具体实施方式

首次表明，靶向不溶性和高度取代的玉米葡糖醛酸阿拉伯木聚糖的GH30木聚糖酶可以改善饲喂纤维玉米-大豆粉饮食的肉鸡的肠道功能。由于玉米具有高度支链化的阿拉伯木聚糖，木聚糖酶不容易将其溶解。肠道细菌没有被预期会进一步分解高度支链化的寡聚体并将它们转化为挥发性脂肪酸，这些脂肪酸已知可增强胃肠道功能。

动物：术语“动物”指除人以外的所有动物。动物的例子为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如以下动物，如绵羊、山羊、牛(例如，肉牛、奶牛和小牛)、鹿、牦牛、骆驼、美洲驼和袋鼠。非反刍动物包括单胃动物，例如猪(pig)或猪(swine)(包括但不限于小猪、生长猪和母猪)；家禽，如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉鸡和蛋鸡)；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)、小牛；鱼(包括但不限于琥珀鱼、巨滑舌鱼、魮鱼、鲈鱼、蓝鱼、菖鲉(bocachico)、鲤科鱼、鲶鱼、卡叉马鱼(cachama)、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉鱼、遮目鱼、嘉鱼、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、小翻车鱼、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、瓜波特鱼(guapote)、大比目鱼、爪哇鱼(java)、野鲮属鱼、莱鱼(lai)、泥鳅、鲭鱼、牛奶鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕高鱼(paco)、珍珠斑点鱼(pearlspot)、佩杰瑞鱼(pejerrey)、河鲈鱼、狗鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、鲑鱼、虾米鱼(sampa)、加拿大鰤鲈、黑鲈、海鲤、发光鱼(shiner)、睡鲨(sleeper)、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、比目鱼、刺足鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼(sweetfish)、丁鲷、特罗尔鱼(terror)、罗非鱼、鳟鱼、鲔鱼、多宝鱼、白鳟鱼、白斑鱼、和白鱼)；以及甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。

动物饲料：术语“动物饲料”是指适合于或打算用于由动物摄入的任何化合物、制剂或混合物。单胃动物的动物饲料通常地包含浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲喂微生物(direct fed microbial)、氨基酸和/或其他饲料成分(如在预混物中)，而反刍动物的动物饲料通常包含草料(包括粗粮和青贮)，并且还可包含浓缩物连同维生素、矿物质、酶直接饲喂微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(如在预混物中)。

体增重：术语“体增重(body weight gain)”意指在给定时间段期间动物的活体重的增加，例如从第1天到第21天增加的重量。

组合物：术语“组合物”是指包含载体和至少一种本发明的酶的组合物。本文所述的组合物可与动物饲料混合并称为“饲料/粉饲料(mash feed)”。

有效量/浓度/剂量：术语“有效量”、“有效浓度”或“有效剂量”定义为足以改善动物消化或产量的酶的量、浓度或剂量。绝对数量的实际有效剂量取决于以下因素，包括：所讨论动物的健康状况、存在的其他成分。酶的“有效量”、“有效浓度”或“有效剂量”可以通过本领域技术人员已知的常规测定来确定。

饲料转化率：术语“饲料转化率”是指用来将动物的体重增加一个指定量的喂给动物的饲料量。提高的饲料转化率意指较低的饲料转化率。“较低的饲料转化率”或“提高的饲料转化率”意味着与饲料不包含饲料添加剂组合物时将动物体重增加到一个指定量所需的饲料量相比，在饲料中使用所述饲料添加剂组合物导致将动物的体重增加相同量所需喂给动物的饲料量减少。

饲料效率：术语“饲料效率”意指当动物在一段时间内被任意喂养或喂养指定量的食物时每单位饲料的增重的量。“增加的饲料效率”意味着根据本发明的饲料添加剂组合物在饲料中的使用导致与不存在所述饲料添加剂组合物的饲料喂养的动物相比，每单位饲料摄入的增加的增重。

营养消化率：术语“营养消化率”意指从胃肠道或胃肠道的指定区段(例如，小肠)处消失的营养的部分。营养消化率可测量为所施用至受试者的营养与受试者粪便中所排出来的营养之间的差值、或施用至受试者的营养与保留在胃肠道指定区段(例如，回肠)上的消化物中的营养之间的差值。

可以通过以下方式测量如本文所用的营养消化率：在一段时间内营养的摄入与通过排泄物的总收集获得的排泄的营养之间的差值；或者使用惰性标记，该惰性标记不被动物吸收并且允许研究人员计算在整个胃肠道或胃肠道的区段中消失的营养的量。这种惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬、或酸不溶性灰分。消化率可以表示为营养在饲料中的百分比、或表示为可消化的营养的质量单位/饲料中的营养的质量单位。如本文所用的营养消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。

如本文所用的能量消化率意指所消耗的饲料总能量减去粪便的总能量、或所消耗的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如，回肠)上的剩余消化物的总能量。如本文所用的代谢能是指表观代谢能，并且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中包含的总能量。能量消化率和代谢能可以测量为总能量的摄入与粪便中排泄的或胃肠道指定区段中存在的消化物中的总能量之间的差值，其使用与测量营养消化率相同的方法，针对氮排泄进行适当校正以计算饲料的代谢能。

丸粒：术语“丸粒(pellet)”和/或“制粒(pelleting)”是指固体圆形、球形和/或圆柱形片剂或丸粒以及形成此类固体形状的方法，特别是饲料丸粒和固体挤出动物饲料。如本文所用，术语“挤出(extrusion)”或“挤出(extruding)”是本领域公知的术语并且指在压力下迫使如本文所述的组合物通过孔口的过程。

家禽：术语“家禽”是指人类为了其生产的蛋和/或肉和/或羽毛而饲养的家禽。家禽包括肉鸡和蛋鸡。家禽包括Galloanserae(家禽)超级目，尤其是鸡形目(包括鸡、珍珠鸡、鹌鹑和火鸡)和鸭科，在鹅形目(Anseriformes)中，通常称为“水禽”，包括家鸭和家鹅。家禽还包括为了肉而被宰杀的其他禽类，如鸽子的幼崽。家禽的例子包括鸡(包括蛋鸡、肉鸡和小鸡)、鸭、鹅、鸽子、火鸡和鹌鹑。

粗料：术语“粗料”是指含有大量纤维的干燥植物材料，如纤维、麸皮、种子和谷物的外壳以及作物残留物(如秸秆、椰干、稻草、谷壳、甜菜废料)。

反刍动物：术语“反刍动物”是指哺乳动物，其通过最初在动物胃的第一个隔室中发酵/降解来消化植物性食物(主要是通过细菌作用)，然后反刍(regurgitating)半消化的物质，现在称为反刍(cud)，并再次咀嚼。重新咀嚼反刍以进一步分解植物物质并刺激消化的过程称为“反刍”。反刍动物的例子是牛、母牛、肉牛、小牛、山羊、绵羊、羔羊、鹿、猛犸、骆驼和美洲驼。

SCFA：术语“SCFA”是短链脂肪酸的缩写。SCFA是少于六个碳原子的脂肪酸，来源于难消化食物的肠道微生物发酵，SCFA是结肠细胞的主要能量来源，对胃肠健康至关重要。在本发明中，SCFA可以选自甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、异丁酸酯、戊酸酯和异戊酸酯。

猪：术语“猪(swine)”或“猪(pig)”是指人类为了食物(如它们的肉)而饲养的家猪。猪包括猪(Sus)属的成员，如野猪或家猪，并且包括小猪、生长猪和母猪。

出于本发明的目的，使用在EMBOSS包(例如，版本5.0.0或更高版本)(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是间隙开放惩罚(gap open penalty)为10，间隙扩展惩罚(gap extension penalty)为0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替换矩阵(substitution matrix)。Needle标记的“最长同一性(longest identity)”的输出(使用–nobrief选项获得)用作百分比同一性，其计算如下：

(相同的残基x100)/(比对的长度-比对中的间隙总数)

出于本发明的目的，使用在EMBOSS包(例如，版本5.0.0或更高版本)(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,supra)的Needle程序中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,supra)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。使用的参数是间隙开放惩罚(gap openpenalty)为10，间隙扩展惩罚(gap extension penalty)为0.5，以及EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)替换矩阵(substitution matrix)。Needle标记的“最长同一性(longest identity)”的输出(使用–nobrief选项获得)用作百分比同一性，其计算如下：

(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对的长度-比对中的间隙总数)

葡糖醛酸木聚糖水解酶

本发明的一个方面涉及提高包含玉米的动物饲料的饲料转化率的方法，其包括向所述动物饲料添加GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。另一方面涉及在基于玉米的动物饲料中原位产生益生元的方法，其包括使用添加到所述饲料中的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。本发明进一步涉及改善单胃动物肠道健康的方法，其包括向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。本发明的基本特征是GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶在本发明方法中的用途。本发明的方法、饲料或用途通常是其中所述GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶(EC 3.2.1.136)是GH30_8葡糖醛酸木聚糖水解酶。

术语“GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶”是指一种葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切1,4-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.136)，其催化一些葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1,4-β-D-木糖基键的内切水解。

术语“野生型”葡糖醛酸木聚糖水解酶是指由天然存在的微生物，如自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌表达的葡糖醛酸木聚糖水解酶。

SEQ ID NO 1是“野生型”葡糖醛酸木聚糖水解酶并且在WO03106654中由SEQ IDNO:190定义。九个在D8F、QIIH、N12L、GI7I、G60H、P64V、S65V、G68A和S79P位置的单个位点的氨基酸突变被制备。这些突变中的每一个，单独或组合相对于野生型酶具有改善的热耐受性(如在80℃下热激发20分钟后测量的)。在本发明的一个实施方式中，本发明的方法包括使用具有葡糖醛酸木聚糖水解酶和

a)包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20以及SEQ ID NO:21中的任一个具有至少80％序列同一性的多肽；

b)包含与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的多肽，并且进一步包含一个或多个选自D8F、QIIH、N12L、GI7I、G60H、P64V、S65V、G68A和S79P的突变。

在一个合适的实施方式中，所述多肽包含至少一个，如至少两个，如至少三个，如至少四个，如至少五个，如至少六个，如至少七个，如至少八个，如九个，选自D8F、QIIH、N12L、GI7I、G60H、P64V、S65V、G68A和S79P的突变。

本发明的多肽可以选自：

i.与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，如至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，如至少95％的序列同一性，如至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性的多肽；

ii.与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性，如至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，如至少95％的序列同一性，如至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性的多肽；以及

iii.与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性，如至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，如至少95％的序列同一性，如至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性的多肽。

在一个合适的实施方式中，GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)并且其中GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶是具有木聚糖酶活性的多肽，所述多肽选自：

i.与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，如至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，如至少95％的序列同一性，如至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性的多肽；

ii.与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性，如至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，如至少95％的序列同一性，如至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性的多肽；以及

iii.与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性，如至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，如至少95％的序列同一性，如至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性的多肽。

在一个优选的实施方式中，GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶包含SEQ ID NO 1、SEQ IDNO 2或SEQ ID NO 3，或基本上由或由SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3组成。

饲料转化率的提高

本发明的一个方面涉及提高包含玉米的动物饲料的饲料转化率的方法，其包括向所述动物饲料添加GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。在一个优选的实施方式中，饲料是基于玉米的或包含玉米。在一个实施方式中，玉米是纤维玉米。饲料还可包含玉米DDGS。在又一个实施方式中，饲料还可包括豆粕。

本发明的一个有趣方面涉及提高单胃动物饲料转化率的方法，其包括在基于玉米的动物饲料中使用GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

从实施例1中可以看出，所有家禽同时减少或最次保持食物摄入量，家禽体重在14天后从平均421.2g增加到430.8g，在21天后从平均854.1g增加到893.75g(4.6％)，在28天后从平均1654.8g增加到1672.1g。这代表了农民的大量成本节省和收入增加。

本发明还涉及饲料，即包含GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶和玉米的富含酶的动物饲料，通常其中饲料包含100至1000g/kg饲料的量的玉米和2至100ppm/kg饲料的量的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

本发明的另一方面涉及GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶在制备富含酶的动物饲料中的用途，其中所述动物饲料是基于玉米的动物饲料。一个相关方面涉及提高单胃动物饲料转化率的方法，其包括在基于玉米的动物饲料中使用GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。本发明在类似方面涉及GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶在制备富含酶的动物饲料中的用途，其中所述动物饲料是基于玉米的动物饲料。基于玉米的饲料意在意指包含100至1000g/kg饲料的量的玉米的饲料。通常，饲料包含100至1000g/kg饲料，如100至800g/kg饲料，如200至800g/kg饲料，如200至600g/kg饲料，如300至600g/kg饲料的量的玉米。或者，在基于玉米的饲料中，至少10％重量/重量(如10％至100％，10％至80％，如20％至80％，如25％至85％，如20％至75％，25％至75％，30％至75％，通常30％至70％，或30％至60％，合适地35％至65％)的饲料是玉米，或玉米和玉米DDGS。

在饲料的通常实施方式中，富含酶的动物饲料包含GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶和玉米，其中所述饲料包含100至1000g/kg饲料的量的玉米和2至100ppm/kg饲料的量的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶；如100至800g/kg饲料的量的玉米和2至100ppm/kg饲料的量的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶；如200至800g/kg饲料的量的玉米和2至100ppm/kg饲料的量的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶；如200至600g/kg饲料的量的玉米和2至100ppm/kg饲料的量的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶；如300至600g/kg饲料的量的玉米和2至100ppm/kg饲料的量的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶可以以2至100ppm/kg，如2至80ppm/kg，如2至60ppm/kg，如2至50ppm/kg，2至40ppm/kg，或2至30ppm/kg，或2至20ppm/kg饲料的量存在于饲料中。合适地，GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶可以以2至100ppm/kg，如5至80ppm/kg，10至60ppm/kg，更通常地10至40ppm/kg和10至30ppm/kg的量存在于饲料中。所述动物饲料通常包含2至100ppm，如2至50ppm，如2至40ppm，如2.5至25ppm，如5至20ppm/kg饲料的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

根据本发明的方法，动物通常是单胃动物，例如家禽或猪。动物可以是鸡，例如肉鸡。

改善肠道健康

本实施例还证明来自GH30家族的一种内作用的葡糖醛酸木聚糖水解酶对玉米GAX向AXOS的转化中具有令人惊讶的增溶作用及其对体外肉鸡盲肠微生物群组成的影响。

GH30显著增加了(P<0.05)来自玉米纤维的不同不溶性NSP成分的溶解度。GH30溶解的低聚物含有大量阿拉伯糖，这反映在GH30不溶性ara/xyl比率的显著变化上。不受特定理论的束缚，溶解的鼠李糖和半乳糖的统计学显著增加也可能表明果胶解聚，而葡萄糖的显著增加(P<0.05)可能源于β-葡聚糖，其也少量存在于玉米谷粒中。

表2显示了在37℃下24小时和48小玉米纤维的体外盲肠发酵的SCFA产量(mM)，如在实施例1中进行的，使用盲肠肉鸡内容物作为接种物，在没有或有10ppm GH30(n＝3)的情况下孵育。补充有GH30的玉米纤维的体外盲肠发酵显著增加了(P<0.05)某些SCFA，尤其是丁酸盐(表2)。如实施例1(表2)所示，本发明方法包括在包含玉米纤维的动物饲料中使用GH30，其令人惊讶地导致丁酸盐形成增加超过70％。丁酸盐形成的增加是由于本发明的GH30对GAX的更高增溶作用(见表1)。本发明的一方面涉及改善单胃动物的肠道健康，其包括向动物饲料中添加GH30。或者定义为，所述方法涉及改变单胃的微生物群落，其包括使用本发明的GH30。

¹SEM＝24小时和48小时的平均总和的标准误差。abc：不共享共同字母的列内的平均值显著不同(P<0.05；Tukey-Kramer HSD)(n＝3)。

低聚糖被定义为包含3到10个糖部分的糖类。为了测试盲肠微生物组上的木聚糖酶溶解的寡糖和多糖大小(MW)，由GH30生成的AXOS由SEC分成4个池(pool)(I、II、III、IV)，直到每个部分约100mg材料(冷冻干燥)被获得。在分离由GH30产生的低聚糖期间，UV信号(280nm)特征性地跟随RI信号，表明了不同级分中的低聚物含有芳香族化合物。该信号源自阿魏酸(木聚糖中酚类物质的主要来源)和少量香豆酸或其他酚类化合物(Boz,2015；Bunzel,2010)。对照上清液(未添加GH30)的SEC显示低UV信号或无UV信号以及相应的低RI信号(数据未显示)。清楚地是在池III中与GH30一起孵育的玉米纤维上清液中存在的AXOS含量最高，平均MW为1000-4000Da(平均聚合度约为7-40戊糖单位)，由RI中的峰值表示(图1)。然而，在24小时(显著更高)和48小时(数字更高)时，在池II中观察到的总SCFA和丁酸盐含量最高，平均MW为4000-10000Da(平均聚合度约为40-76)，表明盲肠微生物组在丁酸盐的形成过程中可能更喜欢更长的AXOS链，这也被证明在基于小麦的AXOS的情况下对肉鸡有益。

细菌组成随池IV发生显著变化，其中瘤胃球菌科和毛螺菌科(包括粪杆菌属)的生长显著增加(P<0.05)，而与含有较短寡糖和多糖的其他池相比，拟杆菌显著降低(P<0.05)，如图1所示。然而，可能需要对多糖和寡糖进行更具体和更精确的分离，以对细菌组成变化进行更详细的研究。

使用Deseq2进行的差异丰度分析显示，与木聚糖拟杆菌属99％相同的拟杆菌属菌种(OTU3)在补充GH30后显著降低(P<0.05)。木聚糖拟杆菌以其大量靶向木聚糖利用的基因库而闻名。木聚糖拟杆菌更喜欢降解长的可溶性多糖。观察到的木聚糖拟杆菌生长的减少是由于添加了本发明的外源性GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶，因为参与长的木聚糖降解的内源性基因不太被需要。添加GH30后观察到多样性增加。高微生物多样性被认为与肠道健康直接相关。因此，本发明进一步涉及增加单胃动物中微生物多样性的方法。

GAX的溶解对厚壁菌门水平的影响很小，但它似乎有利于产生丁酸盐的细菌，如OTU11，归类为粪杆菌，它是单胃动物中最丰富的产生丁酸盐的细菌之一。此外，在用GH30处理的样品中，毛螺菌科和瘤胃球菌科的细菌也显著增加(P<0.05)。毛螺菌科是厌氧菌，许多菌种都与丁酸盐的产生有关，丁酸盐有利于宿主上皮细胞和微生物群的生长。这与在体外发酵中观察到的丁酸盐的显著增加非常吻合。先前的研究还表明，将GH11木聚糖酶添加到富含木聚糖的纤维底物(如麦麸)中可提高丁酸盐水平，同时减少拟杆菌属(Bacteroidesspp)。已发现木聚糖拟杆菌无法分解淀粉(Chassard et al.,2008)，而普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)是一种已知的淀粉降解剂(McCarthy et al.,1988)。向发酵培养基中添加GH30可能会使剩余的淀粉更容易获得，因此有利于淀粉利用的普通拟杆菌而不是非淀粉利用的拟杆菌的生长。此外，普通拟杆菌以果胶解聚和降解果胶释放的半乳糖而闻名(Hobbs et al.,2014)。还观察到补充GH30的双歧杆菌显著增加(P<0.001)。在人类中，研究表明双歧杆菌和源自小麦的AXOS与健康益处之间存在关联，其中双歧杆菌特性消除了由西方饮食引起的小鼠代谢紊乱。本发明的方法涉及在单胃中增加产生丁酸盐的细菌，如选自双歧杆菌、瘤胃球菌科(包括粪杆菌属)和毛螺菌科的细菌的肠道水平。

本发明的方法提供了理解单胃动物中的纤维代谢和鉴定有益的共生菌群以及如何影响它们的生长。因此，本发明的方法在优化动物肠道健康方面很重要。用根据本发明的原位作用的外源性GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶溶解不溶性玉米纤维部分，允许增加纤维发酵性，有助于增加微生物多样性，并促进盲肠肉鸡微生物群中有益的细菌转变。实施例显示了外源性葡糖醛酸木聚糖水解酶对玉米GAX具有特异性的明显减少拟杆菌的作用，而细菌科的毛螺菌科(Lachnospiraceae)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)(包括粪杆菌属)是极其重要的丁酸盐生产者，其显著增加。这些细菌在发酵过程中产生了丁酸盐生成效应，提供了玉米GAX降解酶的健康益处。

本公开的实施例进一步揭示了GH30饲料酶的新作用模式，导致了GH30酶的新应用领域。饲料酶中的GH30对肠道环境和微生物群的影响是一个未知的方面，可以改善动物的肠道健康。如实施例所示，对肠道中原位产生的酶分解产物进行了分析，并研究了其对肉鸡肠道形态和微生物群组成的影响。空肠食糜的NSP分析和共聚焦显微镜显示水解酶对玉米GAX增溶作用。GH30靶向并降低(P<0.05)GAX的不溶部分。与酸水解后从不溶性NSP部分溶解的木糖(15.7％)相比，如阿拉伯糖(15.9％)的量所证明的，溶解的AXOS具有高ara/xyl取代度。

NSP分析显示，在补充GH30后，发现空肠食糜中溶解的半乳糖和鼠李糖略有增加(P<0.05)。不受特定理论的束缚，这种增加被认为是由于果胶多糖鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I(RG-I)的溶解，其也存在于玉米细胞壁中，其中随后RG-I充当益生元。在实施例中观察到的改善的动物能力是由于来自玉米和玉米DDGS的葡糖醛酸-阿拉伯木聚糖的溶解。GH30裂解并溶解高度支链化和异质的葡糖醛酸-阿拉伯木聚糖结构，更高水平的可溶性阿拉伯木寡糖通过增加后肠微生物发酵和/或更高的营养吸收和可及性来产生更多能量。

如实施例所示，添加GH30的禽类的盲肠中的丁酸盐水平增加(P<0.05)，并且总体上也有较高的乙酸盐和较高的总SCFA水平的趋势(表3)。

表3.未添加和添加饮食GH30的肉鸡盲肠内容物中的SCFA浓度(μmol/g)(n＝24)

¹SEM＝标准误差平均值。ab：不共享共同字母的列内的平均值显著不同(P<0.05；Tukey-Kramer HSD)(n＝24)。

同样，在使用盲肠微生物群的体外发酵过程中，观察到在玉米纤维中添加GH30后总SCFA的数值增加(表4)。体外发酵表明，与对照相比，GH30产生的一些可溶性阿拉伯木寡糖具有丁酸盐生成性，产生的丁酸盐多43.6％，并且明显将丙酸盐和戊酸盐转变为丁酸盐(表4)。刺激产生丁酸盐的细菌的定殖和生长可优化肠道健康。因此，本发明的一个方面涉及改善单胃动物肠道健康的方法，其包括使用GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。较高水平的丁酸盐对肠道形态有益，并刺激肠上皮细胞中黏糖蛋白(mucin glycoprotein)的表达。观察到在补充了GH30的禽类中，丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶基因与总细菌的比例增加(P<0.0038)。这至少部分解释了十二指肠中T淋巴细胞浸润减少(P<0.001)和绒毛长度增加(P<0.001)，因为已知丁酸盐可减少炎症并增加上皮细胞增殖和分化。

表4.在37℃下使用肉鸡盲肠内容物作为接种物，对含有110g/kg木糖的玉米纤维，在没有或有10ppm剂量的SEQ ID NO 1的情况下孵育，进行6小时、24小时和48小时盲肠发酵的体外SCFA产量(mM)10ppm(n＝3)

¹SEM＝平均值的标准误差。ab：不共享共同字母的列内的平均值显著不同(P<0.05；Tukey-Kramer HSD)(n＝3)。

本发明的一个方面涉及在基于玉米的动物饲料中原位产生益生元的方法，其包括使用添加到所述饲料中的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

原位产生的益生元中的至少一种是阿拉伯木聚糖寡糖和多糖。本发明的一个方面是减少基于玉米的动物饲料中不溶性玉米级分的方法，其包括添加GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

本发明的另一方面涉及改善单胃动物肠道健康的方法，其包括向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。通常，GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶降解所述玉米的非淀粉多糖以产生益生元低聚物和聚合物、益生元低聚物和包含阿拉伯木聚糖寡糖的聚合物。因此，本发明的另一个方面是通过原位产生阿拉伯木聚糖寡糖和多糖来改善单胃动物肠道健康的方法。本发明的替代方法是在单胃动物中原位产生益生元的方法，其包括向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。或者定义为，本发明的一个方面涉及改善单胃动物肠道健康的方法，所述方法包括在所述动物中原位增加盲肠丁酸盐水平，所述方法包括向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

本发明进一步涉及改善单胃动物肠道健康的方法，所述方法包括通过向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料来改变所述动物的微生物群组成，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。如上所述，所述动物的微生物群组成通常被改变，因为至少拟杆菌(Baceteroide)水平降低并且毛螺菌科(Lachnospiraceae)和/或瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)水平增加。

本发明的另一方面涉及在单胃动物中引起丁酸盐生成作用的方法，其包括向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

酶组合物

本发明还涉及包含本发明多肽的组合物。优选地，组合物富含本发明的多肽。术语“富集的”表示组合物的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶活性已经增加，例如具有至少1.1的富集因子(enrichment factor)，如至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少2.0、至少3.0、至少4.0、至少5.0、至少10。

在一个实施方式中，组合物包含一种或多种本发明的多肽和一种或多种制备剂(formulation agent)，如下所述。

所述组合物可进一步包含多种酶活性，如一种或多种(例如，几种)选自植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、蛋白酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、溶血磷脂酶、磷脂酶C、磷脂酶D、淀粉酶、溶菌酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、支链淀粉酶和β-葡聚糖酶或其任何组合的酶。

组合物还可包含一种或多种微生物。在一个实施方式中，微生物选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、双歧杆菌、动物双歧杆菌、双歧杆菌、肉杆菌属、丁酸梭菌、梭菌属、屎肠球菌、肠球菌属、乳杆菌属、嗜酸乳杆菌、乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属、明串珠菌属、埃氏巨球菌、巨球菌属、乳酸片球菌、片球菌属、托尼丙酸杆菌，丙酸杆菌属和链球菌属(Bacillus subtilis,Bacilluslicheniformis,Bacillus amyloliquefaciens,Bacillus cereus,Bacillus pumilus,Bacillus polymyxa,Bacillus megaterium,Bacillus coagulans,Bacillus circulans,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium animalis,Bifidobacterium sp.,Carnobacterium sp.,Clostridium butyricum,Clostridium sp.,Enterococcusfaecium,Enterococcus sp.,Lactobacillus sp.,Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus farciminus,Lactobacillus rhamnosus,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus salivarius,Lactococcus lactis,Lactococcus sp.,Leuconostoc sp.,Megasphaera elsdenii,Megasphaera sp.,Pediococsus acidilactici,Pediococcussp.,Propionibacterium thoenii,Propionibacterium sp.和Streptococcus sp.)或其任何组合。

制备剂

本发明的酶可以制备成液体或固体。对于液体制剂，制备剂可包含多元醇(如甘油、乙二醇或丙二醇)、盐(如氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾)或糖或糖衍生物(如糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇)。因此，在一个实施方式中，所述组合物是一种液体组合物，其包含本发明的多肽和一种或多种选自甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇的制备剂。液体制剂可以在饲料制成颗粒后喷洒到饲料上，或者可以加入到动物的饮用水中。

对于固体制剂，所述制剂可以是例如颗粒、喷雾干燥粉末或附聚物。制备剂可包含盐(有机或无机锌盐、钠盐、钾盐或钙盐，如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠，苯甲酸钠，碳酸钠，氯化钠，柠檬酸钠，硫酸钠，乙酸锌，苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)，淀粉或糖或糖衍生物(如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)。

在一个实施方式中，固体组合物呈颗粒状。颗粒可具有其中组分均匀混合的基质结构。然而，颗粒通常包含核心颗粒和一个或多个包衣，包衣通常是盐和/或蜡包衣。蜡的例子是聚乙二醇；聚丙烯；巴西棕榈蜡；小烛树蜡；蜂蜡；氢化植物油或动物脂，如氢化牛脂、氢化棕榈油、氢化棉籽和/或氢化大豆油；脂肪酸醇；甘油单酯和/或甘油二酯，如硬脂酸甘油酯，其中硬脂酸酯是硬脂酸和棕榈酸的混合物；微晶蜡；石蜡；和脂肪酸，如氢化线性长链脂肪酸及其衍生物。优选的蜡是棕榈油或氢化棕榈油。核心颗粒可以是本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶的均匀混合物，任选地与一种或多种另外的酶组合并且任选地与一种或多种盐或惰性颗粒一起，本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶任选地与施加到其上的一种或多种另外的酶组合。

在一个实施方式中，核心颗粒的材料选自无机盐(如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)、糖或糖衍生物(如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)、有机小分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质和粘土矿物质(也称为含水层状硅酸铝)。在一个优选的实施方式中，核心包含粘土矿物，如高岭石或高岭土。

盐涂层通常至少为1μm厚，可以是一种特定的盐或盐的混合物，如Na₂SO₄、K₂SO₄、MgSO₄和/或柠檬酸钠。其他例子是在例如WO 2008/017659、WO 2006/034710、WO 1997/05245、WO 1998/54980、WO 1998/55599、WO 2000/70034/0204/0204/0204/020034中描述的那些。

在另一个实施方式中，组合物是包含本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶和一种或多种选自氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、淀粉和纤维素的制备剂。在一个优选的实施方式中，制备剂选自一种或多种以下化合物：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠和碳酸钙。在一个优选的实施方式中，固体组合物呈颗粒状。在一个实施方式中，固体组合物为颗粒形式并且包含核心颗粒、其包含本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶的酶层和盐涂层。

在另一个实施方式中，制备剂选自以下化合物中的一种或多种：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、淀粉、高岭土和纤维素。在一个优选的实施方式中，制备剂选自以下化合物中的一种或多种：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。

制备剂

本发明的酶可以制备成液体或固体或半固体制剂。对于液体制剂，制剂可以包括多元醇(如甘油、乙二醇或丙二醇)、盐(如氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾)或糖或糖衍生物(如糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇)。因此，在一个实施方式中，组合物是液体组合物，其包含本发明的多肽和一种或多种选自甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、糊精、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇的制备剂。

对于固体制剂，所述制剂可以是例如颗粒、喷雾干燥粉末或附聚物。制备剂可包含盐(有机或无机锌盐、钠盐、钾盐或钙盐，如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠，苯甲酸钠，碳酸钠，氯化钠，柠檬酸钠，硫酸钠，乙酸锌，苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)，淀粉或糖或糖衍生物(如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)。

在一个实施方式中，固体组合物呈颗粒状。颗粒可具有其中组分均匀混合的基质结构。然而，颗粒通常包含核心颗粒和一个或多个包衣，包衣通常是盐和/或蜡包衣。核心颗粒可以是本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶的均匀混合物，任选地与一种或多种另外的酶组合并且任选地与一种或多种盐或惰性颗粒一起，本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶任选地与施加到其上的一种或多种另外的酶组合。

在一个实施方式中，核心颗粒的材料选自无机盐(如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)、糖或糖衍生物(如蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇)、有机小分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质。

盐涂层通常至少为1μm厚，可以是一种特定的盐或盐的混合物，如Na₂SO₄、K₂SO₄、MgSO₄和/或柠檬酸钠。其他例子是在例如WO 2008/017659、WO 2006/034710、WO 1997/05245、WO 1998/54980、WO 1998/55599、WO 2000/70034中描述的那些聚合物涂层，例如WO2001/00042中所描述。

在另一个实施方式中，组合物是包含本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶和一种或多种选自氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、淀粉和纤维素的制备剂。在一个优选的实施方式中，制备剂选自一种或多种以下化合物：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠和碳酸钙。在一个优选的实施方式中，固体组合物呈颗粒状。在一个实施方式中，固体组合物为颗粒形式并且包含核心颗粒、其包含本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶的酶层和盐涂层。

在另一个实施方式中，制备剂选自以下化合物中的一种或多种：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、淀粉和纤维素。在一个优选的实施方式中，制备剂选自以下化合物中的一种或多种：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠和碳酸钙。

动物饲料和动物饲料添加剂

本发明还涉及包含一种或多种本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶的动物饲料组合物和动物饲料添加剂。在一个实施方式中，动物饲料或动物饲料添加剂包含制备剂和一种或多种本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。在另一个实施方式中，制备剂包含一种或多种以下化合物：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、乳糖、淀粉、高岭土和纤维素。

动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白质含量。家禽和猪的饮食可以如WO 01/58275的表B中第2-3栏所示的来表征。鱼类饮食的特征如表B第4列所示。此外，此类鱼饲料的粗脂肪含量通常为200-310g/kg。

根据本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并且还包含至少一种如本文要求保护的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

此外，或作为替代方案(对于上述粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的代谢能含量；和/或钙含量为0.1-200g/kg；和/或有效磷含量为0.1-200g/kg；和/或甲硫氨酸含量为0.1-100g/kg；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸的含量为0.1-150g/kg；和/或赖氨酸的含量为0.5-50g/kg。

在特定实施方式中，代谢能、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量在WO 01/58275(R.2-5)的表B中的范围2、3、4或5中的任何一个。

粗蛋白被计算为氮(N)乘以因子6.25，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)x6.25。氮含量通过凯氏定氮法(A.O.A.C.,1984,Official Methods of Analysis 14th ed.,Associationof Official Analytical Chemists,Washington DC)测定。

代谢能可以根据NRC出版物《猪的营养需求》(Nutrient requirements in swine,ninth revised edition 1988,subcommittee on swine nutrition,committee onanimal nutrition,board of agriculture,national research council.NationalAcademy Press,Washington,D.C.,pp.2-6)以及欧洲家禽饲料能量值表(the EuropeanTable of Energy Values for Poultry Feed-stuffs，Spelderholt centre for poultryresearch and extension,7361DA Beekbergen,The Netherlands.Grafisch bedrijfPonsen&looijen bv,Wageningen.ISBN 90-71463-12-5)来计算。

完全动物饮食中的钙、有效磷和氨基酸的饮食含量是根据饲料表计算的，如Veevoedertabel 1997,gegevens over chemische samenstelling,verteerbaarheid envoederwaarde van voedermiddelen,Central Veevoederbureau,Runderweg 6,8219pkLelystad.ISBN 90-72839-13-7。

在一个具体实施方式中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种如上定义的植物蛋白。

本发明的动物饲料组合物还可含有动物蛋白，如肉骨粉、羽毛粉和/或鱼粉，通常含量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可包含具有可溶物的干酒糟(DDGS)，通常含量为0-30％。

在更进一步的具体实施方式中，本发明的动物饲料组合物含有0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％的小麦；和/或0-70％的大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的豆粕；和/或0-25％的鱼粉；和/或0-25％的肉骨粉；和/或0-20％的乳清。

动物饲料可包含植物蛋白。在特定实施方式中，植物蛋白的蛋白质含量为至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％(w/w)。植物蛋白可以源自植物蛋白源，如豆类和谷物，例如来自豆科(豆科)、十字花科、藜科和禾本科植物的材料，如大豆粉、羽扇豆粉、菜籽粉及其组合。

在一个特定的实施方式中，植物蛋白源是来自豆科的一种或多种植物，例如大豆、羽扇豆、豌豆或豆类的材料。在一个特定的实施方式中，植物蛋白源是来自豆科的一种或多种植物，例如大豆、羽扇豆、豌豆或豆类的材料。植物蛋白来源的其他例子是油菜籽和卷心菜。在另一个特定的实施方式中，大豆是优选的植物蛋白来源。植物蛋白来源的其他例子是谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米(玉米)、大米和高粱。

动物饲料可以例如制造为粉饲料(非颗粒状)或颗粒状饲料。通常，根据相关物种的规格，将研磨的饲料混合并添加足量的必需维生素和矿物质。酶可以作为固体或液体酶制剂添加。例如，对于粉饲料，可以在成分混合步骤之前或期间加入固体或液体酶制剂。对于颗粒饲料，(液体或固体)GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶/酶制剂也可以在饲料成分步骤之前或期间添加。通常，液体GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶/酶制剂包含本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶和任选的多元醇(如甘油、乙二醇或丙二醇)，并在制粒步骤之后加入，如通过将液体制剂喷洒到小丸上。酶也可被掺入饲料添加剂或预混物中。

或者，GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶可以通过将液体酶溶液与填充剂如磨碎的豆粕的混合物冷冻，然后将混合物冻干来制备。

在一个实施方式中，动物饲料或动物饲料添加剂包含一种或多种另外的酶。在一个实施方式中，动物饲料包含一种或多种微生物。在一个实施方式中，动物饲料包含一种或多种维生素。在一个实施方式中，动物饲料包含一种或多种矿物质。在一个实施方式中，动物饲料包含一种或多种氨基酸。在一个实施方式中，动物饲料包含一种或多种其他饲料成分。

在另一个实施方式中，动物饲料或动物饲料添加剂包含本发明的多肽、一种或多种制备剂和一种或多种另外的酶。在一个实施方式中，动物饲料或动物饲料添加剂包含本发明的多肽、一种或多种制备剂和一种或多种微生物。在一个实施方式中，动物饲料包含本发明的多肽、一种或多种制备剂和一种或多种维生素。在一个实施方式中，动物饲料或动物饲料添加剂包含一种或多种矿物质。在一个实施方式中，动物饲料或动物饲料添加剂包含本发明的多肽、一种或多种制备剂和一种或多种氨基酸。在一个实施方式中，动物饲料或动物饲料添加剂包含本发明的多肽、一种或多种制备剂和一种或多种其他饲料成分。

在另一个实施方式中，动物饲料或动物饲料添加剂包含本发明的多肽、一种或多种制备剂和一种或多种选自由以下列表组成的组分：一种或多种另外的酶；一种或多种微生物；一种或多种维生素；一种或多种矿物质；一种或多种氨基酸；以及一种或多种其他饲料成分。

另外的酶

在另一个实施方式中，本文所述的组合物任选地包括一种或多种酶。酶可以根据NC-IUBMB,1992的Enzyme Nomenclature手册进行分类，也可以参见Internet上的ENZYME站点：http://www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是与酶命名相关的信息库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联盟(IUB-MB)命名委员会的建议(Academic Press,Inc.,1992)，并且它描述了已为其提供EC(酶委员会)编号的每种类型的特征酶(Bairoch A.The ENZYMEdatabase,2000,Nucleic Acids Res 28:304-305)。这种IUB-MB酶命名法是基于它们的底物特异性，偶尔也基于它们的分子机制；这样的分类并不能反映这些酶的结构特征。

某些糖苷水解酶的另一种分类，如内切葡聚糖酶、α-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、溶菌酶和半乳糖苷酶在Henrissat et al,“The carbohydrate-active enzymes database(CAZy)in 2013”,Nucl.Acids Res.(1January 2014)42(D1):D490-D495；see also www.cazy.org.中被描述。

因此，本发明的组合物还可以包含至少一种选自植酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4)；磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，如例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)；β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)；阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)；纤维素酶(EC 3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)；β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)；支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25)和β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)，或任何它们的混合物。

在一个具体实施方式中，本发明的组合物包含植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)。市售植酸酶的例子包括Bio-Feed^TM植酸酶(Novozymes)、P、NP和HiPhos(DSM Nutritional Products)，和E(BASF),和Blue(AB Enzymes),(Huvepharma)XP(Verenium/DuPont)和PHY(DuPont).其他优选的植酸酶包括例如在WO 98/28408、WO 00/43503和WO 03/066847中被描述的那些。

在一个具体实施方式中，本发明的组合物包含GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶(EC3.2.1.8)。市售木聚糖酶的例子包括WX和G2(DSMNutritional Products)、XT和Barley(AB Vista)、(Verenium)、X(Huvepharma)和XB(木聚糖酶/β-葡聚糖酶，DuPont)。

在一个特定的实施方式中，本发明的组合物包含蛋白酶(EC 3.4)。市售蛋白酶的例子包括ProAct(DSM Nutritional Products)。

微生物

在一个实施方式中，动物饲料组合物还包含一种或多种另外的微生物。在特定实施方式中，动物饲料组合物进一步包含来自以下属中的一种或多种的细菌：Lactobacillus,Lactococcus,Streptococcus,Bacillus,Pediococcus,Enterococcus,Leuconostoc,Carnobacterium,Propionibacterium,Bifidobacterium,Clostridium andMegasphaera或它们的任何组合。

在一个优选的实施方式中，动物饲料组合物还包含来自一种或多种以下菌株的细菌：Bacillus subtilis,Bacillus licheniformis,Bacillus amyloliquefaciens,Bacillus cereus,Bacillus pumilus,Bacillus polymyxa,Bacillus megaterium,Bacillus coagulans,Bacillus circulans,Enterococcus faecium,Enterococcus spp,and Pediococcus spp,Lactobacillus spp,Bifidobacterium spp,Lactobacillusacidophilus,Pediococsus acidilactici,Lactococcus lactis,Bifidobacteriumbifidum,Propionibacterium thoenii,Lactobacillus farciminus,lactobacillusrhamnosus,Clostridium butyricum,Bifidobacterium animalis ssp.animalis,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus salivarius ssp.salivarius,Megasphaeraelsdenii,Propionibacteria sp。

在更优选的实施方式中，动物饲料组合物进一步包含来自以下枯草芽孢杆菌的一种或多种菌株的细菌：3A-P4(PTA-6506)；15A-P4(PTA-6507)；22C-P1(PTA-6508)；2084(NRRL B-500130)；LSSA01(NRRL-B-50104)；BS27(NRRL B-501 05)；BS 18(NRRL B-50633)；和BS 278(NRRL B-50634)。

动物饲料组合物中每种菌株的细菌计数在1x10⁴和1x10¹⁴CFU/kg干物质之间，优选在1x10⁶和1x10¹²CFU/kg干物质之间，更优选在1x10⁷和1x10¹¹CFU/kg干物质之间。在更优选的实施方式中，动物饲料组合物中每种细菌菌株的细菌计数在1x10⁸和1x10¹⁰CFU/kg干物质之间。

动物饲料组合物中每种细菌菌株的细菌计数在1x10⁵和1x10¹⁵CFU/动物/天之间，优选在1x10⁷和1x10¹³CFU/动物/天之间，更优选在1x10⁸和1x10¹²CFU/动物/天之间。在更优选的实施方式中，动物饲料组合物中每种细菌菌株的细菌计数在1x10⁹至1x10¹¹CFU/动物/天之间。

在另一个实施方式中，一种或多种细菌菌株以稳定孢子的形式存在。

预混物

在一个实施方式中，动物饲料可包括预混物，其包含例如混合到动物饲料中的维生素、矿物质、酶、氨基酸、防腐剂、抗生素、其他饲料成分或其任何组合。

氨基酸

本发明的组合物还可包含一种或多种氨基酸。用于动物饲料的氨基酸的例子是赖氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。

维生素和矿物质

在另一个实施方式中，动物饲料可包括一种或多种维生素，如一种或多种脂溶性维生素和/或一种或多种水溶性维生素。在另一个实施方式中，动物饲料可任选地包括一种或多种矿物质，如一种或多种微量矿物质和/或一种或多种常量矿物质。

通常脂溶性和水溶性维生素以及微量矿物质构成旨在添加到饲料中的所谓预混物的一部分，而常量矿物质通常单独添加到饲料中。

脂溶性维生素的非限制性例子包括维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的非限制性例子包括维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸，例如，Ca-D-泛酸。

微量矿物质的非限制性例子包括硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、硒和锌。

常量矿物质的非限制性例子包括钙、镁、钾和钠。

这些成分的营养要求(以家禽和小猪/猪为例)列于WO 01/58275的表A中。营养要求意味着这些成分应以指示的浓度在饮食中提供。

或者，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275的表A中指定的单独组分中的至少一种。至少一个是指，一个或两个，或三个，或四个等中的一个或多个，直至所有十三个，或多达所有十五个单独的组分。更具体地，该至少一种单独组分以提供在表A的第四栏、或第五栏或第六栏所示范围内的饲料中的浓度这样的量包含在本发明的添加剂中。

在又一个实施方式中，本发明的动物饲料添加剂包含以下维生素中的至少一种，优选提供在下表10中指定的范围内的饲料中的浓度(分别用于小猪饮食和肉鸡饮食)。

表10：典型维生素推荐

其他饲料成分

本发明的组合物还可包含着色剂、稳定剂、生长促进添加剂和芳香化合物/调味剂、多不饱和脂肪酸(PUFA)；活性氧产生物质、抗微生物肽和抗真菌多肽。

着色剂的例子是类胡萝卜素，如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素。

芳香化合物/调味剂的例子是甲酚、茴香脑、十内酯、十一内酯和/或十二内酯、紫罗兰酮、铁、姜酚、哌啶、亚丙基邻苯二甲酸、亚丁基邻苯二甲酸、辣椒素和单宁。

抗菌肽(AMP)的例子是CAP18、亮氨酸A、Tritrpticin、Protegrin-1、Thanatin、防御素、乳铁蛋白、乳铁蛋白和Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer,2000)、Plectasins和他汀类，包括WO 03/044049和WO 03/048148中描述的化合物和多肽，以及上述保留抗微生物活性的变体或片段。

抗真菌多肽(AFP)的例子是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉肽(Aspergillus niger)，以及其保留抗真菌活性的变体和片段，如WO 94/01459和WO 02/090384中所描述开。

多不饱和脂肪酸的例子是C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和gamma-亚油酸。

产生活性氧的物质的例子是化学品，如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；和酶，如氧化酶、加氧酶或合酶。

本发明的组合物还可包含至少一种氨基酸。用于动物饲料的氨基酸的例子是赖氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。

用途

用于动物饲料

本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶也可用于动物饲料。在一个实施方式中，本发明提供了一种制备动物饲料组合物的方法，其包括将一种或多种本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶添加到一种或多种动物饲料成分中。

本发明的一种或多种GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶可例如用于通过抑制病毒(例如冠状病毒科、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传播牛病毒病的Persivirus等)、寄生病原体(球虫原生动物、巨型艾美球虫、小艾美球虫)或细菌病原体(如产气荚膜梭菌、大肠杆菌、弯曲杆菌、猪肠弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌、耶尔森氏菌属、猪螺旋体、猪痢疾短螺旋体、胞内劳森菌和沙门氏菌，如肠沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和沙门氏菌)的生长/肠道定殖来稳定非反刍动物特别是家畜的健康微生物群，例如但不限于猪(pig)或猪(swine)(包括但不限于小猪、生长猪和母猪)、家禽(包括但不限于鹅、火鸡、鸭和鸡，如肉鸡、小鸡和蛋鸡)；和兔子以及鱼类(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类动物(包括但不限于虾(shawn)和虾(prawn)))。在一个优选的实施方式中，GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶应用于鸡并且具有针对产气荚膜梭菌的抗微生物活性。在另一个实施方式中，本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶用作饲料添加剂，其中它可以对鸡消化道的微生物平衡提供积极影响，并以此方式改善动物能力。

根据WO 00/21381和WO 04/026334，本发明的一种或多种GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶还可以作为饲料增强酶用于动物饲料，其改善饲料消化率以增加其利用效率。

在另一个实施方式中，本发明的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶可用作饲料添加剂，它可能对动物消化道产生积极影响，并以此方式根据体重增加、饲料转化率(FCR)或改善动物健康(如降低死亡率)来改善动物能力。FCR以g/动物为单位的饲料摄入量相对于以g/动物为单位的增重来计算。

在根据本发明的用途中，GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶可以在饮食之前、之后或同时喂给动物。后者是优选的。

在一个特定的实施方式中，当将GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶添加到饲料中或包含在饲料添加剂中时，其形式是明确定义的。明确定义是指如通过尺寸排阻色谱法测定的(参见WO 01/58275的实施例12)，GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶制品的纯度至少为50％。在其他特定实施方式中，如通过该方法测定的，GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶制剂为至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％的纯度。

明确定义的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶制剂是有利的。例如，将GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶正确添加到饲料中要容易得多，该GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶基本上不会干扰或污染其他GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。术语剂量正确地特指获得一致和恒定结果的目标，以及基于所需效果来优化剂量的能力。

然而，用于动物饲料时，GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶不必是纯的；它可以例如包括其他酶，在这种情况下它可以被称为GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶制剂。

GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶制剂可(a)直接添加到饲料中，或(b)可用于生产一种或多种中间组合物，如随后被添加到饲料中(或用于处理过程)的饲料添加剂或预混物。上述纯度是指原始GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶制剂的纯度，无论是根据上述(a)还是(b)使用。

实施例

实施例1

来自糖苷水解酶家族30(GH30)的外源性葡糖醛酸木聚糖水解酶在体外玉米纤维的盲肠肉鸡发酵中促进微生物多样性和丁酸盐的产生。

在这项体外研究中，测试了来自SEQ ID NO 1的糖苷水解酶(GH)家族30的内作用的葡糖醛酸木聚糖水解酶溶解玉米纤维中的葡糖醛酸-阿拉伯木聚糖的能力以及产生的低聚糖对肉鸡盲肠微生物群组成的后续效果。该酶显著降低了(P<0.01)不溶性玉米级分。为了研究寡糖大小对发酵模式的影响，由SEQ ID NO 1产生的寡糖通过尺寸排阻色谱分离(separated and isolated)。与含有较低MW(1-4kDa和100-500Da)的寡糖的池相比，分子量为4-10kDa的级分池的发酵显示出更高的丁酸盐浓度。在体外发酵过程中，原位添加酶后24小时和48小时后，丁酸盐浓度显著升高(P<0.01)。添加葡糖醛木聚糖水解酶增加了多样性并显著降低了(P<0.01)革兰氏阴性拟杆菌的生长(P<0.01)，而来自毛螺菌科的细菌则显著增加(P<0.01)，这些细菌是至关重要的产生丁酸盐的细菌。

材料和方法

玉米纤维基质的干物质(DM)含量为97.54％，其含有364g/kg粗纤维，25.5g/kg淀粉、375g/kg蛋白质、98g/kg脂肪和46g/kg灰分，其通过使用Termamyl和Alcalase进行脱淀粉和脱蛋白来获得。参见Ravn et al.(2017)，以获取详细的生产步骤。玉米的化学组合物是单胃饲料工业中使用的玉米的代表(Cowieson，2005)。玉米纤维具有大约110.5g/kg DM的木糖。

纯化的单组分酶：具有SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3的来自GH30_8家族的葡糖醛酸木聚糖水解酶(EC 3.2.1.136)是从枯草芽孢杆菌中获得的并在地衣芽孢杆菌(B.)中表达的。

玉米纤维的酶消化

玉米纤维(100mg)底物(n＝4)与SEQ ID NO 1(10ppm)一起孵育。10ppm的酶用量对应于饲料添加剂市场上其他糖酶的推荐用量。在pH 5.0，具有5mM Ca²⁺的4mL 0.1M乙酸钠(NaOAc)缓冲液中搅拌(500rpm)的同时，在40℃持续孵育4小时。

NSP分析

根据Theander et al.(1995)，对使用和不使用GH30孵育的玉米纤维进行了可溶的和不溶的中性非纤维素多糖(NCP)成分(不含纤维素的NSP成分)的分析，重复三次。为了避免纤维素溶胀，不使用12MH₂SO₄进行增溶。

通过尺寸排阻色谱(SEC)分离AXOS

来自玉米纤维酶消化的上清液(如第2.3节所述)通过快速真空蒸发浓缩，然后使用配备有折射率(RI)和紫外(UV)检测器的Superdex 75柱(26/60)(GE Healthcare LifeSciences,USA)以150mL/h的流速在50mM甲酸铵(pH 5)中分离。以两分钟的间隔收集级分。合并级分：池I(级分22-30)、池II(31-39)、池III(40-53)、池IV(55-59)和池V(60-70)被冷冻干燥、重新悬浮在软化水中并且再次冷冻干燥以除去甲酸铵。

体外盲肠发酵

如Moura et al.(2007)中所述并根据De Maesschalck et al.(2015)修改的，玉米纤维(150mg)或100mg来自SEC的I-IV池在按所述制备的缺氧无菌Moura培养基中稀释并将pH值调整为6.5。将29日龄肉鸡的盲肠内容物与Moura培养基混合并稀释10倍，从该稀释液中，将150μl加入到最终培养体积为15ml的玉米纤维中，以实现1000倍的盲肠内容物稀释。发酵物在37℃下孵育48小时，有或没有葡萄糖醛酸木聚糖水解酶，酶剂量为10ppm。池I-IV管未接受酶补充。发酵上清液在24和48小时后取样，并储存在-20℃直至进行分析。所有发酵重复三次。

短链脂肪酸分析

如(1994)所述，通过气相色谱法对肉鸡盲肠内容物和体外盲肠发酵上清液中SCFA的浓度进行定量。在将大约200μl体外发酵上清液与200μl MeOH和10％HCOOH混合之前，将样品解冻并离心。使用Rezex RoA色谱柱(Phenomenex，Torrance，USA)和RI检测器通过HPLC(Dionex，Sunnyvale，美国)对乳酸进行定量，之后将样品在5mM H₂SO₄中稀释两次以在RI检测器上获得线性。

微生物群组成的DNA提取和PCR

使用Nucleospin 96土壤试剂盒(Macherey-Nagel，德国)和Genie-T涡旋仪(美国科学工业公司)从体外盲肠接种物发酵中提取总基因组细菌DNA。使用荧光Qubit dsDNA HS检测试剂盒(Invitrogen，美国)对DNA进行定量，并将10-15ng提取的DNA用于针对16S rRNA基因V3-V4可变区的PCR反应(25μl)。10-15ng提取的DNA用作PCR反应模板(25μl)，其中包含dNTP(每个400nM)、Hot Start IIDNA聚合酶HF(2mU)、1XHighFidelity缓冲液和包含V3-4特异性引物(正向引物(341F)CCTACGGGNGGCWGCAG和反向引物(805R)：GACTACHVGGGTATTCTAATCC)的条形码文库接头(400nM)。使用的PCR设置为：98℃初始变性2分钟，30个循环，98℃30秒，52℃30秒，72℃30秒，最终延伸72℃5分钟。

盲肠微生物群组成的16S rRNA基因测序

使用Ampure XP珠实验方案(Beckmann Coulter，美国)纯化扩增子文库。合并纯化的测序文库，并按照在MiSeq上制备和加载样品的标准指南，使用MiSeqReagent kit v3，600个循环(Illumina)在MiSeq(Illumina，San Diego，CA)上对样品进行配对末端测序(280bp x 260bp读取，双index为8bp)。加入基因组DNA以克服扩增子样品中常见的低复杂性问题。生物信息学按照Ravn et al.(2017)先前的描述进行。

生物信息学处理、OTU聚类和分类

OTU表的生成是使用usearch版本10.0.240(Edgar,2016)完成的。使用fastx_truncate去除引物结合区域，并过滤读取以确保每次读取包含少于一个错误。质量过滤后的读数用unoise3去噪。OTU丰度是通过使用97％同一性阈值与usearch_global映射来计算的。分类学分类是使用RDP分类器2.12版完成的。

统计分析

方差分析是使用统计包SAS JMP 12.1.0(SAS Institute Inc.，2015)中的ANOVA程序进行的。对于体外NSP和SCFA浓度，模型中包括了孵育时间、处理及其相互作用的影响。对于显著模型(P<0.05)，使用方差分析模型中提供的Tukey-Kramer HSD检验(P<0.05)分离最小二乘平均值。对于可溶性木糖、NSP数据或SCFA浓度，在体外发酵后，使用Tukey-Kramer测试来测试处理的主要效果并进行比较。16S rRNA宏基因组学数据的统计分析使用ANOVA在R中处理(Ravn et al.,2017)。

使用ampvis包v.1.9.1(Albertsen et al.,2015)在R中分析微生物组数据，该包建立在R包DESeq2(Love et al.,2014)之上，用于检测不同丰度的菌种。如果调整后的p值低于0.05，则认为OUT显著差异丰富。

对于Beta多样性分析，使用vegan包(Oksanen et al.,2015)中的vegdist函数和bray方法计算相异指数。使用vegan包中的adonis对方差的置换多变量分析进行了分析。

结果

NSP分析

分析了GH30对玉米纤维NSP组分的增溶作用，包括可溶的(DP>10)和不溶的糖部分(表1)。该酶显著增加了(P<0.05)可溶的阿拉伯木聚糖部分(在可溶的级分酸水解后测量为阿拉伯糖和木糖)。阿拉伯木聚糖增溶也反映在不溶的NSP的显著减少(P<0.05)。同样，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖结构(在可溶的级分酸水解后测量为鼠李糖和半乳糖)的增溶也显著增加(P<0.05)。

表1.可溶的和不溶的级分中的平均单个NSP含量(g/kg DM)、它们的总含量以及与GH30在玉米纤维上孵育后的含量(g/kg DM)(n＝3)

表2显示了在37℃下玉米纤维的24小时和48小时盲肠发酵的体外SCFA产量(mM)，使用盲肠肉鸡含量作为接种物，在没有或有10ppm GH30(n＝3)的情况下孵育，如实施例1中所进行的。补充有GH30的玉米纤维的体外盲肠发酵显著增加了(P<0.05)某些SCFA，尤其是丁酸盐(表2)。由于GH30对GAX的总溶解度更高，如表1所示，GH30处理显示增加的丁酸盐形成比对照高3.8mM。

¹SEM＝24小时和48小时的平均总和的标准误差。abc：不共享共同字母的列内的平均值显著不同(P<0.05；Tukey-Kramer HSD)(n＝3)。测试了两个时间点。

与GH30一起孵育的玉米纤维上清液中存在的低聚物的SEC

池I(22-30)、II(31-39)、III(40-53)、IV(55-59)和V(60-70)通过SEC分级分，如图1所示。级分的平均大小大约对应于：池I：10-30kDa；池II：4-10kDa；池III：1-4kDa，池IV：100-500Da。池V：<100Da。高UV信号(280nm)峰与RI信号匹配，表明低聚物含有吸光化合物。

体外发酵

对添加或不添加GH30的玉米纤维与来自两只29日龄肉鸡的混合盲肠内容物的接种物进行发酵，以研究SCFA的产生。GH30在24小时和48小时后显著增加丁酸盐水平(P<0.05)，在48小时后显著增加了总SCFA(P<0.05)。与对照相比，添加GH30也显著降低了(P<0.05)支链SCFA。样品中不存在可检测到的乳酸。

将分离的AXOS级分(池I-IV)与来自两只29日龄肉鸡的混合盲肠内容物的接种物结合进行发酵，以研究受AXOS大小影响的SCFA的产生。24小时和48小时后，与池IV相比，池I-III显著增加了(P<0.05)总SCFA产量。与其他池相比，池II在24小时时产生显著更高(P<0.05)的丁酸盐，在48小时后在数值上产生更高的丁酸盐。由于材料质量太少，池V未包括在发酵中。

微生物群组成分析

除了用Deseq2分析差异丰度外，在分析前对样品进行了稀释。

α多样性分析

用ANOVA分析对alpha多样性(香农指数)的影响。分析表明shannon指数与酶处理显著相关(p值<0.001)。shannon指数的箱线图如图2所示。

β多样性分析

使用加权Unifrac指数分析Beta多样性。用置换曼诺瓦(来自素食包的adonis)研究了治疗对β多样性的影响。发现β多样性与酶处理无显著关联(R2 0.63p值0.1)。β多样性与治疗之间的关联如图3所示。

差异丰度

前20个最丰富的物种用R包中的hclust函数聚类。OTU计数在聚类之前进行了对数转换。聚类通过图4中的热图进行可视化。热图显示样本根据处理进行聚类。热图还显示，在用GH30进行酶促处理后，一种拟杆菌(OTU3)减少，另一种拟杆菌(OTU5)增加。

使用Deseq2进行的差异丰度分析显示，在用木聚糖酶处理的所有组中，拟杆菌属菌种(OTU3)显著减少。三个OTU的丰度如图5所示。

两个OTU的序列分析表明，OTU3与木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)的16SrRNA序列具有99％的同一性，而OTU5与Bacteroides dorei/vulgatus的同一性为100％。

图6显示了10个最丰富的属的层级聚类。属的丰度是通过合并属于同一属的所有OTU获得的。热图显示粪杆菌属和双歧杆菌属增加。deseq2的分析显示双歧杆菌的增加是显著的(P<0.001)。粪杆菌和双歧杆菌的相对丰度如图7所示。

级分的微生物组分析(I-IV)

在来自GH30上清液的尺寸排除的部分I-IV之间没有发现对alpha多样性的显著影响。使用加权Unifrac指数分析β多样性。分数对β多样性的影响用置换manova(来自素食包的adonis)进行了研究。发现β多样性在级分I-III和IV之间显著相关(R2 0.6p值0.001)。β多样性与治疗之间的关联如图8所示。

前20个最丰富的物种用hclust函数聚类。OTU计数在聚类之前进行了对数转换。聚类通过图9中的热图进行可视化。热图显示来自级分IV的样本聚集在一起。

图10显示了一种类杆菌属菌种(OTU3)的减少，而其他类杆菌属菌种(OTU5、OUT15和OTU10)的增加与级分IV的补充有关。

实施例2

GAX特异性葡糖醛酸木聚糖水解酶改善了饲喂玉米/DDGS/大豆饮食的肉鸡的性能和形态学肠道健康参数。

材料和方法

根据比利时动物福利法规(2010/63/EC)饲养并将鸡安乐死。

动物和饮食

总共480只新孵化的雄性Ross-308肉鸡被随机分成16个围栏，每围栏30只小鸡，(每个处理组8个围栏)，饲养在铺有木屑的实心地板上。在试验的前4天，光照时间表提供18小时光照/6小时黑暗循环和23小时光照/1小时黑暗循环。通过中央供暖系统根据禽类的要求调整和优化马厩的室温。所有禽类都饲喂相同的基于玉米-大豆的醪饲料饮食，作为补充或未补充SEQ ID NO 1的饲料。饮食(表1)的配制是为了满足肉鸡在两个阶段(开食期和生长期，分别为0-7天和7-29天)的能量和可消化氨基酸需求。

处理

SEQ ID NO 1的纯化的单组分葡糖醛酸木聚糖水解酶(EC3.2.1.136)GH30_8类从枯草芽孢杆菌获得并在地衣芽孢杆菌中表达)。所用酶的剂量为10ppm。通过将1.5L稀释的酶溶液喷洒到30kg磨碎的玉米预混物上，将酶以液体形式添加到饮食中。预混物在4℃下储存在塑料袋中，直到最终混合到粉饲料中以达到2ml/kg饲料的最终浓度，对应于10ppm/kg饲料酶浓度。

样本和数据收集

在第7、14、21和29天在围栏水平上获得饲料摄入量和体重。在第14天和第29天，每围栏5只鸡被安乐死并单独称重。收集从近端空肠到梅克尔憩室的空肠食糜和盲肠食糜(均为盲肠)并在液氮中速冻。获得十二指肠环的上皮并在4％甲醛溶液中固定(containers,Ax-lab,Denmark,http://www.axlab.dk/)。

禽类肠道菌群失调和炎症评分

安乐死后，一位经验丰富的兽医立即对每只禽类进行宏观评分。给每只鸡的肠道菌群失调参数在0-10评分。0为正常胃肠道，10为最严重的菌群失调(Teirlynck etal.2011)。总之，评分的参数是(1)超过所有肠道膨胀；(2)肠道浆膜/粘膜侧发炎/显著发红；(3)肠壁脆弱；(4)肠壁松弛/厚度；(5)异常内容物；(6)未消化的饲料。请参见Teirlyncket al.(2011)的详细描述。

体外盲肠发酵

对于体外发酵，通过使用包括与α-淀粉酶(Novozymes,Denmark)进行两次孵育和与蛋白酶(Novozymes,Denmark)进行孵育的步骤来获得玉米纤维。纤维分析表明，该材料含有36.4％的粗纤维、2.55％的淀粉、37.5％的蛋白质、9.8％的脂肪和4.6％的灰分，大约为110.5g/kg木糖。如Moura et al.(2007)所述并根据DeMaesschalck et al.(2015)修改的，制备在缺氧无菌Moura培养基(低营养培养基)中稀释的玉米纤维浆液(1％w/v)。在将样品放入厌氧柜之前，将发酵pH值调至6.5。将29天龄肉鸡的盲肠成分混合并用Moura培养基稀释10倍，从该稀释液中，将150μl加入到最终培养体积为15ml的玉米纤维中，以实现1000倍的盲肠成分稀释。在酶剂量为10ppm的情况下，在有或没有SEQ ID NO 1、2或3的情况下，将发酵物在37℃孵育48小时。发酵上清液在6、24和48小时后取样，并储存在-20℃直至分析。所有发酵均进行三次生物学重复，发酵实验在不同的日子重复两次。

分析步骤

如(1994)所述，通过气相色谱法对肉鸡盲肠内容物和体外盲肠发酵上清液中的SCFA浓度进行定量。在将大约100mg盲肠内容物或200μl体外发酵上清液与200μlMeOH和10％HCOOH混合之前，将样品解冻并离心。使用RezexRoA色谱柱(Phenomenex，丹麦)和RI检测器通过HPLC(Dionex，美国)对乳酸进行定量，然后将样品用5mM H₂SO₄稀释以在RI检测器上获得线性。

空肠食糜样品被分成两等份，一份用于冷冻干燥，一份用于液体分馏，然后解冻并通过围栏汇集，每个围栏每个采样点有5只禽类。通过在室温下离心(15分钟，4000rpm)进行液体级分，然后收获上清液。

氮含量测定采用杜马斯法(FP628氮分析仪，美国LECO公司)；饲料饮食中的粗蛋白是通过将氮浓度校正6.25来确定的。

根据Theander et al.(1995)，分析了来自每个处理的三个围栏的饮食和混合冷冻干燥空肠食糜的可溶性和不溶性NSP。每个处理一式三份进行(分析每个处理的400mg)。

空肠内容物的液体部分(上清液)的粘度在ViPr(粘度压力)测定中测量(Abel&Pettersson，WO2011107472A，2011)。将上清液(300μl)转移到96孔微量滴定板(Nunc^TM，丹麦)，并使用HamiltonStarlet液体处理机(Hamilton公司，美国)进行粘度测量(n＝3)。液体手柄通过在Hamilton移液器中检测到的压力差来测量粘度。

共聚焦显微镜和免疫细胞化学

根据Ravn et al.(2016)，使用CLSM SP2显微镜(Leica，Heidelberg，德国)对免疫标记的空肠食糜样品进行共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)。63x水浸物镜用于所有图像。图像在LAS AF Lite(Leica)软件中进行处理，543nm激光和488nm激光的信号分别以红色和绿色着色。

冻干空肠食糜的免疫标记如下进行：将大约100mg冻干空肠食糜与熔化的2％琼脂混合，并在室温下固化。将小块方形琼脂包埋食糜固定、脱水、包埋在石蜡中并切片(Ravnet al.,2016)。通过免疫细胞化学技术(Ravn et al.,2016)用抗体标记食糜的脱蜡薄片(4μm)。切片用脱脂牛奶封闭并在PBS缓冲液中洗涤，然后用10倍稀释的脱脂牛奶在1x PBS中与LM27和LM28大鼠初级单克隆抗体一起孵育1小时，该抗体特异性结合取代的AX区域(Cornuault et al.,2015)。随后将样品在与Alexa-555荧光团连接的抗大鼠IgG的300倍稀释液中孵育1.5小时，并在PBS缓冲液中洗涤。加入Citiflour AF1(Agar Scientific,UK)抗褪色剂以避免荧光信号的漂白。

形态学检查

在十二指肠环处截取的十二指肠段固定在4％甲醛溶液( Ax-lab，丹麦)中。样品在二甲苯和一系列分级乙醇中脱水，包埋在石蜡中并切成4μm切片。将样品脱蜡，用苏木精和伊红染色，并使用数字光学显微镜DM LB2(Leica，Heidelberg，德国)和DFC320相机(Leica，Heidelberg，德国)进行检查。使用图像分析系统LAS v4.0(LeicaApplication Suite V4)通过每个十二指肠切片随机测量10个绒毛来测量所有样品的绒毛长度。

CD3 T细胞的免疫组织化学检查

准备十二指肠的脱蜡切片(每围栏3个样品，每次处理总数为24个)，使用10mM柠檬酸盐缓冲液，pH6，通过压力锅抗原修复方法(Tender Cooker；Nordic Ware,Minneapolis,MN,美国)进行免疫标记。用Dako CD3(A0452)(Dako,Glostrup,丹麦)对CD3阳性T细胞特异的抗体进行白细胞的免疫组织化学标记。切片在Dako Autostainer+洗涤缓冲液中洗涤，用过氧化物酶试剂封闭5分钟，然后用Dako洗涤缓冲液冲洗。将切片与一抗在室温下孵育30分钟，并在Dako抗体稀释剂(S3022)中稀释100倍。切片在Dako洗涤缓冲液中再次冲洗，并与标记的聚合物-HRP(DAB)(K4011)在室温下孵育30分钟。然后将切片用Dako洗涤缓冲液洗涤两次，加入Dako DAB+底物和DAB+色原，历时5分钟。停止染色，苏木精复染10分钟，流水冲洗1分钟。切片用二甲苯和一系列分级乙醇脱水，并安装。使用图像分析系统LAS v4.0软件(Leica)中的颜色阈值应用程序按面积百分比对棕色染色的白细胞进行量化。

用于微生物群组成和qPCR分析的DNA提取和PCR

使用Nucleospin 96土壤试剂盒(Macherey-Nagel，德国)和Genie-T涡旋仪(Scientific Industries Inc.,美国)从盲肠材料中提取细菌总基因组的DNA。使用荧光Qubit dsDNA HS检测试剂盒(Invitrogen,美国)对DNA进行定量，并将10-15ng提取的DNA用于针对16S rRNA基因V3-V4可变区的PCR反应(25μl)。10-15ng提取的DNA用作PCR反应模板(25μl)，其中包含dNTP(每个400nM)，Hot Start II DNA聚合酶HF(2mU)、1XHigh Fidelity缓冲液(New England Biolabs Inc.,美国)和包含V3-4特异性引物的条形码文库接头(400nM)：正向引物(341F)CCTACGGGNGGCWGCAG和反向引物(805R)：GACTACHVGGGTTATCTAATCC。使用的PCR设置为：98℃初始变性2分钟，30个循环，98℃30秒，52℃30秒，72℃30秒，最终延伸72℃5分钟。

总细菌和丁酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶基因的qPCR

细菌总数和丁酸辅酶A：乙酸辅酶A转移酶基因在每栏三只鸡中定量(每个处理16个样品)。将纯化的盲肠DNA稀释100倍以匹配标准曲线。使用以下引物Fwd：(5'-CGGYCCAGACTCCTACGGG-3')和Rev：(5'-TTACCGCG GCTGCGTGGCA-3')(Hopkins et al.,2005)确定细菌总数。为了定量编码丁酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶的基因拷贝数，使用引物正义链：(5'-GCIGAICATTCACITGGAAYWSITGGCAYATG-3')和反义链：(5'-CCTGCCTTTGCAATRTCIACRAANGC-3')(Louis and Flint 2007)。使用2xSensiMix SYBR No-ROX混合物，每个反应在12μl总反应混合物中重复三次。如De Maesschalck et al(2015)所述制备最终引物浓度和进行PCR循环。使用CFX384 Bio-Rad检测系统(Bio-Rad，Nazareth-Eke,比利时)进行扩增和荧光团检测。

盲肠微生物群组成的16SrRNA基因测序

使用Ampure XP珠实验方案(Beckmann Coulter,美国)纯化扩增子文库。合并纯化的测序文库，并按照在MiSeq上制备和加载样品的标准指南，使用MiSeqReagent kit v3，600个循环(Illumina)在MiSeq(Illumina，San Diego，CA)上对样品进行配对末端测序(280bp x260bp读取，双index为8bp)。加入基因组DNA以克服扩增子样品中常见的低复杂性问题。生物信息学按照Ravn et al.(2017)先前的描述进行。

统计分析

使用方差分析多重比较和统计软件包SAS JMP对生长性能、食糜、形态和体外发酵数据进行统计分析。为了比较两个以上的对，使用Tukey-Kramer HSD模型，将单围栏作为决定因素。对于绒毛长度，使用一只禽类的10根绒毛的平均值作为一个数据值。16S rRNA宏基因组学数据的统计分析使用ANOVA在R中处理(Ravn et al.,2017)。

结果

禽类性能

补充SEQ ID NO 1(表2)对饲料摄入没有显著影响。在整个试验期间，对照组的总死亡率为5.0％(12只禽类)，GH30处理组的总死亡率为5.4％(13只禽类)。

29天后补充GH30的体增重(BW)和活体增重(LWG)显著增加(P<0.001)(表2)。饲料转化率(FCR)通常随着GH30的补充而降低(P<0.001，表2)。

表2.酶补充剂对禽类生长性能的影响。

¹SEM＝平均值的标准误差。以四个时间间隔计算饲料转化率(FCR)、采食量(FI)、体增重(BW)和活体增重(LWG)。数值是有30只鸡的8个围栏(分别在第14天和第29天后分别有25和20只鸡)的平均值。²P值：分别至第8、14、21和29天的对照和酶补充的均值(Tukey-Kramer HSD测试)的成对比较。

29日龄肉鸡空肠食糜的NSP

在补充有本发明的GH30酶(SEQ ID NO 1)的禽类的空肠食糜中，不溶性NSP显著降低(P<0.05)。与对照相比，GH30酶降低了总不溶性GAX，如表3所示。同样，可溶性NSP增加(P<0.05)。有趣的是，含有鼠李糖(0.1g/kg DM)、甘露糖(0.45g/kg)和半乳糖(3.5g/kg)的少量可溶性低聚物也随着GH30的补充而增加(P<0.05)。

空肠消化液的粘度

没有观察到酶补充对平均空肠食糜粘度的显著影响(对照＝698.31Pa和SEQ IDNO 1＝704.88Pa)。

显微镜(GAX增溶)

在使用LM27和LM28抗体的对照空肠食糜样品中观察到来自玉米GAX的强信号。在补充有SEQ ID NO 1的鸡的食糜中，两种抗体信号均降低或完全消失。

肠道菌群失调/炎症评分

如Teirlynck et al.(2011)所记载的，补充GXH没有显著影响宏观菌群失调评分。在第14天，对照和GH30补充的禽类的平均宏观菌群失调评分分别为1.55和2.0(满分10)。在第29天，对照和补充了SEQ ID NO 1的禽类的平均宏观菌群失调评分分别为4.73和4.55。

肠道形态

在饮食中添加GH30与十二指肠绒毛长度显著增加(P<0.001)相关(表4)。与对照相比，添加GH30的14日龄和29日龄的禽类的绒毛长度分别增加了292.4μm和302.4μm。

表4.木聚糖酶补充剂对十二指肠绒毛长度的影响

¹SEM＝平均值的标准误差。通过基于计算机的分析系统对每只采样鸡的每个十二指肠切片随机测量10个绒毛。²P值，第14天和第29天的对照和酶补充方法的比较(Tukey-Kramer HSD测试)。

此外，CD3 T细胞浸润的面积百分比显著降低(P<0.001)(表5)，表明补充木聚糖酶的禽类炎症水平较低。

表5.按面积％定量，补充木聚糖酶对十二指肠CD3 T细胞浸润的影响。

¹SEM＝平均值的标准误差。²使用LAS v.4软件(Leica)中的颜色阈值工具进行定量的绒毛组织中棕色染色的CD3 T细胞的面积百分比。进行了Tukey-Kramer HSD测试以比较接受非补充和酶补充饮食的组(n＝24)之间的所有配对平均值。³P值，第14天和第29天的对照和酶补充方法的比较(Tukey-Kramer HSD测试)。

微生物群组成的16S rRNA分析

在对照组和SEQ ID NO 1补充组(n＝40)之间没有观察到属的相对丰度(％)的显著差异。然而，在某些添加了GH30木聚糖酶的毛螺菌科中观察到数量增加，它们是已知的产生丁酸盐的细菌(Hippe et al.,2011)。

丁酸辅酶A：乙酸辅酶A转移酶基因的qPCR分析

在29日龄肉鸡饮食中添加GH30木聚糖酶时，观察到丁酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶基因与细菌总量之间的比例显著更高(P<0.0038)(图11)。

盲肠内容物中的SCFA浓度

盲肠内容物的SCFA分析显示，在补充有SEQ ID NO 1的肉鸡中，丁酸盐(+3.57μmol/g)显著增加(P<0.05)(表6)。

表6.添加和添加饮食GXH的肉鸡盲肠内容物中的SCFA浓度(μmol/g)(n＝24)(SEQID NO 1)

¹SEM＝标准误差平均值。ab：不共享共同字母的列内的平均值显著不同(P<0.05；Tukey-Kramer HSD)(n＝24)。

表6显示了乙酸盐含量增加超过8％，丁酸盐含量增加超过30％，SCFA含量总增加约9％。

用于SCFA分析的具有盲肠内容物的体外发酵

GH30对SCFA生产的影响通过体外发酵测试，接种物来自两只29日龄肉鸡的混合盲肠内容物(表7)。在厌氧培养48小时后，添加10mg EP/kg的酶与丁酸盐浓度(+4.1mM)显著增加(P<0.05)相关，而丙酸和戊酸显著降低(P<0.01)。样品中不存在可测量的乳酸(数据未显示)。

结论

GAX特异性葡糖醛酸木聚糖水解酶改善了饲喂玉米/DDGS/大豆饮食的肉鸡的性能和形态学肠道健康参数。NSP、盲肠SCFA和体外发酵数据表明，可被常驻微生物群发酵的酶对益生元AXOS具有高溶解性。

本发明由以下编号的段落进一步定义：

1.一种提高包含玉米的动物饲料的饲料转化率的方法，其包括向所述动物饲料中添加GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

2.一种提高玉米类动物饲料饲料转化率的方法，其包括在所述玉米类动物饲料中添加GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶

3.根据段落1所述的方法，其中所述玉米是纤维玉米。

4.根据段落1至3中任一段所述的方法，其中所述饲料进一步包含玉米DDGS。

5.根据段落1至4中任一段所述的方法，其中所述饲料还包括豆粕。

6.根据段落1至5中任一段所述的方法，其中所述饲料包含100至1000g/kg饲料，如100至800g/kg饲料，如200至800g/kg饲料，如200至600g/kg饲料，如300至600g/kg饲料的量的玉米。

7.根据段落1至5中任一段所述的方法，其中所述动物是单胃动物。

8.根据前述段落中任一段所述的方法，其中所述动物选自家禽和猪。

9.根据前述段落中任一段所述的方法，其中所述动物是鸡。

10.根据前述段落中任一段所述的方法，其中所述动物饲料包含2至100ppm，如2至50ppm，如2至40ppm，如2.5至25ppm，如5至20ppm/kg饲料的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

11.一种提高单胃动物饲料转化率的方法，其包括在基于玉米的动物饲料中使用GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

12.一种在基于玉米的动物饲料中原位产生益生元的方法，其包括使用添加到所述饲料中的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

13.根据段落11所述原位产生益生元的方法，其中所述益生元是阿拉伯木聚糖寡糖和多糖。

14.一种减少基于玉米的动物饲料中不溶性玉米级分的方法，其包括添加GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

15.一种改善单胃动物肠道健康的方法，其包括向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

16.根据段落14所述的方法，其中所述GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶降解所述玉米的非淀粉多糖以产生益生元低聚物和聚合物、益生元低聚物和包含阿拉伯木聚糖寡糖的聚合物。

17.一种通过原位生产阿拉伯木聚糖寡糖和多糖来改善单胃动物肠道健康的方法。

18.一种在单胃动物中原位生产益生元的方法，其包括向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

19.一种改善单胃动物肠道健康的方法，所述方法包括在所述动物中原位增加盲肠丁酸盐水平的水平所述方法包括向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

20.一种改善单胃动物肠道健康的方法，所述方法包括通过向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料来改变所述动物的微生物群组成，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

21.根据段落19所述的方法，其中所述动物的微生物群组成被改变，至少，拟杆菌水平降低并且毛螺菌科和/或瘤胃球菌科水平增加。

22.一种饲养动物的方法，其包括向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

23.一种在单胃动物中引起丁酸盐生成效应的方法，其包括向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

24.一种制备包含玉米的动物饲料的方法，其包括将GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶添加到所述动物饲料中。

25.一种提高基于玉米的动物饲料的饲料效率的方法，其包括向所述动物饲料中添加GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

26.一种提高单胃动物营养消化率的方法，其包括向所述动物施用富含酶的基于玉米的动物饲料，其中所述动物饲料包含酶GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

27.根据段落1至25任一段所述的方法，其中所述GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶源自枯草芽孢杆菌。

28.一种包含GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶和玉米的富含酶的动物饲料，其中所述饲料包含100至1000g/kg饲料的量的玉米和2至100ppm/kg饲料的量的GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。

29.GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶在制备富含酶的动物饲料中的用途，其中所述动物饲料是基于玉米的动物饲料。

30.根据段落27所述的富含酶的动物饲料、根据段落28所述的用途或根据段落1至26任一段所述的方法，其中所述GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶(EC 3.2.1.136)是GH30_8葡糖醛酸木聚糖水解酶。

31.根据段落27所述的富含酶的动物饲料、根据段落28所述的用途或根据段落1至26任一段所述的方法，其中所述GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶是具有选自以下木聚糖酶活性的多肽：

a.与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，如至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，如至少95％的序列同一性，如至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性的多肽；

b.与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性，如至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，如至少95％的序列同一性，如至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性的多肽；以及

c.与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性，如至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，如至少95％的序列同一性，如至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性的多肽。

31.根据段落27所述的富含酶的动物饲料、根据段落28所述的用途或根据段落1至26任一段所述的方法，其中GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶包含SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3，或基本上由或由SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3组成。

32.根据段落27所述的富含酶的动物饲料、根据段落28所述的用途或根据段落1至26任一段所述的方法，其中进一步包含、添加或施用一种或多种另外的酶。

33.根据段落33所述的富含酶的动物饲料、用途或方法，其中一种或多种另外的酶选自植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4)；磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，如例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)；β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)；乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)；阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)；纤维素酶(EC3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)；β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)；支链淀粉酶(EC3.2.1.41)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25)和β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC 3.2.1.6)，或任何它们的混合物。

34.根据段落27的所述富含酶的动物饲料、根据段落28所述的用途或根据段落1至26任一段所述的方法，其中进一步包含、添加或施用一种或多种另外的酶。一种或多种微生物、一种或多种维生素、一种或多种矿物质和/或一种或多种氨基酸。

35.一种改善单胃动物肠道健康的方法，其包括给所述动物喂食基于玉米的饲料，其中所述基于玉米的饲料富含GH30葡糖醛酸木聚糖水解酶。