则所述物质、组合物和方法可以用于治疗由所述病毒引起的病毒性疾病。如果抗原是肿瘤抗原，则所述物质、组合物和方法可以用于治疗癌症疾病，其中癌细胞表达所述肿瘤抗原。

在一实施方案中，本公开涉及一种在受试者中诱导免疫应答的方法。在示例性实施方案中，免疫应答针对癌症。

术语“疾病”指影响个体身体的异常状况。疾病通常解释为与特定症状和指征相关的医学状况。疾病可能最初由外源因素引起，如感染性疾病，也可能由内部功能障碍引起，如自身免疫性疾病。在人中，“疾病”通常更广泛地用于指导致受折磨的个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡的任何状况，或对与个体接触的个体造成类似问题的任何状况。在这个更广泛的意义上，它有时包括伤害、残疾、障碍、综合征、感染、孤立症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在其他情况下和出于其他目的，这些可以视为可区分的类别。疾病通常不仅会影响个体的身体，还会影响情绪，因为感染和生活在许多疾病中会改变一个人对生活的看法和一个人的个性。

在本上下文中，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗性干预”涉及为了对抗疾病状况如疾病或病症的目的而管理和护理受试者。该术语旨在包括针对受试者所患的给定病症的全谱治疗，例如给药治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延迟疾病、病症或疾病状况的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、病症或疾病状况，以及预防疾病状况，其中预防理解为为了对抗疾病、疾病状况或病症而对个体进行管理和护理，并且包括给药活性化合物以预防症状或并发症的发作。

术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(增加)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体的疾病，阻止或减缓个体的疾病的发展，抑制或减缓个体的疾病的发展，降低个体症状的频率或严重性，和/或降低目前或以前患有疾病的个体中的复发。

术语“预防治疗”或“预防性治疗”涉及旨在防止个体发生疾病的任何治疗。术语“预防治疗”或“预防性治疗”在本文中可以互换使用。

术语“个体”和“受试者”在本文中可以互换使用。他们指人或其他哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类)，其可以患有或易患疾病或病症(例如癌症)，但可能或可能未患有疾病或病症。在许多实施方案中，个体为人。除非另有说明，术语“个人”和“受试者”不表示特定年龄，因此涵盖成人、老人、儿童和新生儿。在本公开的实施方案中，“个体”或“受试者”为“患者”。

术语“患者”指进行治疗的个体或受试者，特别是患病的个体或受试者。

在本公开的一实施方案中，目的在于提供免疫应答，其针对表达抗原的患病细胞(如表达肿瘤抗原的癌细胞)，以及治疗涉及表达抗原(如肿瘤抗原)的细胞的疾病(如癌症疾病)。

可以引发针对抗原的免疫应答，这可以是治疗性的，也可以是部分或完全保护性的。本文所述的药物组合物，适用于诱导或增强免疫应答。因此，本文所述的药物组合物可以用于涉及抗原的疾病的预防性和/或治疗性治疗。

如本文所用，“免疫应答”指对抗原或表达抗原的细胞的机体整体身体反应，并且指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。细胞免疫应答包括但不限于针对表达抗原的细胞的细胞应答。这样的细胞的特征可以在于在它们的细胞表面表达抗原或通过I类或II类MHC分子的呈递抗原。细胞应答与T淋巴细胞有关，T淋巴细胞可以归类为辅助性T细胞(也称为CD4+T细胞)，其通过调节免疫应答或杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、CD8+T细胞或CTL)发挥核心作用，诱导感染细胞或癌细胞的凋亡。在一实施方案中，给药本公开的药物组合物涉及刺激针对表达一种或多种肿瘤抗原的癌细胞的抗肿瘤CD8+T细胞应答。

本公开预期可以考虑保护性、预防性和/或治疗性的免疫应答。如本文所用，“诱导免疫应答”可以表示在诱导前不存在针对特定抗原的免疫应答，或者可以表示在诱导前存在针对特定抗原的基础水平的免疫应答，其在诱导后增强。因此，“诱导免疫应答”包括“增强免疫应答”。

术语“免疫疗法”涉及通过诱导或增强免疫应答来治疗疾病或疾病状况。

术语“疫苗接种”或“免疫接种”描述向个体给药抗原的过程，目的是诱导免疫应答，例如出于治疗或预防的动机。

在一实施方案中，本公开设想这样的实施方案，其中给药RNA制剂，例如本文所述的RNA颗粒。

因此，本公开涉及如本文所述的RNA，其用于涉及抗原的疾病，优选癌症疾病的预防性和/或治疗性治疗。

术语“巨噬细胞”指由单核细胞分化产生的吞噬细胞的亚群。由炎症、免疫细胞因子或微生物产物激活的巨噬细胞，通过水解和氧化攻击，非特异性地吞噬并杀死巨噬细胞内的外来病原体，导致病原体降解。降解的蛋白的肽展示在巨噬细胞表面，在那里它们可以被T细胞识别，并可以直接与B细胞表面的抗体相互作用，导致T细胞和B细胞活化，进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞类别。在一实施方案中，巨噬细胞为脾巨噬细胞。

术语“树突细胞”(DC)指属于抗原呈递细胞类别的另一种吞噬细胞亚型。在一实施方案中，树突细胞源自造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征在于高吞噬活性和低T细胞活化潜力。未成熟的树突细胞持续在周围环境中取样，寻找病原体，例如病毒和细菌。一旦它们与可呈递的抗原接触，它们就会被激活为成熟的树突细胞并开始迁移到脾或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白降解成小片段，并在成熟后使用MHC分子将这些片段呈现在其细胞表面。同时，它们上调在T细胞活化中作为共同受体的细胞表面受体，如CD80、CD86和CD40，大大增强了它们激活T细胞的能力。它们还上调CCR7，一种趋化受体，诱导树突细胞通过血流到达脾或通过淋巴系统到达淋巴结。在这里，它们充当抗原呈递细胞并通过向其呈递抗原以及非抗原特异性共刺激信号来激活辅助性T细胞和杀伤性T细胞以及B细胞。因此，树突细胞可以活跃地诱导与T细胞或B细胞相关的免疫应答。在一实施方案中，树突细胞为脾树突细胞。

术语“抗原呈递细胞”(APC)是能够在其细胞表面上(或在细胞表面处)展示、获取和/或呈递至少一种抗原或抗原片段的各种细胞的细胞。抗原呈递细胞可分为专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。

术语“专职抗原呈递细胞”涉及组成型表达与幼稚T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合物II类(MHC II类)分子的抗原呈递细胞。如果T细胞与抗原呈递细胞膜上的MHCII类分子复合物相互作用，抗原呈递细胞产生诱导T细胞活化的共刺激分子。专职抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。

术语“非专职抗原呈递细胞”涉及不组成性表达但在某些细胞因子(如干扰素-γ)刺激下表达MHC II类分子的抗原呈递细胞。示例性的非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。

“抗原加工”指将抗原降解为加工产物，其是所述抗原的片段(例如，蛋白降解为肽)以及这些片段中的一个或多个(例如，通过结合)与MHC的相互作用，用于由细胞呈递，例如向特定T细胞呈递抗原的细胞。

术语“涉及抗原的疾病”、“涉及表达抗原的细胞的疾病”或类似术语指涉及抗原的任何疾病，例如，特征在于存在抗原的疾病。疾病可以为感染性病或癌症疾病，或仅仅是癌症。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原。优选地，涉及抗原的疾病为涉及表达抗原的细胞的疾病，优选在细胞表面上。

术语“感染性疾病”指可以在个体与个体之间或在生物体与生物体之间传播并且由微生物物质引起的任何疾病(例如普通感冒)。感染性疾病是本领域已知的，并且包括例如病毒疾病、细菌疾病或寄生虫疾病，其分别由病毒、细菌和寄生虫引起。在这方面，感染性疾病可以是例如肝炎、性传播疾病(例如衣原体或淋病)、肺结核、HIV/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、严重急性呼吸道疾病综合症(SARS)、禽流感和流感。

术语“癌症疾病”或“癌症”指或描述个体的生理状况，其通常特征在于不受调节的细胞生长。癌症的实例包括但不限于肿瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体地，这样的癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性与生殖器官癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经外胚层癌、脊髓轴肿瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤。根据本公开的术语“癌症”还包括癌症转移。

由于产生的协同效果，癌症治疗中的联合策略可以是期望的，这可以比单一治疗方法的影响更强。在一实施方案中，药物组合物与免疫治疗剂一起给药。如本文所用，“免疫治疗剂”涉及可以参与激活特定免疫应答和/或免疫效应子功能的任何物质。本公开考虑使用抗体作为免疫治疗剂。不希望受理论束缚，抗体能够通过各种机制实现针对癌细胞的治疗效果，包括诱导凋亡、阻断信号转导途径的组分或抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，抗体为单克隆抗体。单克隆抗体可以经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)诱导细胞死亡，或结合补体蛋白，导致直接细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(CDC)。可与本公开联合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标(在括号中)的非限制性实例包括：阿巴伏单抗(Abagovomab)(CA-125)、阿昔单抗(Abciximab)(CD41)、阿德木单抗(Adecatumumab)(EpCAM)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)(CD20)、培戈-阿拉赛珠单抗(Alacizumab pegol)(VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomab pentetate)(CEA)、阿麦妥单抗(Amatuximab)(MORAb-009)、马安莫单抗(Anatumomab mafenatox)(TAG-72)、阿泊珠单抗(Apolizumab)(HLA-DR)、阿西莫单抗(Arcitumomab)(CEA)、阿替利珠单抗(Atezolizumab)(PD-L1)、巴维昔单抗(Bavituximab)(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(Bectumomab)(CD22)、贝利木单抗(Belimumab)(BAFF)、贝伐单抗(Bevacizumab)(VEGF-A)、Bivatuzumab mertansine(CD44v6)、博纳吐单抗(Blinatumomab)(CD 19)、维布妥昔单抗(Brentuximab vedotin)(CD30TNFRSF8)、莫坎妥珠单抗(Cantuzumab mertansin)(黏蛋白(mucin)CanAg)、雷坎妥组单抗(Cantuzumab ravtansine)(MUC1)、卡罗单抗喷地肽(Capromab pendetide)(前列腺癌细胞)、卡芦单抗(Carlumab)(CNT0888)、卡妥索单抗(Catumaxomab)(EpCAM、CD3)、西妥昔单抗(Cetuximab)(EGFR)、泊西他组单抗(Citatuzumab bogatox)(EpCAM)、西妥木单抗(Cixutumumab)(IGF-1受体)、Claudiximab(紧密连接蛋白)、泰坦-克利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)(MUC1)、可那木单抗(Conatumumab)(TRAIL-R2)、达西珠单抗(Dacetuzumab)(CD40)、Dalotuzumab(胰岛素样生长因子I受体)、地舒单抗(Denosumab)(RANKL)、地莫单抗(Detumomab)(B-淋巴瘤细胞)、曲齐妥单抗(Drozitumab)(DR5)、依美昔单抗(Ecromeximab)(GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(Edrecolomab)(EpCAM)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)(SLAMF7)、依那妥组单抗(Enavatuzumab)(PDL192)、恩妥昔单抗(Ensituximab)(NPC-1C)、依帕珠单抗(Epratuzumab)(CD22)、厄妥索单抗(Ertumaxomab)(HER2/neu、CD3)、埃达组单抗(Etaracizumab)(整合素ανβ3)、法妥组单抗(Farletuzumab)(叶酸受体1)、FBTA05(CD20)、非拉妥组单抗(Ficlatuzumab)(SCH 900105)、芬妥木单抗(Figitumumab)(IGF-1受体)、法兰妥单抗(Flanvotumab)(糖蛋白75)、非苏木单抗(Fresolimumab)(TGF-β)、加利昔单抗(Galiximab)(CD80)、加尼妥单抗(Ganitumab)(IGF-I)、吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)(CD33)、吉伏组单抗(Gevokizumab)(ILΙβ)、吉妥昔单抗(Girentuximab)(碳酸酐酶9(CA-IX))、Glembatumumab vedotin(GPNMB)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)(CD20)、艾芦库单抗(Icrucumab)(VEGFR-1)、Igovoma(CA-125)、雷英妥昔单抗(Indatuximab ravtansine)(SDC1)、英妥木单抗(Intetumumab)(CD51)、奥英妥珠单抗(Inotuzumab ozogamicin)(CD22)、伊匹单抗(Ipilimumab)(CD152)、伊妥木单抗(Iratumumab)(CD30)、拉贝妥珠单抗(Labetuzumab)(CEA)、来沙木单抗(Lexatumumab)(TRAIL-R2)、利韦单抗(Libivirumab)(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(Lintuzumab)(CD33)、莫星-洛沃妥珠单抗(Lorvotuzumab mertansine)(CD56)、卢卡木单抗(Lucatumumab)(CD40)、鲁昔单抗(Lumiliximab)(CD23)、马帕木单抗(Mapatumumab)(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(Matuzumab)(EGFR)、美泊利单抗(Mepolizumab)(IL5)、米拉组单抗(Milatuzumab)(CD74)、米妥莫单抗(Mitumomab)(GD3神经节苷脂)、莫格利珠单抗(Mogamulizumab)(CCR4)、Moxetumomab pasudotox(CD22)、他那可单抗(Nacolomabtafenatox)(C242 antigen)、埃托-那普妥莫单抗(Naptumomab estafenatox)(5T4)、Namatumab(RON)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(EGFR)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)(EGFR)、纳武利尤单抗(Nivolumab)(IgG4)、奥法木单抗(Ofatumumab)(CD20)、奥拉木单抗(Olaratumab)(PDGF-R a)、奥那妥组单抗(Onartuzumab)(人分散因子受体激酶)、Oportuzumab monatox(EpCAM)、奥戈伏单抗(Oregovomab)(CA-125)、奥塞芦单抗(Oxelumab)(OX-40)、帕尼单抗(Panitumumab)(EGFR)、Patritumab(HER3)、Pemtumoma(MUC1)、帕妥珠单抗(Pertuzuma)(HER2/neu)、平妥莫单抗(Pintumomab)(腺癌抗原)、普利木单抗(Pritumumab)(波形蛋白(vimentin))、雷妥莫单抗(Racotumomab)(N-羟乙酰神经氨酸)、雷曲妥单抗(Radretumab)(纤连蛋白额外结构域-B)、雷韦单抗(Rafivirumab)(狂犬病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)(VEGFR2)、利妥木单抗(Rilotumumab)(HGF)、利妥昔单抗(Rituximab)(CD20)、罗妥木单抗(Robatumumab)(IGF-1受体)、沙马组单抗(Samalizumab)(CD200)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)(FAP)、塞妥昔单抗(Siltuximab)(IL6)、他贝芦单抗(Tabalumab)(BAFF)、Tacatuzumab tetraxetan(α-胎蛋白)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)(CD 19)、替妥莫单抗(Tenatumomab)(腱生蛋白C)、替妥木单抗(Teprotumumab)(CD221)、Ticilimumab(CTLA-4)、替加组单抗(Tigatuzumab)(TRAIL-R2)、TNX-650(IL13)、托西莫单抗(Tositumomab)(CD20)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)(HER2/neu)、TRBS07(GD2)、曲美木单抗(Tremelimumab)(CTLA-4)、西莫白介素单抗(Tucotuzumabcelmoleukin)(EpCAM)、Ublituximab(MS4A1)、Urelumab(4-1BB)、伏洛昔单抗(Volociximab)(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(Votumumab)(肿瘤抗原CTAA 16.88)、扎鲁木单抗(Zalutumumab)(EGFR)和Zanolimumab(CD4)。

本文引用的文件和研究并不意图承认上述任何一项是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有声明均基于申请人可获得的信息，但并不构成对这些文件内容正确性的任何承认。

提供以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用各种实施方案。对具体设备、技术和应用的描述仅作为示例提供。对本文描述的实例的各种修改对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的，并且在不脱离各种实施方案的精神和范围的情况下，本文定义的一般原理可以应用于其他实例和应用。因此，各种实施方案并不意图限于本文描述和示出的实例，而是符合与权利要求一致的范围。

实施例

方法

动物

C57BL/6BrdCrHsd-Tyr^c小鼠购自Envigo Labs。在整个实验中使用年龄(8-10周龄)和性别(雄性或雌性)匹配的动物。使同系的C57Bl/6-Thy1.1小鼠在BioNTech AG,Germany的动物设施中繁殖。

CAR构建体/CAR T细胞

γ-逆转录病毒自灭活(SIN)载体pES.12-6用于，在内部真核启动子(人延伸因子1-α启动子短的无内含子形式(EFS–213/+31))的控制下，在鼠T细胞中稳定过表达CLDN6-CAR-BBz-T2A-Luc-T2A-GFP。载体骨架在5'和3'-LTR以及包装区域(psi和psi+)处包含R-和U5-区域的MLV野生型序列。消除3'-LTR的U3区中的增强子元件(包括CAAT-Box)，并突变TATA-Box序列以防止转录起始。土拨鼠肝炎病毒(WHV)的转录后调控元件(PRE)的截短形式用于防止不想要的病毒蛋白的表达。CLDN6-CAR-BBz包含人IgG的信号肽(SEQ ID NO:12)，Claudin6特异性抗体IMAB206(Ganymed Pharmaceuticals)的单链Fv片段，在重链(V_H)(SEQID NO:13)和轻链(V_L)(SEQ ID NO:15)之间具有(G₄S)₃接头(SEQ ID NO:14)，并且在V_L的46位具有半胱氨酸至丝氨酸的取代。ScFv片段与人CD8α铰链和跨膜区(SEQ ID NO:16)融合，然后是人4-1BB(SEQ ID NO:17)和人CD3ζ(Q14K)(SEQ ID NO：18)信号传导部分。CAR与T2A核糖体跳跃元件(SEQ ID NO:19)连接到有效的萤火虫荧光素酶(SEQ ID NO:20)以及eGFP(SEQ ID NO:21)，使得能够在转导的T细胞中等摩尔产生指定的蛋白。

逆转录病毒基因操作和用于过继性T细胞转移的CAR T细胞的制备

使用Dynabeads^TM Mouse T-Activator CD3/CD28，以1:1的珠与T细胞比例(Invitrogen)，在5ng/mL重组人(rh)IL-7和5ng/mL rh IL-15(Miltenyi Biotec)的存在下，分离并预激活幼稚C57Bl/6-Thy1.1⁺的脾细胞。对于鼠细胞的转导，根据制造商的说明书(Takara Bio Inc.,Otsu,Japan)，将MLV-E假型逆转录病毒上清加载到RetroNectin(2μg/cm²)包被的非组织培养处理的孔板上，其中病毒加载和离心(1,300xg，15℃，15min)的重复循环3次以增加结合。预激活后24h，将0.5-0.6x10^6个细胞/cm²离心(300xg，37℃，1h)到病毒颗粒包被的孔中。过夜培养后，用新鲜病毒颗粒包被的平板重复降速(spin-down)转导。预激活后72h，从培养物中去除Dynabeads^TM Mouse T-Activator CD3/CD28，并在5ng/mL rh IL-7和5ng/mL rh IL-15存在下，扩增细胞。Ficoll清洗后，用PBS清洗细胞两次以去除血清蛋白，然后准备进行过继细胞性转移(ACT)。基于pES12.6的逆转录病毒载体包含OT1-TCR或CLDN6-CAR编码的以及增强的萤火虫荧光素酶(effLuc；Rabinovich et al.(2008)PNAS 105(38):14342-6)和eGFP(增强型绿色荧光蛋白)报告基因，其使用2A剪接元件(Szymczak et al.(2004)Nat Biotechnol.22(5):589-94)分别表达用于转导。

体外转录(IVT)mRNA的产生

编码细胞因子-白蛋白融合蛋白的mRNA的体外转录基于pST4-T7-GG-TEV-MCS-FI-A30LA70质粒骨架和衍生DNA构建体。这些质粒构建体包含烟草蚀刻病毒(TEV)的5'前导序列、3'Fl元件(其中F是136个核苷酸长度的3'-UTR片段的氨基末端分裂增强子，mRNA和I是142个核苷酸长度的线粒体编码的12S RNA的片段，均在人中鉴定；WO 2017/060314)和100个核苷酸的聚(A)尾，在70个核苷酸后有接头。细胞因子和白蛋白编码序列源自小家鼠(Musmusculus)，并且在所产生的氨基酸序列中没有引入变化(小鼠(m)IL-2，SEQ ID NO:5；mIL-7，SEQ ID NO:6；和mIL-21，SEQ ID NO:7)。编码的蛋白配备有N端信号肽(SP)，其是N端部分的天然SP。仅保留N端部分的SP，对于其他部分，仅编码成熟部分(不含SP的蛋白)。终止密码子仅保留在最C端部分。构建体中的白蛋白和细胞因子部分由编码甘氨酸和丝氨酸残基的30个核苷酸长度的接头序列隔开。所用白蛋白-细胞因子融合蛋白的方向如下：白蛋白-接头-mIL2(从N到C端连续的SEQ ID NO:8、9和10)、mIL7-接头-白蛋白(从N到C端连续的SEQID NO:6、9和11)和mIL21-接头-白蛋白(从N到C端连续的SEQ ID NO:7、9和11)。编码抗原的mRNA的体外转录基于pST1-T7-GG-hAg-MCS-2hBg-A30LA70质粒骨架和衍生DNA构建体。这些质粒构建体，除了全长人CLDN6或鸡卵清蛋白表位SIINFEKL(OvaI；额外带有两侧的3’Sec和5’TM1–如Kreiter et al(2008)J Immunol.180(1):309-18所述的序列)，包含5'人α-珠蛋白、两个连续的3'人β-珠蛋白UTR和100个核苷酸的poly(A)尾，在70个核苷酸后有接头。如Holtkamp S.et al.(2006)Blood 108(13):4009-17所述，通过体外转录产生编码抗原和细胞因子的mRNA。后者通过用1-甲基-假尿苷取代正常核苷尿苷进行额外修饰。由此产生的细胞因子mRNA配备有Cap1结构，并且双链(dsRNA)分子通过纤维素纯化而去除。纯化的mRNA在H₂O中洗脱并储存在-80℃下直至进一步使用。所有描述的mRNA构建体的体外转录均在BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH进行。

脂质体配制的编码抗原的IVT RNA(RNA_(LIP))的产生

先前在Kranz et al(2016)Nature 534(7607):396-401中描述了编码抗原的IVTRNA与脂质体的复合。使用的阳离子DOTMA和RNA的电荷比为1.3:2。除了DOTMA，脂质部分确实包含摩尔比为2:1的DOTMA/DOPE的辅助脂质DOPE。

小鼠实验

将5x10^6个γ-逆转录病毒转导的CAR或TCR同系的Thy1.1⁺T细胞以200μL静脉内(i.v.)转移到免疫活性或中度全身照射(2.5Gy–XRAD320)的C57BL/6BrdCrHsd-Tyr^c供体小鼠中。随后，在ACT后的不同时间点，用F12:RNA比例为1.3:2的编码抗原的RNA_(LIP)对小鼠进行静脉内(i.v.)疫苗接种。在指定的时间点，用1μg的TransIT(Mirrus)配制的核苷修饰的编码鼠白蛋白-细胞因子融合蛋白的mRNA或仅缓冲液重复处理小鼠。在指定的时间点进行外周血捐献和全身生物发光成像。

体内荧光素酶成像(BLI)

利用IVIS Lumina成像系统(Caliper Life Sciences)，通过体内生物发光成像对CAR或TCR-effLuc-GFP转导的T细胞的扩增和分布进行评估。简言之，在转导的T细胞过继性转移后的指定时间点，i.p.注射D-荧光素水溶液(80mg/kg体重；Perkin Elmer)。5min后，对发射的光子进行量化(积分时间为1min，像素合并为8)。使用IVIS Living Image 4.0软件，将关注区域(ROI)中的体内生物发光量化为总通量(光子/秒)。源自动物体内表达荧光素酶的细胞的透射光强度以灰度图像表示，其中黑色是强度最低的，而白色到深灰色是最强的生物发光信号。在LED弱光照明下获得小鼠的灰度参考图像。使用Living Image 4.0软件叠加图像。

实施例1：选定的延长药代动力学的γ链细胞因子(IL-2/7)在抗原接触时导致体内CAR T细胞重复扩增

通常，需要存在某种细胞因子环境来维持T细胞在抗原接触时的持久性。已经证实，γ链细胞因子(例如IL-2和IL-7)增强T细胞的增殖和存活(例如，Blattman et al.(2003)Nat.Med.9(5):540-7,Fry et al.(2001)Trends Immunol.22(10):564-71,Bradleyet al.(2005)Trends Immunol.26(3):172-6,Jiang et al.(2005)Cytokine GrowthFactor Rev.16(4-5):513-33)。然而，重组细胞因子(例如IL-2)的使用受到其半衰期短以及剂量依赖性毒性的限制(Vial et al.(1992)Drug Saf.7(6):417-33)。为了克服对过继性转移的T细胞的有限细胞因子支持，开发了编码细胞因子-白蛋白融合蛋白的mRNA构建体的，并且确实可以在全身给药后显著增加体内编码的细胞因子的血清半衰期。当细胞因子-白蛋白构建体在核苷修饰的mRNA上编码时，它们的全身可用性会延长。

因此，我们关注脂质体配制的TAA的组合(例如编码CLDN6的RNA(RNA_(LIP))(其选择性地靶向次级淋巴器官中的APC)和选择的细胞因子支持是否可以导致CAR-T细胞在体内充分重复扩增和持续存在。

为了测试这个概念，将γ-逆转录病毒转导的CLDN6-CAR T细胞过继性转移到中度照射(2.5Gy)或免疫活性小鼠(分别为图1和图2)。为了在体内可视化那些鼠CLDN6-CAR T细胞的扩增和命运，我们利用在编码CLDN6 CAR的相同逆转录病毒载体上但由病毒T2A序列分隔的荧光素酶和GFP报告基因的共表达(图1A)。值得注意的是，CAR转导的鼠T细胞中荧光素酶和GFP的共表达不显著影响CLDN6-CAR的表面表达和抗原特异性(数据未显示)。

中度照射(2.5Gy，XRAD320)的白化C57Bl/6小鼠移植有5x10⁶CLDN6-CAR-报告基因转导的大量同系Thy1.1⁺鼠T细胞(约2.5x10⁸个细胞/kg体重)。将20μg编码CLDN6或对照的RNA配制入脾靶向脂质体，并在过继性CAR-T转移后1天静脉注射到入小鼠。伴随CLDN6RNA_(LIP)-疫苗接种，小鼠腹腔内接受配制在TransIT(1μg/细胞因子RNA)中的编码白蛋白偶联的鼠IL-2和鼠IL-7的mRNA或模拟对照(缓冲液)。7天后重复处理。在指定的时间点，通过每只小鼠腹膜内给药1.66mg的D-荧光素溶液在体内跟踪CAR-T的扩增和生物分布。ACT后24小时，已经在脾中发现大部分CAR-T细胞。在ACT后第4天的生物发光中检测到，在没有细胞因子(模拟)的情况下，通过仅用CLDN6-RNA_(LIP)处理诱导CAR-T细胞增加约21倍(与第1天相比)。与第1天测量的基线发光相比，CLDN6-RNA_(LIP)的第二次增强在第11天仍产生高15倍的发光强度。当共给药TransIT配制的编码白蛋白融合IL-2和IL-7的mRNA时，CAR T细胞的扩增能力显著增加。CAR-T细胞在第一次RNA_(LIP)处理后可以实现75倍的扩增，并且第二次CLDN6 RNA_(LIP)处理甚至提高达114倍(图1C&D)。在接受CLDN6-CAR T细胞的小鼠中，用单独的编码CLDN6的RNA_(LIP)或联合编码细胞因子-白蛋白的RNA处理后观察到这种效果，但在接受编码OvaI的对照RNA_(LIP)的各自的对照组中未观察到这种效果，无论存在或不存在编码细胞因子-白蛋白的RNA。这些数据表明，CAR-T细胞可以在中度照射的小鼠中以高度抗原特异性的方式成功地原位扩增。

在证明了在编码细胞因子的RNA存在的情况下，可以使用编码各自抗原的RNA_(LIP)在中度照射的小鼠中在原位重复扩增CAR T细胞后，我们研究了这种效果是否也可以在免疫活性的宿主中实现。然而，淋巴去除有几个缺点，包括众所周知的副作用和与化疗相关的风险，如潜在的感染和败血症(Brentjens et al.(2010)Mol Ther.18(4):666-8&Robbinset al.(2015)Clin Cancer Res.21(5):1019-27)。此外，在在靶(on-target)和/或脱靶毒性的情况下，过继性转移的CAR-T细胞的快速扩增可能是致命的(Morgan et al.(2010)MolTher.18(4):843-51)。为此目的，将CLDN6-CAR转导的鼠Thy1.1⁺T细胞移植的未照射的白化C57Bl/6小鼠按上述方法进行处理(图2A)。与接受缓冲液(模拟)而非TransIT配制的编码细胞因子-白蛋白的RNA的对照组相比，在第一轮刺激期间，全身存在IL-2和IL-7对CLDN6-RNA_(LIP)疫苗接种后，CLDN6-CAR T细胞的扩增没有显著影响(第4天：扩增指数：模拟192倍和IL-2/7：223倍)。然而，在不存在IL-2/7细胞因子的情况下，CAR T细胞群在第一次CLDN6RNA_(LIP)介导的扩增后强烈收缩，并且无法再次扩增。只有在编码IL-2/IL-7-白蛋白的RNA的存在下，CLDN6-CAR T细胞才能在免疫活性小鼠中重复扩增并持续数天(第11天：扩增指数：模拟：0.5倍和IL-2/7：79倍)(图2B+C)。

这些数据强烈支持使用RNA_(LIP)技术直接在患者体内控制CAR-T细胞扩增是可行的想法，但为了持久性，细胞需要有利的细胞因子环境，例如IL-2和IL-7，这可以通过给药编码延长的药代动力学γ链细胞因子的RNA来实现。

实施例2：CAR T细胞重复扩增过程中细胞因子白蛋白融合的最优组合

由于几个γ链细胞因子积极支持T细胞存活并以抗原特异性方式支持T细胞的治疗效果(例如，Markley et al.(2010)Blood 115(17):3508-19,He et al.(2006)J TranslMed.4:24.)，我们比较了核苷修饰的编码mIL-2、mIL-7、mIL-21以及IL-2/7和IL-2/21的组合的RNA在促进体内CAR修饰的T细胞对重复RNA_(LIP)处理的增殖和持久性的支持效果。

以与实施例1所述类似的方式，用脂质体配制的编码hCLDN6或对照的RNA疫苗接种移植有CLDN6-CAR-报告基因转导的T细胞的中度照射的白化C57Bl/6小鼠，同时用配制在TransIT(1μg/细胞因子RNA)中的编码鼠白蛋白偶联的mIL-2、mIL-7的RNA、编码mIL-21的mRNA或编码鼠白蛋白的RNA(Alb对照)处理。抗原/细胞因子混合物(cocktail)以一周的间隔给药(图3A)。在CAR T细胞体内扩增达到峰值时(通常在基于RNA的处理后2-3天后达到)，分析生物发光强度(图3B)。与白蛋白对照相比，IL-7和IL-21单独的全身存在导致重复RNA_(LIP)处理后抗原特异性CART扩增能力降低。与基线相比，IL-2联合处理导致达164倍的CAR T细胞扩增。然而，仅当IL-2RNA分别与IL-7(第3轮扩增后达214倍的增加)或IL-21(第3轮扩增后达141倍的增加)共给药时，才能实现CAR T细胞的体内积累。除了CAR T细胞在体内的积累能力外，过继性转移的肿瘤反应性T细胞疗法的临床成功也与那些细胞在体内的持久性正相关(Robbins et al.(2004)J Immunol.173(12):7125-30,Huang et al.(2005)28(3):258-67)。因此，我们在存在IL-7(图3C)或存在IL-21((图3D)的情况下，单独或与IL-2组合，使用生物发光分析了3轮抗原特异性扩增后CART T细胞的收缩(contraction)。而当仅存在白蛋白、IL-2或IL-7时，CAR T细胞群在第3次CLDN6 RNA_(LIP)后不久就收缩。然而，只有IL-2和IL-7的组合才能增加抗原撤除后CLDN6 CAR T细胞的减速收缩(图3C)。这种效果在IL-2和IL-21-RNA共同处理的小鼠中更加明显(图3D)。

总体而言，这些结果表明，全身给药编码IL-2的核苷修饰的RNA，并结合IL-7和IL-21，可以体内增加CAR T细胞在抗原特异性刺激下的高度抗原依赖性积累和CAR T细胞的延长的持续性。

序列表

<110> 生物技术细胞和基因治疗公司

<120> 涉及CAR工程化的T细胞和细胞因子的治疗

<130> 674-244 PCT2

<150> PCT/EP2019/053144

<151> 2019-02-08

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 2

<211> 152

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu

1 5 10 15

Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser

20 25 30

Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp

35 40 45

Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg

50 55 60

Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu

65 70 75 80

Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val

85 90 95

Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser

100 105 110

Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu

115 120 125

Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys

130 135 140

Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His

145 150

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile

1 5 10 15

Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu

20 25 30

Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser

35 40 45

Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu

50 55 60

Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser

65 70 75 80

Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys

85 90 95

Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys

100 105 110

Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His

115 120 125

Gly Ser Glu Asp Ser

130

<210> 4

<211> 585

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 5

<211> 169

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 5

Met Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu

1 5 10 15

Leu Val Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala

20 25 30

Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu

35 40 45

Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn

50 55 60

Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu

65 70 75 80

Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu

85 90 95

Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe

100 105 110

Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val

115 120 125

Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp

130 135 140

Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys

145 150 155 160

Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln

165

<210> 6

<211> 154

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 6

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Glu Cys His Ile Lys Asp Lys

20 25 30

Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu

35 40 45

Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asn Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn

50 55 60

Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu

65 70 75 80

Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser

85 90 95

Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr

100 105 110

Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys

115 120 125

Lys Asn Asp Ala Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr

130 135 140

Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile

145 150

<210> 7

<211> 146

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 7

Met Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val Ile Phe Leu Gly Thr Val

1 5 10 15

Ala His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu

20 25 30

Arg His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp

35 40 45

Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys

50 55 60

Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser

65 70 75 80

Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln Leu

85 90 95

Arg Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His Ile

100 105 110

Ala Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu

115 120 125

Phe Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His

130 135 140

Leu Ser

145

<210> 8

<211> 608

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 8

Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Val Ser Gly Ser Ala

1 5 10 15

Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala

50 55 60

Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala

130 135 140

Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly

145 150 155 160

His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys

180 185 190

Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly

195 200 205

Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys

210 215 220

Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr

245 250 255

Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp

290 295 300

Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp

305 310 315 320

Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp

325 330 335

Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu

385 390 395 400

Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys

405 410 415

Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu

450 455 460

Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile

465 470 475 480

Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu

530 535 540

Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala

565 570 575

Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe

580 585 590

Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala

595 600 605

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GS接头

<400> 9

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 10

<211> 149

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 10

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln

1 5 10 15

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu

20 25 30

Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu

35 40 45

Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu Pro Lys Gln Ala

50 55 60

Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu

65 70 75 80

Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp

85 90 95

Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys

100 105 110

Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr

115 120 125

Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys Gln Ser Ile Ile

130 135 140

Ser Thr Ser Pro Gln

145

<210> 11

<211> 584

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 11

Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu

65 70 75 80

Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu

100 105 110

Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys

115 120 125

Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln

145 150 155 160

Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser

165 170 175

Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser

180 185 190

Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro

210 215 220

Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His

275 280 285

Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala

290 295 300

Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys

340 345 350

Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala

355 360 365

Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg

420 425 430

Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys

435 440 445

Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser

465 470 475 480

Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val

565 570 575

Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala

580

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 12

Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser

<210> 13

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 13

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Gly Phe Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GS接头

<400> 14

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 15

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Ser Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala

100 105 110

<210> 16

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CD8铰链和跨膜结构域

<400> 16

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

65

<210> 17

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人4-1BB信号传导结构域

<400> 17

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CD3zeta信号传导结构域

<400> 18

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A元件

<400> 19

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 20

<211> 550

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 有效萤火虫荧光素酶

<400> 20

Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro

1 5 10 15

Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg

20 25 30

Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu

35 40 45

Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala

50 55 60

Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val

65 70 75 80

Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu

85 90 95

Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg

100 105 110

Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val

115 120 125

Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro

130 135 140

Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly

145 150 155 160

Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe

165 170 175

Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile

180 185 190

Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val

195 200 205

Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp

210 215 220

Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val

225 230 235 240

Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu

245 250 255

Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu

260 265 270

Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val

275 280 285

Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr

290 295 300

Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser

305 310 315 320

Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile

325 330 335

Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr

340 345 350

Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe

355 360 365

Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val

370 375 380

Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly

385 390 395 400

Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly

405 410 415

Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe

420 425 430

Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln

435 440 445

Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile

450 455 460

Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu

465 470 475 480

Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys

485 490 495

Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu

500 505 510

Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly

515 520 525

Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys

530 535 540

Gly Gly Lys Ile Ala Val

545 550

<210> 21

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> eGFP

<400> 21

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 表位

<400> 22

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5