具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提出了一种醋酸泼尼松的发酵方法，选用简单节杆菌为转化菌种，将醋酸可的松转化成醋酸泼尼松。

培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重要的影响。微生物的营养活动是依靠向外界分泌大量的酶，将周围环境中大分子蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，借助于细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养物质来实现的。所有的发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源，本发明中所选用的培养基原料均为市场上简单可购得的，且价格较为适宜，以上仅是本发明涉及的原料组分的示例性展出。

该发酵方法包括以下步骤：

种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在28℃-30℃的条件下培养5-7天，种子成熟后，将成熟后的菌体使用无菌生理盐水制成悬浮液，进行真空干燥并进行低温保存；斜面培养基的成分为葡萄糖1.6％-1.8％、酵母浸膏1.5-1.8％、琼脂1％-1.5％和余量的水。

一级发酵：将保存的种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h得到一号菌丝体，二号种子罐中25℃培养40-50h得到二号菌丝体，罐压均为0.01-0.02MPa，搅拌转速为320-360r/min使种子液处于均匀状态；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.0％-2.2％、棉子粉0.8％-1％、青刺果粉0.8％-1％、酵母浸膏0.8％-1.2％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水，种子液多于正常使用量配制。

二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，24-26℃培养15-20h后，利用传感器或者取样计算此时的菌体的比生长速率、氧比消耗速率和产物比生成速率等，补入二号菌丝体继续发酵培养16-22h，再补入未接的种子液，搅拌转速为260-280r/min继续培养，直至取样后的菌丝体镜检无杂菌，菌丝粗壮、密集，原生质丰满，菌丝浮力大方可进行下一步。发酵罐中发酵液的成分和种子液相同，为葡萄糖2.0％-2.2％、棉子粉0.8％-1％、青刺果粉0.8％-1％、酵母浸膏0.8％-1.2％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。

转化：在培养后的发酵液中加入有机溶剂、醋酸可的松微粉(底物)搅拌后进行转化，30-36℃转化30-35h，转速为400-500r/min，反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。其中，溶剂包括甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种混合，优选为甲醇，甲醇可以增加醋酸可的松的溶解度，增加醋酸可的松的分解速率，该溶剂的浓度低于2％，不对微生物产生毒性，先将醋酸可的松溶解于有机溶剂中，醋酸可的松的加入速度随菌种的转化速率而定，一般浓度为300-700mg/L。

本发明实施例中所选用的部分原料如下表所示：

实施例1

一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：

种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在28℃的条件下培养7天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.6％、酵母浸膏1.5％、琼脂1％和余量的水。

一级发酵：将种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h，二号种子罐中25℃培养40h，罐压为0.01MPa，搅拌转速为320r/min，分别得到一号菌丝体和二号菌丝体；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.0％、棉子粉0.8％、青刺果粉0.8％、酵母浸膏0.8％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。

二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养15h后，补入二号菌丝体继续发酵培养16h后加入未接种孢子的种子液，搅拌转速为260r/min，发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。

转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为36℃转化30h，转速为400r/min。反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。

实施例2

一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：

种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在29℃的条件下培养6天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.7％、酵母浸膏1.65％、琼脂1.25％和余量的水。

一级发酵：将种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h，二号种子罐中25℃培养45h，罐压为0.15MPa，搅拌转速为340r/min，分别得到一号菌丝体和二号菌丝体；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.1％、棉子粉0.9％、青刺果粉0.9％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。

二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养15h时，补入二号菌丝体继续发酵培养16h后加入未接种的种子液，搅拌转速为270r/min，发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。

转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为33℃转化32h，转速为450r/min。反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。

实施例3

一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：

种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成孢子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼脂1.5％和余量的水。

一级发酵：将种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h，二号种子罐中25℃培养50h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min，分别得到一号菌丝体和二号菌丝体；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。

二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养15h时，补入二号菌丝体继续发酵培养16h后加入未接种孢子的种子液，培养4h，搅拌转速为280r/min。发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。

转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为30℃转化35h，转速为500r/min。反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。

实施例4

一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：

种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼脂1.5％和余量的水。

一级发酵：将种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h，二号种子罐中25℃培养50h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min，分别得到一号菌丝体和二号菌丝体；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。

二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养17.5h时，补入二号菌丝体继续发酵培养19h后加入未接的种子液，培养4h，搅拌转速为280r/min。发酵罐中发酵液的成分为葡萄糖2.0％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1.2％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。

转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为30℃转化35h，转速为500r/min。反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。

实施例5

一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：

种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼脂1.5％和余量的水。

一级发酵：将种子液分别接种于一号种子罐和二号种子罐中，一号种子罐中27℃培养40h，二号种子罐中25℃培养50h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min，分别得到一号菌丝体和二号菌丝体；两个种子罐中的种子液成分均为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。

二级发酵：将一号菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养20h时，补入二号菌丝体继续发酵培养22h后加入的种子液，培养4h，搅拌转速为280r/min。发酵罐中发酵液的成分为葡萄糖2.0％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1.2％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。

转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为0℃转化35h，转速为500r/min。反应完成后升温至68℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。

对比例1

一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：

种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成孢子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼脂1.5％和余量的水。

一级发酵：将种子液接种于种子罐中，培养40h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min；种子罐中的种子液成分为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。

二级发酵：将一号种子罐中的菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养35h搅拌转速为280r/min，发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。

转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为35℃转化30h，转速为500r/min。反应完成后升温至75℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。

对比例2

一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：

种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼脂1.5％和余量的水。

一级发酵：将种子液接种于种子罐中，培养45h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min；种子罐中的种子液成分为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。

二级发酵：将一号种子罐中的菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养40.5h，搅拌转速为280r/min。发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。

转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为35℃转化30h，转速为500r/min。反应完成后升温至75℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。

对比例3

一种醋酸泼尼松的发酵方法包括以下步骤：

种子液的制备：将简单节杆菌移植于斜面培养基，在30℃的条件下培养5天，种子成熟后，将成熟后的节杆菌菌种使用无菌生理盐水制成种子液；斜面培养基的成分为葡萄糖1.8％、酵母浸膏1.8％、琼1.5％和余量的水。

一级发酵：将种子液接种于种子罐中，培养50h，罐压为0.02MPa，搅拌转速为360r/min；种子罐中的种子液成分为葡萄糖2.2％、棉子粉1％、青刺果粉1％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钠0.1％和余量的水。

二级发酵：将一号种子罐中的菌丝体接种于发酵罐中，26℃培养48h，搅拌转速为280r/min。发酵罐中发酵液的成分和种子液相同。

转化：在培养后的发酵液中加入乙醇、醋酸可的松搅拌后进行转化，转化温度为35℃转化30h，转速为500r/min。反应完成后升温至75℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得底物转化率。

对上述实施例1-5和对比例1-3中的产物进行计算：

底物转化率的测定：转化率用反应过程中转化为产物的底物质量占初始底物总质量的百分比来表示。采用HPLC测定，分离柱为C18柱，检测波长为240nm，流动相是乙腈：水(体积比)＝50：50的溶于流速为1.5mL/min。采用面积归一法计算醋酸可的松转化率。

从上表可知，本发明实施例中的转化率均高于对比例中的转化率，且在其它条件相同的情况下，在一号种子罐中的菌丝体培养条件为26℃培养15h时，再补入二号种子罐中的菌丝体继续发酵培养16h后加入未接种孢子的种子液，培养4h，搅拌转速为280r/min，这个方案培养条件下转化率最高(即实施例3的方案)。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。