具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一个典型实施方式中，提供一种倍半萜烯异构体衍生物高效转化和高纯度单体的制备方法，所述制备方法至少包括：

将吉马酮转化为芹子烯，并使用高速逆流色谱和制备型HPLC分离提取，获得芹子烯三种构型单体；所述高速逆流色谱中溶剂系统为含Ag⁺的正己烷/甲醇/水。

所述吉马酮转化为芹子烯具体方法为：

向吉马酮溶液中加入硅胶和磷酸水溶液，在高温下进行反应即得。

其中，所述吉马酮与硅胶的体积质量为100-500μL：1-20mg，如200μL： 4mg、200μL：8mg、200μL：12mg、200μL：16mg和200μL：20mg；

所述磷酸水溶液浓度控制为1-100％，如1％、10％、20％、40％、60％、 80％和100％。

所述高温条件具体温度控制为30-130℃，如30、50、70、90、110和 130℃。

所述反应时间在1-60min，如1、10、20、30、40、50和60min。

通过筛选优化条件可知，在磷酸水溶液浓度为80％、硅胶添加量8mg、温度70℃、反应时间60min时，其转化率最高，可达到41.34％。

本发明的又一具体实施方式中，可以采用液相色谱法监测上述反应过程和产物，所述液相色谱法检测条件包括：色谱柱为C₁₈柱，流动相：甲醇- 水(95:5，v/v)；检测波长：200-220nm(优选为206nm)；流速：0.5-5mL/min (优选为1.0mL/min)。

本发明的又一具体实施方式中，所述使用高速逆流色谱和制备型HPLC 分离提取具体方法为：

在HSCCC分离中，选择正己烷/甲醇/硝酸银溶液的上相作为流动相，下相作为固定相，正己烷/甲醇/硝酸银溶液体积比为10:9.5:0.5，其中硝酸银溶液中Ag⁺浓度控制为1-5mol/L，如1、2、3、4和5mol/L。当水中银离子浓度保持在3mol/L时，3种芹子烯单体化合物的K_D值几乎符合黄金法则。因此，最终选择正己烷-甲醇-硝酸银溶液(3mol/L)(10:9.5:0.5，v/v)溶剂系统用于HSCCC分离。

本发明的又一具体实施方式中，固定相以10～30mL/min(优选为20 mL/min)的流速注入HSCCC分离柱；HSCCC在25～35℃(如30℃)下以 600～800rpm(优选为800rpm)转速顺时针旋转，流动相以1.0～5.0mL/min (优选为2.0mL/min)流速，以尾端到首端的模式泵入HSCCC分离柱；当达到流体力学平衡后，样品溶液通过进样阀进样。

上述样品溶液可以是吉马酮转化为芹子烯后获得的样品溶解于正己烷- 甲醇-硝酸银溶液的上相和下相后所得。

更具体的，所述HSCCC分离过程还包括：用紫外-可见检测器在210nm 处连续监测柱的流出物；

使用自动进样器每1-6min(如5min)对馏分进行收集；

分离后，用氮气吹出HSCCC分离柱中溶剂；吹出的溶剂进行真空浓缩，残渣用正己烷萃取；弃去上层，下层水相真空浓缩至干，回收硝酸银。

试验证明，在优化条件下，粗样品完全溶解在选定的两相溶剂体系中，用于HSCCC分离，参数如下：转速为800rpm，两相溶剂体系为正己烷-甲醇-硝酸银溶液(3mol/L)(10:9.5:0.5，v/v)，流动相流速2.0mL/min，分离温度为25℃。在最佳条件下，从粗提物中得到化合物2(即β-芹子烯)、化合物1+3混合物(即γ-芹子烯+α-芹子烯)，逆流色谱的固定相保留率为51％。

因此采用制备型HPLC进一步分离化合物1和3的混合物；具体方法包括：以C₁₈半制备色谱柱进行分离，制备液相条件：甲醇-水(92：8)，流速：5-20mL/min(优选为10mL/min)，进样量50-200μL(优选为100μL)。用紫外-可见检测器在200-220nm(优选为206nm)处连续监测柱的流出物。使用自动进样器每0.5-3min(如1min)对馏分进行收集。

本发明的第二个方面，提供上述制备方法得到的芹子烯构型单体；所述芹子烯构型单体为三种，分别为α-芹子烯、β-芹子烯和γ-芹子烯。

本发明的第三个方面，提供上述制备方法和/或倍半萜烯异构体衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。

进一步的，所述肿瘤包括但不限于成骨肉瘤、肝癌、肺癌和乳腺癌。

本发明通过试验验证，芹子烯对间叶组织来源的人成骨肉瘤、上皮组织来源人肝细胞癌以及对小鼠肝细胞癌均有抑制作用。这一结果提示，芹子烯不仅对特定肿瘤有良好的抑制作用，同时还具有广泛的抗肿瘤谱。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

一、吉马酮转化为芹子烯异构体的单因素实验

1.工艺流程：

用移液枪准确吸取吉马酮粗样200μL于具塞试管中，加入不同的硅胶量(200-300目)作为反应的催化剂，在不同的pH环境中，在一定温度下反应一定的时间。反应结束后，将反应液转移至离心管中，8000r/min离心 10min，精密量取上清液10μL加入1mL甲醇溶解稀释后，用HPLC进行检测。

2.工艺优化：

分别选取不同的硅胶添加量(0、4、8、12、16和20mg)、加入5μL 不同浓度的磷酸水溶液(0％、20％、40％、60％、80％和100％)、不同的反应时间(10、20、30、40、50和60min)、不同的反应温度(30、50、70、 90、110和130℃)进行单因素实验，用HPLC检测吉马酮峰面积以及三个芹子烯总的峰面积，计算吉马酮峰面积的减少量和α-、β-和γ-芹子烯同分异构体总峰面积的增加量，比较不同条件对转化率的影响。

2.1硅胶添加量的优化

用移液枪准确吸取吉马酮粗样200μL于具塞试管中，分别加入不同量的硅胶(0、4、8、12、16和20mg)，再加入5μL 80％的磷酸水溶液，在 90℃下反应30min。反应结束后，将反应液转移至离心管中，8000r/min离心10min，精密量取上清液10μL加入1mL甲醇溶解稀释后，用HPLC进行检测。结果表明(图2)，硅胶添加量为8mg时，转化率增加趋缓，继续增加转化率降低，因此单因素的最优添加量为8mg。

2.2不同pH环境的优化

用移液枪准确吸取吉马酮粗样200μL于具塞试管中，加入5μL不同浓度的磷酸水溶液(0％、20％、40％、60％、80％和100％)，加入硅胶8mg，在90℃下反应30min。反应结束后，将反应液转移至离心管中，8000r/min离心10min，精密量取上清液10μL加入1mL甲醇溶解稀释后，用HPLC进行检测。结果表明(图3)，磷酸添加量为80％时，转化率最高，因此单因素的最优添加量为80％。

2.3反应时间的优化

用移液枪准确吸取吉马酮粗样200μL于具塞试管中，加入硅胶8mg，加入5μL 80％的磷酸水溶液，在90℃下分别反应10、20、30、40、50和60 min。反应结束后，将反应液转移至离心管中，8000r/min离心10min，精密量取上清液10μL加入1mL甲醇溶解稀释后，用HPLC进行检测。结果表明(图4)，反应为50min时，转化率最高，继续延长时间转化率降低，因此单因素的最优反应时间为50min。

2.4反应温度的优化

用移液枪准确吸取吉马酮粗样200μL于具塞试管中，加入硅胶8mg，加入5μL 80％的磷酸水溶液，分别在30、50、70、90、110和130℃的油浴锅中反应50min。反应结束后，将反应液转移至离心管中，8000r/min离心 10min，精密量取上清液10μL加入1mL甲醇溶解稀释后，用HPLC进行检测。结果表明(图5)，反应温度为90℃时，转化率最高，因此单因素的最优添加量为90℃。

3.液相检测条件

流动相：甲醇-水(95:5v/v)；检测波长：206nm；流速：1mL/min。二、吉马酮转化为芹子烯异构体的正交实验

在单因素实验的基础上，以α-、β-和γ-芹子烯同分异构体总峰面积的增加量为响应值，选用L₉(3⁴)正交表设计试验，各因素水平见表1。

表1 吉马酮转化为芹子烯异构体的实验因素水平表

表2 正交实验结果

最佳因素为A2、B2、C1、D3，即磷酸水溶液百分数80％、硅胶添加量 8mg、温度70℃、反应时间60min。

最优条件下进行验证，最终转化率为41.34％。转化后的液相色谱图见图6。

三、HSCCC分离实验

1.实验方法

1.1两相溶剂系统的选择

选择合适的目标化合物分配系数(K_D值)是HSCCC成功分离的最重要因素之一。在本研究中，采用HPLC法检测了目标化合物在不同比例正己烷 /乙酸乙酯/甲醇/水(HEMWat)溶剂系统的K_D值，为获得更好的分离效果，添加了AgNO₃进行配位效应分离。

化合物的K_D值采用HPLC法测定。首先，在5mL试管中制备不同比例的溶剂体系并剧烈摇晃，待充分分层平衡后，两相溶剂系统各取2mL加入 3mg粗提物，剧烈振摇1min并充分分层后，将上、下相各取0.5mL分别放入4mL离心管中，分别用2mL甲醇稀释。上相直接用HPLC分析，下相加入氯化钠除去银离子后用HPLC分析。K_D值定义为固定相中化合物的峰面积除以流动相中相应化合物的峰面积，公式如下：

K_D＝A_U/A_L

A_U和A_L为目标化合物在固定相和流动相中的峰面积。

1.2溶剂体系和样品溶液的制备

在HSCCC分离中，由正己烷/甲醇/硝酸银溶液(3mol/L)(10:9.5:0.5， v/v)组成的两相溶剂体系置于分液漏斗中。剧烈摇晃后，将溶液静置5min，待充分分层后，将上、下相分开。上相(流动相)和下相(固定相)在使用前通过超声脱气。样品溶液的制备通过将200mg转化物溶解在10mL等比例的上相和下相中。

1.3 HSCCC分离过程

首先将固定相以20.0mL/min的流速注入HSCCC分离柱。HSCCC设备在30℃下以800rpm转速顺时针旋转，流动相以2.0mL/min流速，以尾端到首端的模式泵入HSCCC分离柱。当达到流体力学平衡后，200mg样品溶液通过进样阀进样。用紫外-可见检测器在210nm处连续监测柱的流出物。使用自动进样器每5min将馏分收集到12mL试管中。分离后，用氮气吹出HSCCC分离柱中溶剂。吹出的溶剂在40℃真空浓缩，残渣用等体积正己烷萃取3次。弃去上层，下层水相40℃真空浓缩至干，回收硝酸银。

1.4半制备液相色谱分离过程

以C₁₈半制备色谱柱(5μm，10mm×250mm，i.d.)进行分离，制备液相条件：甲醇-水(92：8)，流速：10mL/min，进样量100μL。用紫外-可见检测器在206nm处连续监测柱的流出物。使用自动进样器每1min将馏分收集到12mL试管中。

1.5 HPLC分析和结构鉴定

采用HPLC色谱法对粗提物和CCC馏分进行分析。色谱柱为C₁₈柱(5 μm，4.6mm×250mm，i.d.)，流动相为甲醇和水(95:5，v/v)，流速1.0mL/min，波长206nm，进样体积5μL。分离的化合物通过ESI-MS、¹H-和¹³C-NMR 光谱进行鉴定，NMR光谱以CDCl₃作为溶剂，化学位移(δ)以百万分之一 (ppm)表示，耦合常数常数(J)以Hz表示。

2.结果与讨论

2.1两相溶剂系统的筛选

进行HSCCC分离的最重要步骤之一是选择合适的溶剂系统。根据Ito 提出的黄金法则，目标化合物在两相之间的分配系数应该在0.2-2.0的范围内，并且两个化合物之间的分离因子α值应该高于1.5。过高的K_D值可能导致洗脱时间延长和峰过宽，而过低的K_D值可能会导致峰的分离度较差，不能实现有效的分离。合适的双相系统的选择取决于目标化合物的化学性质，例如样品极性、溶解度、离子形式和形成复合物的能力。由于目标化合物的极性较小，发现正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水是理想的溶剂体系，通过改变四种溶剂的体积比可以覆盖广泛的极性范围。测试了该系统的不同体积比，并通过HPLC法测定了目标化合物的K_D值。但实际测试结果表明，化合物的K_D值均都太小，传统的HSCCC法无法将它们分开。

根据洪德规则，AgNO₃中的银离子(Ag⁺)是d¹⁰型([Kr]4d¹⁰)，占据空的s和p轨道(5s,5px,5py and 5pz)，可以与成键化合物反应形成不同的稳定性配合物。基于这一现象，银离子色谱被开发并应用于薄层色谱、高效液相色谱和超临界流体色谱，因此在本发明中使用了银离子络合逆流色谱。

目标化合物在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9:1:9:1，v/v)和(10:0:9.5:0.5， v/v)溶剂系统，不同浓度硝酸银(0～3mol/L)的K_D值结果列于表3中。结果表明，如果溶剂系统中没有[Ag⁺]，所有化合物都会很快被洗脱，无法分离。随着[Ag⁺]浓度的增加，分配系数增加，所有峰的洗脱时间延长。除了化合物1和3的分离因子(α₁₃)变化不大，其余峰之间的分离系数也有所提高。如表3所示，对于HEMWat(9:1:9:1，v/v)溶剂系统，化合物的K_D值过小，难以有效保留，分离效果过差。对于正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(10:0:9.5:0.5， v/v)溶剂系统，当水中银离子浓度保持在3mol/L时，3种化合物的K_D值几乎符合黄金法则。因此，最终选择正己烷-乙酸乙酯-甲醇-硝酸银溶液(3 mol/L)(10:0:9.5:0.5，v/v)溶剂系统用于HSCCC分离。

表3 逆流色谱分离芹子烯异构体的分配系数和分离因子

2.2逆流色谱的分离流程

如图6所示，在优化条件下，粗样品(200mg)完全溶解在选定的两相溶剂体系(20mL)中，用于HSCCC分离，参数如下：转速为800rpm，两相溶剂体系为正己烷-甲醇-硝酸银溶液(3mol/L)(10:9.5:0.5，v/v)，流动相流速2.0mL/min，分离温度为25℃。在最佳条件下，从200mg粗提物中得到化合物2(51.6mg)、化合物1+3混合物(75.5mg)，逆流色谱的固定相保留率为51％。

使用制备型HPLC进一步分离化合物1和3的混合物(图7)，得到化合物1(28.2mg)和化合物3(14.9mg)。

液相纯度如图8所示，化合物1-3的纯度分别为97.4％、97.1％和96.3％。

四、芹子烯抗肿瘤实验

1.材料与方法

1.1.实验方法与试剂

所有细胞系均购自上海生物科学研究所，高糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，PBS、DMSO溶剂(≥99％，Reagent grade)、胰酶细胞消化液(0.25％胰酶，含酚红)、青霉素-链霉素溶液(100X)购自中国Beyotime公司，CCK-8试剂盒购自中国Vazyme公司，培养瓶、多孔板和其他细胞培养塑料购自美国Corning公司。

1.2细胞培养

本研究使用了三种肿瘤细胞系：MG-63(人成骨肉瘤)、Hep G2(人肝细胞癌)、Hepa1-6(小鼠肝细胞癌)。所有的细胞均使用完全培养基(89％高糖DMEM培养基，10％FBS，1％青霉素-链霉素溶液)培养于恒温培养箱 (37℃、5％CO₂)中，并每天更换一次完全培养基，待细胞生长至80％时进行传代或实验使用。

1.3 CCK-8检测评估芹子烯对各肿瘤细胞增殖情况的影响

制备芹子烯溶液。称取100mg上述分离得到的芹子烯溶于100uL DMSO溶液中，之后补充完全培养基至10mL，制成10mg·mL^-1的芹子烯母液。后续工作将取适量芹子烯母液稀释于完全培养基中，制备成不同浓度的芹子烯溶液。

采用CCK-8检测芹子烯对各肿瘤细胞增殖情况的影响。将肿瘤细胞以 10⁴个/孔的密度接种至96孔板中，放入恒温培养箱中孵育24小时，之后将各孔中的培养液更换为完全培养基和不同浓度的芹子烯溶液(5、10、20、 40、80、160、320、640、1000μg·mL^-1)培养24小时，每个浓度做6个重复孔。给药培养24h后，在每个孔加入10uL的CCK-8检测试剂，并于37℃孵育1h。之后用酶标仪检测450nm处的吸光值，并使用GraphPad Prism 8.0.2 进行数据分析。

2.结果与讨论

2.1芹子烯能抑制MG-63、Hep G2、Hepa 1-6细胞增殖

将分离得到的芹子烯溶液对MG-63、Hep G2和Hepa 1-6三种细胞进行细胞活性检测。实验使用浓度为5、10、20、40、80、160、320、640、1000μg·mL^-1的芹子烯溶液处理细胞，并以完全培养基培养作为阴性对照。结果显示(如图9)，芹子烯对三种肿瘤细胞均表现出抑制作用，MG-63、Hep G2、Hepa 1-6 的IC₅₀分别为147.8、237.1和143.0μg·mL^-1。

实验结果显示，芹子烯对间叶组织来源的人成骨肉瘤、上皮组织来源人肝细胞癌以及对小鼠肝细胞癌均有抑制作用。据此，提示芹子烯具有潜在的广泛抗肿瘤作用。

本研究探索了芹子烯对三种肿瘤细胞系增殖情况的影响，结果显示芹子烯能在体外抑制肿瘤细胞增殖，其对MG-63、Hep G2、Hepa 1-6的半抑制浓度分别为147.8、237.1和143.0μg·mL^-1。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。