一种黑色素瘤细胞在药物-黑色素结合能力测定中的应用
阅读说明：本技术 一种黑色素瘤细胞在药物-黑色素结合能力测定中的应用 (Application of melanoma cells in determination of drug-melanin binding capacity ) 是由 王若男 李华 钱仪敏 宋硕 蔡丹凤 于 2020-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种黑色素瘤细胞在药物-黑色素结合能力测定中的应用。所述黑色素瘤细胞为小鼠黑色素瘤细胞B16-F10。本发明验证了将小鼠黑色素瘤细胞用于药物-黑色素结合能力的测定,其测定结果的准确性和稳定性优于现有的原代RPE细胞测定方法及游离黑色素测定的方法；并且小鼠黑色素瘤细胞(例如B16 F10)对于药物的耐受性高于原代RPE细胞,其在用于测定药物-黑色素结合能力中可以耐受更强的药物副作用即适用于药物浓度更高的测定场景。(The invention discloses an application of melanoma cells in determination of drug-melanin binding capacity. The melanoma cell is mouse melanoma cell B16-F10. The invention verifies that the melanoma cells of the mice are used for determining the binding capacity of the medicament-melanin, and the accuracy and the stability of the determination result are superior to those of the prior primary RPE cell determination method and the free melanin determination method; and the tolerance of mouse melanoma cells (such as B16F 10) to drugs is higher than that of primary RPE cells, and the mouse melanoma cells can tolerate stronger drug side effects in the determination of drug-melanin binding capacity, namely the mouse melanoma cells are suitable for determination scenes with higher drug concentration.)
技术领域
本发明属于药物检测领域，具体涉及一种黑色素瘤细胞在药物-黑色素结合能力测定中的应用。
背景技术
黑色素是一种阴离子型聚合物，广泛存在于眼睛、皮肤、脑和内耳中。眼中黑色素分布于葡萄膜层(包括虹膜、睫状体和脉络膜)和视网膜色素上皮层(retinal pigmentepithelium,RPE)。许多药物能够与黑色素发生结合，在眼组织中产生积聚，影响其在眼内的药动学，干扰正常的视网膜功能，对视力造成无法预料的后果。不仅是眼科药物，许多全身给药的非眼科药物也会与眼黑色素发生结合，例如目前治疗系统性红斑狼疮使用最广泛的药物——羟氯喹，临床上最主要的不良反应就是能够导致黄斑变性、视网膜萎缩等眼部毒性。研究发现，氯喹和羟氯喹对色素沉着的组织具有亲和力，尤其是与眼睛中的RPE，因此，服用羟氯喹所导致的眼毒性可能与黑色素结合有关；抗精神病药硫利哒嗪对色素沉着组织也具有亲和力，能够在RPE中积聚，高剂量时可引起视网膜色素的破坏。对长期服用硫利哒嗪的患者进行眼底检查发现，患者的RPE形成了色素大斑块并且伴有脉络膜毛细血管的丢失，如果用药期间不进行严格的视功能监测，可能最终会导致进行性黄斑变性和视力功能的丧失。除此之外，氯丙嗪、他莫昔芬、美金刚等药物都显示出较高的眼黑色素结合能力，虽然不是所有与黑色素具有高亲和力的药物都一定会引起眼毒性，但药物—黑色素结合的现象应当引起我们的重视。一方面，药物—黑色素结合会影响药物本身的药动学和药效学；另一方面，RPE在维持视网膜感光细胞的完整性和生理功能方面发挥着重要的作用，对RPE的毒性作用最终将影响视神经，导致视力功能的丧失。
目前，体外研究药物—黑色素结合能力的方法主要有两类：一类是利用药物与游离的黑色素在体外孵育，黑色素的来源为人工合成的或从动物眼中提取的黑色素；另一类是利用药物与含有黑色素的细胞在体外孵育，常用的细胞模型为猪或牛的原代RPE细胞，新鲜提取的原代RPE细胞富含黑色素，但提取过程复杂易受到组织中其他类型细胞的污染，且原代RPE细胞无合成黑色素的能力，随着传代数目的增加细胞中黑色素的含量不断减少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了解决现有技术中游离黑色素测定的药物-黑色素结合数值与体内代谢差异较大、原代RPE细胞中黑色素含量随传代数目增加而减少的缺陷，提供一种黑色素瘤细胞在药物-黑色素结合能力测定中的应用。
由于本领域尚未有使用黑色素瘤细胞进行本发明的发明人通过实验，验证了小鼠黑色素瘤细胞B16在测定药物-黑色素结合能力的可行性，并意外发现黑色素瘤细胞，特别是B16-F10的效果优异，可以达到简化实验流程和测试结果稳定的效果。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种黑色素瘤细胞在药物-黑色素结合能力测定中的应用，其中所述黑色素瘤细胞为小鼠黑色素瘤细胞B16。
所述的小鼠黑色素瘤细胞B16可为本领域常规，较佳地为小鼠黑色素瘤细胞B16-F10。
较佳地，所述测定包括以下步骤：将所述黑色素瘤细胞与药物混合后培养。所述培养的时间优选15-25h；更优选，所述培养的时间为20h。
所述培养过程中，所述黑色素瘤细胞的密度较佳地为1×105个/mL～2×105个/mL，更佳地为1.25×105个/mL。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种药物-黑色素结合能力的检测方法，其中所述检测方法包括下列步骤：
(1)将小鼠黑色素瘤细胞B16与所述药物混合后培养；
(2)检测所述药物与所述小鼠黑色素瘤细胞中所述黑色素的结合情况。
对于以上步骤中的优选限定同如上所述的技术方案之一，具体如下。
较佳地，步骤(1)中所述培养的时间为15-25h，优选20h；
其中所述小鼠黑色素瘤细胞B16，较佳地为B16-F10；例如，可为购自上海富衡生物科技有限公司的B16-F10。
较佳地，步骤(1)中进行所述培养时，所述黑色素瘤细胞的密度1×105个/mL～2×105个/mL，优选1.25×105个/mL。
较佳地，步骤(2)中所述的结合情况通过细胞培养后培养基上清中所述药物的浓度体现。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明采用小鼠黑色素瘤细胞(优选B16 F10)，其富含黑色素且来源丰富易得，与提取的黑色素相比，具有完整的屏障和转运机制，可调节药物从细胞中的吸收和清除，更加接近体内真实的生物环境。本发明验证了将小鼠黑色素瘤细胞用于药物-黑色素结合能力的测定，其测定结果的准确性和稳定性优于现有的原代RPE细胞测定方法及游离黑色素测定的方法；并且小鼠黑色素瘤细胞(例如B16 F10)对于药物的耐受性高于原代RPE细胞，其在用于测定药物-黑色素结合能力中可以耐受更强的药物副作用即适用于药物浓度更高的测定场景。
附图说明
图1为紫外分光光度计测定吸光度与黑色素浓度之间关系的标准曲线。
图2为LC-MS/MS定量下限：待测物。
图3为LC-MS/MS定量下限：内标。
图4为LC-MS/MS定量上限：待测物。
图5为LC-MS/MS定量上限：内标。
图6为LC-MS/MS测定峰面积与硫酸羟氯喹药物浓度的标准曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例所用实验材料、试剂、仪器信息：
1.细胞株
小鼠B16 F10细胞，货号：FH0361，上海富衡生物科技有限公司
2.试剂
硫酸氢氯喹：
批号：190804，重庆康乐制药有限公司，有效期：2021.05.05。
合成黑色素：
批号：BCBZ9117，来源：Sigma-Aldrich，有效日期：2029.12.18。
1640培养基：
批号：2174114，来源：Gibco，有效期：2020.11.30。
胎牛血清：
批号：1928700，来源：Gibco，有效期：2024.07.31。
胰蛋白酶：
批号：NM01，来源：absin，有效期：2021.04.05。
3.材料和仪器
6孔板：
型号：3516，品牌：costar
紫外-可见分光光度计：
品牌型号：Agilent Carry60 UV-VIs
实施例1B16细胞培养
小鼠黑色瘤B16细胞置于含10％胎牛血清、青链霉素(100kU·L－1)的1640培养基(pH＝7.2)中培养，培养条件为37℃、5％CO2且相对饱和湿度，取对数生长期的细胞用于后续实验。
实施例2硫酸羟氯喹的配制
取一定量的硫酸羟氯喹加到特定体积的PBS(pH7.4)中，使成浓度1mM，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，用1640培养基稀释至相应浓度，标记好待用。
实施例3黑色素含量标准曲线及药物与游离黑色素结合能力测定
称取10mg合成黑色素，加入10mL PBS，超声15min，使成1mg/mL的黑色素混悬液。用PBS稀释到100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL、10μg/mL和2μg/mL。测定在475nm处的吸光度值。以吸光度值为横坐标，浓度为纵坐标，进行线性回归，得到黑色素含量的标准曲线：y＝67.402x-0.5928,R2＝0.9998。见图1。
药物硫酸羟氯喹与游离黑色素的结合能力测定结果见表1。
表1.硫酸氢氯喹与合成黑色素的结合能力
实施例4药物-黑色素结合能力测定
取B16细胞以1.25×105个mL－1接种于6孔板中，每孔2mL，37℃、5％CO2培养过夜。加入2mL浓度为0.31、1、5、10和20μM的硫酸羟氯喹，设置3个复孔，在37℃恒温培养箱孵育20h，收集上清液置于4℃冰箱待测。
收集上清液后，用PBS清洗2次细胞，消化并收集细胞于离心管中(共2mL，其中取20μL稀释一定倍数用于计数)，在1000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，加入1mL含10％DMSO的1mol/L NaOH溶液，重悬，于80℃水浴孵育45min，测定在475nm处的吸光度值。将吸光度值带入到标准曲线(y＝67.402x-0.5928,R2＝0.9998)中，求出对应的黑色素含量。
一式三份，用LC-MS/MS测定孵育20h后细胞培养基中硫酸羟氯喹的浓度。
LC-MS/MS相关参数与实验方法：
一、仪器
·AB SCIEX TRIPLE QUADTM 4500液质联用仪
·离心机
·微量分析天平，精确至0.001mg
·漩涡混合器
·纯水仪(电阻率≥18.2MΩ.cm)
·Analyst数据采集软件(Version 1.7.0)
·色谱柱：XBridge BEH C18,2.5μm,2.1×50mm，Waters
·移液器(20μL，100μL，200μL，300μL，1000μL)
·电动移液器
二、仪器参数
1.液相条件：
进样量：5μL
色谱柱：Xbridge BEH C18,2.5μm,2.1×50mm，Waters
柱温：40.0℃
进样器温度：4℃
流动相A：0.1％FA in H2O
流动相B：0.1％FA in ACN
运行时间：5.0min
流动相梯度：
洗针溶剂：强洗(MeOH:ACN:IPA:DMSO＝1:1:1:1，v/v/v/v)
弱洗(MeOH:H2O＝1:1，v/v)
洗针程序：Rinse Type:External only；
Rinse mode:Before and after aspiration,Dip time:1s；
Rinse pump method:Rinse pump,then Port,Time:2s；
Rinse settings:Rinsing speed:35μL/s；
Rinse volume:500μL；
Measuring line purge volume:100μL；
保留时间：
2.质谱条件
仪器型号：AB SCIEX TRIPLE QUADTM 4500
离子源：ESI
离子化模式：正离子
MRM离子对：
仪器参数：
参数
硫酸氢氯喹
拉贝洛尔
IS(v)
5500
5500
TEM(℃)
500
500
CAD
9
9
CUR(psi)
30
30
Gas 1(psi)
25
25
Gas 2(psi)
40
40
DP(v)
115
65
EP(v)
10
10
CE(v)
30
20
CXP(v)
14
11
三、试剂的配制
1.流动相A(MPA)：0.1％FA in H2O
取1000mL H2O中加入1mL FA于溶剂瓶中，混匀。室温保存有效期1个月。
2.流动相B(MPB)：0.1％FA in ACN
取1000mL ACN中加入1mL FA于溶剂瓶中，混匀。室温保存有效期1个月。
3.强洗溶液(SNW)：MeOH:ACN:IPA:DMSO＝1:1:1:1，v/v/v/v取500mL MeOH，500mLACN，500mL IPA，500mL DMSO，混匀。
室温保存有效期3个月。
4.弱洗溶液(WNW)：ACN:H2O＝1:1，v/v
取1000mL ACN，1000mL H2O，混匀。室温保存有效期3个月。
5.工作液稀释液&复溶液(Diluent):MeOH:H2O＝1:1，v/v
取500mL MeOH，500mL H2O，混匀。室温保存有效期3个月。
6.沉淀剂(Precipitant):MeOH
取500mL MeOH。室温保存有效期3个月
7.储备液稀释液(Diluent1)：MeOH
取30mL MeOH。室温保存有效期3个月。
8.拉贝洛尔储备液稀释液(Diluent2)：DMSO
取30mL DMSO。室温保存有效期3个月。
四、标准曲线和质控的配制
储备液和工作液均储存于超低温冰箱(-70～-90℃)中。
1.标曲储备液的配制
精密称取适量硫酸羟氯喹于样品瓶中，加入适量甲醇超声溶解、摇匀，配制成浓度为0.500mg/mL的标曲储备液。(质量折算因子为0.773。)
2.标曲&SST工作液的配制(工作液稀释液：MeOH:H2O＝1:1)
使用标曲储备液，依照下表配制，得到标曲&SST工作液：
硫酸羟氯喹标曲&SST工作液配制
3.标准曲线&SST样品的配制
使用标曲&SST工作液，依照下表配制，得到标准曲线&SST样品：
硫酸羟氯喹标准曲线&SST样品的配制
标准曲线样品储存于超低温冰箱(-90～-70℃)中。
4.质控储备液的配制
精密称取适量硫酸羟氯喹于样品瓶中，加入适量甲醇超声溶解、摇匀，配制成浓度为0.500mg/mL的质控储备液。(硫酸羟氯喹的质量折算因子为0.773。)
5.质控工作液的配制(工作液稀释液：MeOH:H2O(ml:ml)＝1:1)
使用质控储备液，依照下表配制，得到质控工作液：
硫酸羟氯喹质控工作液配制
6.质控样品的配制
使用质控工作液，依照下表配制，得到质控样品：
硫酸羟氯喹质控样品的配制
质控样品储存于超低温冰箱(-70～-90℃)中。
7.内标储备液的配制
精密称取适量盐酸拉贝洛尔于棕色样品瓶中，加入适量盐酸拉贝洛尔储备液稀释液溶解、摇匀，配制成浓度为1.000mg/mL的内标储备液。(盐酸拉贝洛尔的质量折算因子为0.998。)
内标工作液的配制(工作液稀释液：MeOH:H2O＝1:1)
使用内标储备液，依照下表配制，得到内标工作液：
盐酸拉贝洛尔内标工作液配制
五、样品处理步骤
LC-MS/MS结果见图2-图5。
LC-MS/MS测定峰面积与硫酸羟氯喹药物浓度的标准曲线见图6，标准曲线为y＝0.00569x-0.000292，R2＝0.9958。
以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。初始加入的硫酸羟氯喹的浓度为[L0]，孵育20h后测得的上清液中的硫酸羟氯喹的浓度为[L]，根据公式(1)计算不同初始浓度下的硫酸羟氯喹和培养基中硫酸羟氯喹浓度的比例：
Vw为每孔中培养基的体积，Vcell为细胞体积(3μL/106个细胞)，m为细胞内黑色素的质量。
硫酸羟氯喹与小鼠B16-F10细胞的结合能力测定结果见表2。
表2.硫酸羟氯喹与B16细胞的结合能力
根据上述表格可知：使用黑色素瘤细胞可以准确、稳定地测定游离黑色素。
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