人α干扰素亚型及受体结合相关位点突变体在制备防治新型冠状病毒感染药物中的用途
阅读说明：本技术 人α干扰素亚型及受体结合相关位点突变体在制备防治新型冠状病毒感染药物中的用途 (Application of human alpha interferon subtype and receptor binding related site mutant in preparation of novel coronavirus infection prevention and treatment medicines ) 是由 袁正宏 陈捷亮 于 2020-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明属医药和生物工程学技术领域,涉及防治新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染药物,具体涉及人类α干扰素及受体结合相关位点突变体在制备防治新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染药物和制剂中的用途。本发明通过对IFN-α2结合IFNAR1的位点第82、86、89和120位进行突变,经体外新冠病毒感染模型试验鉴定显示人α干扰素受体结合相关位点突变体IFN-α2-EIFK较IFN-α2具有更强的抗病毒活性,且在抗病毒浓度下无细胞毒效应。本发明所述的IFN-α14和IFN-α2受体结合相关位点突变体--IFN-α2-EIFK可进一步用于制备抗新型冠状病毒药物和制剂。(The present invention belongs to the field of medicine and biological engineering technology, and relates to medicine for preventing and treating SARS-CoV-2 infection, and is especially the use of human alpha interferon and receptor binding site mutant in preparing medicine and preparation for preventing and treating SARS-CoV-2 infection. The invention shows that the human alpha interferon receptor binding related site mutant IFN-alpha 2-EIFK has stronger antiviral activity than IFN-alpha 2 and has no cytotoxic effect under the antiviral concentration through carrying out mutation on the 82 th, 86 th, 89 th and 120 th sites of IFN-alpha 2 binding IFNAR1 through in vitro new coronavirus infection model test identification. The IFN-alpha 14 and IFN-alpha 2 receptor binding associated site mutant-IFN-alpha 2-EIFK can be further used for preparing anti-novel coronavirus medicaments and preparations.)
技术领域
本发明属医药和生物工程学
技术领域
，涉及防治新型冠状病毒感染药物制剂，具体涉及 人类α干扰素及受体结合相关位点突变体在制备防治新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染药物 和制剂中的用途。背景技术
据流行病学调查显示，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)主要通过近距离空气飞沫和密切接触 传播，感染者以发然、发力、干咳为主要表现，重症者约占两成，可出现呼吸困难和或/低 氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒 和出凝血功能障碍，病死率约3％。人群普遍对SARS-CoV-2易感，其传染性较强。如何对重 点人群，尤其医护人员、与确诊病人密切接触者、无症状或轻度感染者进行应急保护干预， 成为疫情防控的关键环节之一。此外，目前对于新型冠状病毒感染所致疾病尚缺乏特异治疗 方法，主要根据患者临床情况进行对症支持治疗，国家卫健委《新型冠状病毒感染的肺炎疹 疗方案》中指出可采用IFN-α雾化吸入作为治疗干预手段，但就干扰素对新冠病毒真正的 抗病毒效能并不甚清楚。
现有技术公开了干扰素(Interferon,IFN)是一类由自身基因组编码的细胞因子，因 具有干扰病毒感染复制的效应而得名，在人体抗病毒免疫应答中发挥有核心作用。已知干扰 素可通过与机体细胞的表面受体结合，进而启动下游信号通路，诱生机体产生一系列抗病毒 蛋白分子。这些分子能够切断病毒核酸、抑制病毒蛋白合成、抑制病毒的装配，从而抑制病 毒复制，具有早期限制病毒在感染细胞内的复制播散以及保护未被感染细胞抵抗病毒入侵的 作用。此外，干扰素还具有强大的免疫调节功能，能够激活自然杀伤细胞、巨噬细胞等免疫 细胞，增强宿主的免疫防御功能。根据结合受体不同，IFN可分为不同型别，I型(IFN- I)、II型(IFN-II)和III型(IFN-λ)，其功能各异：I型干扰素包括IFN-α，-β，ω 等，主要由被感染的细胞和一些专职细胞产生，对病毒感染早期过程中的复制和播散具有限 制作用，是宿主抗病毒天然免疫应答的重要组成部分；II型干扰素仅IFN-γ一种，主要由 自然杀伤(natural killer,NK)细胞、NKT细胞和T细胞等合成分泌，与启动宿主抗病 毒适应性免疫应答有关。IFN-α作为干扰素系统中最大的一类，自身还包括多种亚型，有 13种人类IFN-α亚型被陆续鉴定，包括α1、α2a/2b、α4、α1、α5、α6、α7、α8、 α10、α13、α14、α16、α17、α21等，它们的编码基因均位于人9号染色体，各亚型 α干扰素间具有较多相似的结构域，但有30％左右序列为非保守。目前只有干扰素α2a/2b 自上世纪八十年代以来被批准用于临床治疗慢性乙肝病毒感染等病毒感染所致疾病，可获得 普通抗病毒药物治疗所不能达到的治愈率。
已知干扰素通过特异性结合到细胞表面的干扰素素受体启动下游JAK-STAT信号通路的 转导进而诱导干扰素刺激基因(ISGs)的转录表达而发挥抗病毒作用。有研究表明，虽然不 同亚型IFN-α均通过与I型干扰素受体的两个亚基IFNAR1和IFNAR2结合而发挥作用，但 由于与两受体亚基的结合亲和力各异，各亚型IFN-α激活下游经典或旁路信号通路的方式 及程度存在差异。有研究通过对干扰素及其受体亲和力试验发现，IFN-α通常对IFNAR2的 结合力高而对IFNAR1的结合力低，其中IFN-α2氨基酸序列中与IFNAR1和IFNAR2结合相 关的氨基酸位点已被基本解析，为改造优化相关干扰素亚型的受体亲和力和生物学效应提供 了基础。有关针对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)以及严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)的体外研究发现，IFN-α以及IFN-β滴鼻给药对SARS和MERS冠状病毒感染 等有抑制效果。上述研究支持干扰素在新冠病毒感染防治中的潜在应用，但何种干扰素亚型 具有最高效的抗新冠病毒效果、以及可否通过对现有干扰素型别进行突变改造从而提升其抗 新冠病毒效果尚不清楚。
基于现有技术的基础与现状，本申请的发明人拟提供防治新型冠状病毒感染药物制剂， 具体涉及人类α干扰素及受体结合相关位点突变体在制备防治新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 感染药物和制剂中的用途。
发明内容
本发明目的是基于现有技术的基础与现状，提供防治新型冠状病毒感染药物制剂，具体 涉及人类α干扰素及受体结合相关位点突变体在制备防治新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染 药物和制剂中的用途。
本发明提供了IFN-α2干扰素受体结合相关位点突变体的用途，通过比较不同型别的人 干扰素抗新冠病毒效应的差异，确证干扰素具有抗新冠病毒效应，并且筛选鉴定相较目前临 床所使用的IFN-α2a和IFN-α2b抗新冠病毒效应更强的人干扰素亚型；通过突变特定人 IFN-α2与干扰素受体1亚基相互作用位点的氨基酸，提升其抗新冠病毒效应。本发明为开 发基于新型IFN亚型和IFN-α2改造突变体的新型防治新冠病毒的手段奠定基础。
本发明经试验研究显示，临床已批准的干扰素亚型IFN-α2a和IFN-α2b具有抗新冠病 毒感染功能；不同IFN亚型抗新冠病毒效应存在不同，其中同等作用浓度下IFN-α14抗新冠病毒感染的效果最为显著；此外，将IFN-α2上4个与IFNAR1结合相关的氨基酸位点突 变为编码IFN-α14相应位点氨基酸，显示其具有类似IFN-α14的抗新冠病毒效果。
本发明采用基于Vero-E6细胞的新冠病毒感染模型，对重组表达的若干人类IFN型别进 行抗新冠病毒效应的筛选比较，研究纳入的代表性人干扰素亚型包括临床批准的IFN-α2a 和IFN-α2b，以及IFN-α1、IFN-α14、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω和IFN-λ1(IL-29)，结果显示，所述的临床批准使用的IFN-α2a和IFN-α2b抗新冠病毒效应较为接近，多种其它 IFN亚型具有更强的抗新冠病毒效果，具体抗新冠病毒活性排序为IFN-α14>IFN-ω,IFN- γ>IFN-α1,α2a,α2b,IFN-β>IFN-λ1(IL-29)，经计算，IFN-α14抗新冠病毒工作浓度低 于目前临床所使用干扰素约100倍,比IFN-ω低约5倍；结果显示，所述的代表性人干扰素 亚型的工作浓度越低则抗病毒效能越高，而潜在不良反应和副作用预期会越低。
本发明中，通过比对IFN-α2和IFN-α14的氨基酸序列，分析IFN-α与IFNAR1结合 的氨基酸位点，发现两者间有4个氨基酸位点存在差异，将IFN-α2上该4个氨基酸位点突 变为相应的IFN-α14的氨基酸(IFN-α2-EIFK)，进而对该IFN-α2突变体进行抗病毒功能 的评价，结果显示其具有类似IFN-α14的抗新冠病毒效果。更具体的，在发现4个与 IFNAR1结合相关的氨基酸位点(第82、86、89和120位)在两种亚型的IFN-α中存在差异 的基础上，本发明将人IFN-α2的第82位天冬氨酸突变为谷氨酸，第86位苏氨酸突变为异 亮氨酸，第89位酪氨酸突变为苯丙胺酸，及第120位精氨酸突变为赖氨酸，获得一个对 IFNAR1亲和力提升的干扰素突变体IFN-α2-EIFK；继而，在基于Vero-E6细胞的新冠病毒 感染模型中，对人IFN-α及相应突变体的抗新冠病毒效果进行了比较，检测噬斑形成个数 及计算半数有效抑制浓度，结果显示，所述的干扰素突变体IFN-α2-EIFK具有类似IFN-α 14的强效抗新冠病毒效果，与IFN-α2相比较，其有效工作浓度低约100倍，并且在工作 浓度下均无细胞毒性。
本发明中，相关IFN-α2重组蛋白的氨基酸序列获取自人基因组，序列为SEQ IDNO.1；
本发明中，与IFN-α2进行氨基酸序列对比的IFN-α14序列为SEQ ID NO.3；
本发明中，对IFN-α2的4个IFNAR1受体结合相关氨基酸位点进行突变的IFN-α2-EIFK的序列为SEQ ID NO.2。
本发明的试验结果证实了新型干扰素亚型及受体结合相关位点突变体在抗新冠病毒感染 中的应用，尤其为开发特定干扰素亚型及经改造的突变体用于制备防治新冠病毒的药物和制 剂提供了理论和技术基础。
本发明提供了干扰素具有抗新冠病毒感染的功能，其中特定亚型IFN-α具有优于当前 临床应用干扰素亚型的抗新冠病毒效应，所述的人α干扰素亚型及通过改造人类α干扰素受 体结合相关位点可制备抗新冠病毒感染的药物和制剂。
为便于理解，以下将通过具体的附图附表对本发明所述特定干扰素亚型及受体结合位点 相关突变体相较IFN-α2具有更优抗新冠病毒活性进行详细地描述。需指出的是，所附图表 仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做 出个别位点和流程等的修改，这些修改也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1.各干扰素亚型及突变体对SARS-CoV-2感染所致Vero-E6细胞噬斑形成的影响。
图2.各干扰素亚型及突变体在Vero-E6细胞中对细胞活力的影响。
图3.原核表达系统纯化干扰素及其纯度评价；
其中，A，人IFN-α2、IFN-α14和IFN-α2-EIFK突变体序列比对示意图；B，人 IFN-α2和IFN-α2-EIFK纯化干扰素的考马斯亮蓝结果。
具体实施方式
实施例1新冠病毒体外感染模型及干扰素处理
(1)本实验利用冠状病毒易感的Vero E6细胞，从1例上海感染者的咽拭子中分离到新型 冠状病毒，命名为nCoV-SH01；对该毒株全基因组采用一代Sanger和二代Illumina法 测序，发现该毒株与GenBank MN908947的同源性＞99.99％；当nCoV-SH01感染Vero E6细胞后，导致典型的合胞体病变，细胞病变效应明显且进展迅速，提示nCoV-SH01可用 于进一步建立SARS-CoV-2的细胞感染模型，供抗病毒药物效能评价；
(2)将Vero-E6细胞常规密度铺至96孔板，培养过夜；
(3)使用不同浓度梯度的各种干扰素亚型及IFN-α2突变体(IFN-α2-EIFK)处理上述 Vero-E6细胞，每组双复孔，孵育16小时；
(4)将上述处理后的细胞带进P3实验室，去除培养基，接种nCoV-SH01 P6病毒，100PFU/100μL/孔(用2％FBS DMEM培养基稀释)，37度孵育1小时；
(5)向每孔加上4％FBS DMEM含2％甲基纤维素100uL 37度培养72h；
(6)直接加100μL 2％PFA固定6小时后，去除培养基等，加入1％结晶紫，染色10分钟，再用水洗5遍；
(7)显微镜下拍照(如图1所示)，结果显示，各类干扰素及突变体有不同程度的抗新冠 病毒效应，即减少噬斑形成的数量，但不同干扰素亚型及突变体完全抑制空斑形成的有 效工作浓度存在明显差异，各浓度和各型别干扰素处理下，细胞形态均良好，提示无明显细胞毒性；
(8)统计空斑数(如表1所示)及计算各干扰素亚型半数有效抑制浓度(如表2所示)， 所述抗新冠病毒效能排序为IFN-α14>IFN-ω,IFN->IFN-α1,α2a,α2b,IFN- β>IFN-λ1(IL-29)，经计算，IFN-α14抗新冠病毒半数有效抑制浓度低于目前临床所 使用干扰素约100倍,比IFN-ω低约5倍；
(9)取干扰素处理16h的Vero-E6细胞，更换培养基后再培养48h，以CCK8检测试剂盒进一步作细胞活力评价，结果显示，各种干扰素亚型及突变体在25ng/ml浓度下对 Vero-E6细胞均无显著细胞毒性。
表1.各干扰素亚型及突变体处理组SARS-CoV-2噬斑形成个数
表2.各干扰素亚型及突变体抑制SARS-CoV-2的半数有效浓度
。
实施例2人IFN-α2和IFN-α2-EIFK的制备与纯化
将人IFN-α2基因编码序列(SEQ ID No.1)，IFN-α2-EIFK(SEQ ID NO.2)干扰素突变 体序列(如图3A所示)，及IFN-α14序列(SEQ ID No.3)经密码子优化后克隆到原核表达载体上，随后进行重组蛋白原核表达；
(1)将重组质粒转化入E.coli BL-21，涂布于含干扰素的固体LB培养基，37℃待16h 后，挑取单菌落到3-4ml LB重进行小摇，过夜，以1:100的比例将菌接入大摇，待 OD600读数在0.5-0.6之间时，IPTG终浓度10μM进行诱导，温度16℃表达20小 时，蛋白诱导表达完成后，将菌液加入到50ml离心管，5000g，4℃离心10min，弃 上清；
(2)离心后的菌体用缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑)重 悬，重悬液的体积是菌液量的1/50-1/100。重悬菌块，将其充分吹散后，转移至2ml 离心管，冰上超声：超声破碎仪high档，破碎10s，冷却10s，循环6次；该步骤重 复3次。10000g，4℃离心25min，收集上清。将收集到的菌体裂解液上清用缓冲液A 稀释到摇菌体积的1/20，对稀释好的样品进行过滤，首先过0.45μm的滤膜，然后再过 0.22μm的滤膜，样品置4℃备用；
(3)使用GE公司AKTA avant机器配合GE Histrap HP(货号：17524701)进行亲和纯化，随后使用GE公司AKRA avant机器配合GE Hitrap Q HP(货号：17115401)进行 离子交换；
(4)收集后的样品进行考马斯亮蓝染色，对干扰素纯度进行鉴定(如图3B所示)；
(5)将纯化的干扰素用超滤管进行蛋白浓缩，并将干扰素的缓冲液置换为PBS；
(6)为排除内毒素对实验结果的影响，随后用Triton X-114对干扰素中的内毒素进行去 除，干扰素与10％Triton X-114以9:1的比例进行混合，4℃磁力搅拌60min，充分混匀，30℃金属浴，1000rpm振荡，20min；取出颠倒混匀，再30℃金属浴，1000 rpm振荡，20min。.25℃，14000g离心15min，移出上层水相到tube管中，以上步 骤再重复一次；
(7)将上述干扰素转移至预处理过的透析袋中，透析袋外侧缓冲液为预冷过的PBS，透析 过夜；
(8)将纯化完成后的干扰素稀释不同的倍数，进行BCA定量。全部完成后，将干扰素分 装，保存在-80℃冰箱；
(9)按实施例1中相同操作，评价人IFN-α2a/b、IFN-α2-EIFK和IFN-α14三种干扰素在抗新冠病毒的差异，结果显示，干扰素受体结合相关位点突变体IFN-α2-EIFK具有类 似IFN-α14的强效抗新冠病毒效果，与IFN-α2相比较，其半数抑制浓度低约100倍， 并且在25ng/ml工作浓度下无细胞毒性。
上述实验结果表明，本发明通过比较多种野生型干扰素亚型及克隆纯化制备突变体干扰 素抗新冠病毒效应，显示IFN-α14以及IFN-α2-EIFK(IFN-α2受体结合位点突变体)具 有高效的抗新冠病毒效能，与IFN-α2相比较，其有效工作浓度低约100倍，且无显著细胞毒性；所述的新型干扰素亚型和改造IFN-α干扰素受体结合相关位点后的干扰素突变体，将为开发用于抗新冠病毒的新型干扰素提供技术支持，尤其是鉴于既往已具备了成熟的IFN-α2开发及应用的生物工程和临床使用经验，本发明的新的α干扰素亚型及受体结合位点相关突变体在制备抗病毒药物中具有良好的应用潜力和前景。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 人α干扰素亚型及受体结合相关位点突变体在制备防治新型冠状病毒感染药物中的用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 165
<212> PRT
<213> IFN-α2
<400> 1
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
85 90 95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130 135 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu
165
<210> 2
<211> 165
<212> PRT
<213> IFN-α2-EIFK
<400> 2
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65 70 75 80
Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
85 90 95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130 135 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu
165
<210> 3
<211> 166
<212> PRT
<213> IFN-α14
<400> 3
Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65 70 75 80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp
165