具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明所有原料和试剂均为市售，其中PCX(40-60μm)购自天津博纳艾杰尔公司。

实施例 荷叶生物碱的制备

提取：取荷叶，粉碎，85％乙醇，液料比1:50回流提取，每次提取1.5小时，共提取2次，浓缩，得荷叶生物碱粗提取物；

大孔吸附树脂纯化：

装柱：精密称取预处理好的大孔吸附树脂，进行湿法装柱，用乙醇洗至流出液与水混合(V∶V＝1∶5)不产生白色浑浊，再用蒸馏水洗至流出液无醇味即可，放置12h。

上样：荷叶生物碱粗提取物浓缩至每毫升醇提物相当于原药材0.15g进行上样，上样体积为1BV，待吸附2h后开始洗脱。

洗脱：首先用4BV蒸馏水进行洗脱，再用4BV 30％、50％、60％、70％乙醇进行梯度洗脱，合并收集1BV-3BV 60％、1BV-3BV 70％乙醇洗脱液，回收溶剂，蒸干，得固体粉末，即为荷叶大孔吸附树脂纯化物。

PCX分散固相萃取：将上述荷叶大孔吸附树脂纯化物0.2g，加甲醇溶解并稀释至100mL，加入到盛有PCX填料(每10mL溶液对应于300mg PCX)的烧杯中，磁力搅拌5min后，进行抽滤，将PCX转移至另一烧杯中，再加入相当于荷叶大孔吸附树脂纯化物甲醇溶液4倍体积的甲醇(即每20mg荷叶生物碱大孔吸附树脂纯化物使用40ml)，磁力搅拌5min后，进行抽滤；再将PCX转移至烧杯中，加入相当于荷叶大孔吸附树脂纯化物甲醇溶液3倍体积的5％氨-甲醇溶液(即每20mg荷叶生物碱大孔吸附树脂纯化物使用30ml)，磁力搅拌5min后，进行抽滤，收集5％氨-甲醇洗脱液，回收溶剂，蒸干，得固体粉末，即为荷叶生物碱。

按照上述制备过程共制备三批荷叶生物碱。

试验例 荷叶生物碱制备条件的筛选

以下是荷叶生物碱制备各条件的筛选试验。

一、荷叶碱的提取工艺优化研究

采用乙醇加热回流提取的方法，以提取液中荷叶碱的含量为指标，考察了乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数对荷叶中生物碱类成分提取率的影响，确定最佳提取工艺。

1.1乙醇浓度的考察

称取荷叶粉末约3.0g,精密称定，分别加入75％、80％、85％、90％的乙醇作为提取剂，在料液比(g/mL)为1:20的条件下进行回流提取，提取2次，每次1.5h，过滤，合并滤液并定容至100mL，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过后用HPLC分析。

实验结果见表1。由表1可知，当乙醇浓度为85％时，荷叶碱的提取率最大，因此，选择85％的乙醇作为提取溶剂。

表1乙醇浓度考察

1.2料液比的考察

分别称取荷叶细粉约3.0、3.0、1.0、0.5g,精密称定，以85％乙醇为提取溶剂，以料液比(g/mL)分别为1:10、1:25、1∶50、1∶100提取条件下，提取2次，每次1.5h，过滤，合并滤液并定容至100mL(料液比为1∶10的定容至50mL)，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过后用HPLC分析。实验结果见表2，由表2可知，当料液比1：50时，荷叶碱的提取率为最高，因此，确立料液比为1：50。

表2液料比考察

1.3提取时间的考察

称取荷叶粉末约1.0g，精密称定，以85％乙醇作为提取剂，在料液比(g/ml)为1:50，提取温度为85℃提取条件下进行提取，分别提取1.0h,1.5h,2.0h,2.5h，提取2次，过滤，合并滤液并定容至100mL，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过，液相分析。见表3，由实验结果可知，提取时间对荷叶碱的提取率影响不大，最终确定为提取时间为1.5小时。

表3提取时间的考察

1.4提取次数的考察

称取荷叶粉末约1.0g，精密称定，以85％乙醇作为提取剂，在料液比(g/mL)为1:50，提取温度为85℃提取条件下进行回流提取，提取次数分别为1,2,3，4次，每次1.5h，过滤，合并滤液，合并滤液并定容至100mL，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过，液相分析。见表4，由表可知，当提取3次时，荷叶碱的提取率为最高，但是提取2次与提取3次的荷叶碱的提取率相差不大，因此，综合考察到实验效率，最终确定提取次数为2次。

表4提取次数的考察

综上所述，可知荷叶生物碱乙醇回流提取的最佳条件为：85％乙醇为提取溶剂，料液比为1：50，每次提取1.5小时，共提取2次。

1.5最佳条件的确认

在上述最佳实验条件下，三次的平均提取率为0.0886％。见表5。

表5最佳条件的确认

荷叶碱提取率＝荷叶碱的质量/所取荷叶药材的质量×100％

二、大孔吸附树脂纯化方法的条件优化

1.实验方法

装柱：精密称取预处理好的大孔吸附树脂250g，进行湿法装柱，用乙醇洗至流出液与水混合(V∶V＝1∶5)不产生白色浑浊，再用蒸馏水洗至流出液无醇味即可，放置一夜。

上样：在上述最佳条件下得到的醇提液进行浓缩，浓缩至每毫升醇提物相当于原药材0.15g进行上样，上样体积为1BV，待吸附2h后开始洗脱。

洗脱：首先用4BV蒸馏水进行洗脱，再用4BV 30％、50％、60％、70％乙醇进行洗脱，合并收集1BV-3BV 60％、1BV-3BV 70％乙醇洗脱液，回收溶剂，蒸干，得固体粉末，即为荷叶大孔树脂纯化物。

2大孔吸附树脂最佳纯化条件的考察

2.1泄露曲线的考察

精密称取预处理过的大孔吸附树脂250湿法装柱，分别以0.5BV、1BV、1.5BV、2BV上样，接收柱后流出液，测定其中荷叶碱的浓度，见表6。

表6泄露曲线的考察

由实验结果可知，当上样体积达到1.5BV时，流出液中荷叶碱浓度变大，说明此时大孔吸附树脂已经达到了饱和，因此，确定最佳上样体积为1BV。

2.2洗脱液浓度的考察

精密称取预处理过的大孔吸附树脂250g湿法装柱，1BV上样，上样2h后开始洗脱，分别以4BV的水、4BV的30％的乙醇洗脱除杂，再分别以50％、60％、70％、80％(4BV)的乙醇进行洗脱，每0.5倍柱体积洗脱液单独接收，测定洗脱液中荷叶碱的浓度，见表7。

表7洗脱液浓度的考察

在实验过程中，分别单独接收50％、60％、70％、80％乙醇洗脱液1-3BV，回收溶剂后进行PCX分散固相萃取的实验研究，结果发现，50％、80％乙醇洗脱的经过PCX纯化后纯度没有60％、70％的高，因此，确定为接收1-3BV的60％、1-3BV 70％洗脱液。

3大孔吸附树脂条件的确认

精密称取预处理过的大孔吸附树脂3份，每份250g，装柱(半径2cm,柱高26cm,柱体积330mL)，1BV上样，上样2h后开始洗脱，分别用4BV水、4BV 30％洗脱以除去杂质，再分别用4BV的50％、60％、70％乙醇洗脱，合并收集1-3BV 60％、1-3BV 70％乙醇洗脱液，回收溶剂，蒸干，得固体粉末，即为荷叶大孔树脂纯化物。

精密称取大孔吸附树脂纯化物约0.2g，用甲醇稀释至25mL，摇匀，再精密吸取0.5mL至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进液相色谱法分析，计算荷叶碱的含量。结果见表8，由结果可知，三批次的大孔树脂纯化物中荷叶碱的含量为6.84-7.40％之间。

表8大孔吸附树脂条件的确认

综上所述，大孔树脂纯化的最佳条件为：

装柱：精密称取预处理好的大孔吸附树脂250g，进行湿法装柱，用乙醇洗至流出液与水混合(V∶V＝1∶5)不产生白色浑浊，再用蒸馏水洗至流出液无醇味即可，放置一夜。

上样：在上述最佳条件下得到的醇提液进行浓缩，浓缩至每毫升醇提物相当于原药材0.15g进行上样，上样体积为1BV，待吸附2h后开始洗脱。

洗脱：首先用4BV蒸馏水进行洗脱，再用4BV 30％、50％、60％、70％乙醇进行洗脱，合并收集1BV-3BV 60％、1BV-3BV 70％乙醇洗脱液，回收溶剂，蒸干，得固体粉末，即为荷叶大孔树脂纯化物。

三、PCX分散固相萃取

1.实验方法

将上述大孔吸附树脂纯化物约0.2g,加甲醇溶解并稀释至100mL，分别加入到盛有PCX填料(每10mL溶液对应于300mgPCX)的烧杯中，磁力搅拌5min后，进行抽滤，将PCX转移至另一烧杯中，再加入4倍体积的甲醇，磁力搅拌5min后，进行抽滤；再将PCX转移至烧杯中，加入3倍体积的5％氨-甲醇溶液，磁力搅拌5min后，进行抽滤，收集5％氨-甲醇洗脱液,回收溶剂，蒸干，得固体粉末，即为荷叶生物碱。

2实验条件考察

2.1PCX用量的考察

将上述大孔吸附树脂纯化物0.2g,加甲醇溶解并稀释至100mL(荷叶碱的含量为0.146mg/mL)，量取上述溶液10mL,分别置于装有50、100、150、200、250、300、350、400mg PCX填料的烧杯中，按“1实验方法”进行纯化，分别测定每个母液中荷叶碱的浓度。结果见下表。由表可知，当PCX用量达到300mg时，母液中的荷叶碱含量比较小，说明绝大部分的生物碱已被PCX所吸附，当继续增加填料用量时，母液中的荷叶碱浓度并未见明显降低，说明能填料用量达到饱和状态，因此，PCX填料的用量选择为每10mL大孔吸附树脂纯化物为300mg的PCX，见表9。

表9 PCX用量的考察

2.2氨甲醇用量的考察

将上述大孔吸附树脂纯化物0.2g,加甲醇溶解并稀释至100mL(荷叶碱的含量为0.146mg/mL)，量取上述溶液10mL,置于盛有300mg PCX填料的烧杯中，按“本部分1实验方法”进行纯化，通过进行多次用小体积(10mL)洗脱剂洗脱，把洗脱后的洗脱液进HPLC分析，分别收集洗脱液，测定洗脱液中荷叶碱的浓度。由实验结果可知，荷叶碱的浓度在使用第1个10mL洗脱剂时最大，说明大部分的荷叶生物碱类成分在第一个10mL洗脱剂时被洗脱下来，且随着洗脱剂体积的不断增加，不断有生物碱类成分被洗脱下来。但第四个10mL(总量40mL)洗脱剂中生物碱的峰面积非常小，说明通过前3个10mL洗脱剂的洗脱，大部分生物碱都洗脱下来了。因此，综合考虑到荷叶碱的洗脱率与实际操作，最终选择30mL 5％氨-甲醇进行洗脱，见表10。

表10氨甲醇用量的考察

2.3氨浓度的考察

将上述大孔吸附树脂纯化物0.2g,加甲醇溶解并稀释至100mL(荷叶碱的含量为0.146mg/mL)，量取上述溶液10ml,置于盛有300mg PCX填料的烧杯中，按“1实验方法”进行纯化，再分别加入30mL 0％、2％、5％、10％氨-甲醇进行洗脱，收集洗脱液。将得到的洗脱液进HPLC分析。由实验结果可知，当氨水浓度在0％-5％变化时，随着氨水浓度的增加，洗脱液中荷叶碱的浓度，说明在碱性条件下，荷叶碱从强阳离子交换吸附剂中缓慢地被洗脱出来，在氨水浓度为5％时，峰面积达到最大。但当氨浓度继续增加至10％时，洗脱液中荷叶碱的峰面积并未见明显增加，因此选择5％为最佳氨浓度。

综上所述，PCX分散固相萃取的最佳条件是：将上述荷叶大孔吸附树脂纯化物0.2g，加甲醇溶解并稀释至100mL，得荷叶大孔吸附树脂纯化物甲醇溶液，将溶液加入到盛有PCX填料(每10mL溶液对应于300mg PCX)的烧杯中，磁力搅拌5min后，进行抽滤，将PCX转移至另一烧杯中，再加入相当于荷叶大孔吸附树脂纯化物4倍体积的甲醇(即每20mg荷叶生物碱大孔吸附树脂纯化物使用40ml)，磁力搅拌5min后，进行抽滤；再将PCX转移至烧杯中，加入相当于荷叶大孔吸附树脂纯化物3倍体积的5％氨-甲醇溶液(即每20mg荷叶生物碱大孔吸附树脂纯化物使用30ml)，磁力搅拌5min后，进行抽滤，收集5％氨-甲醇洗脱液，回收溶剂，蒸干，得固体粉末，即为荷叶生物碱。

以下通过分析测试例来说明本发明的有益效果：

分析测试例

HPLC色谱条件：U-3000高效液相色谱仪(美国戴安公司)，色谱柱Phenomenex C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈-水-三乙胺-冰醋酸(27：70.6：1.6：0.78)；检测波长为270nm；流速1mL/min；柱温30℃；进样量10μL。

对照品溶液的制备：精密称取N-去甲荷叶碱、O-去甲荷叶碱、荷叶碱和莲碱四种对照品各4.98、5.23、4.92、1.96mg，分别置10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即为对照品储备液；精密吸取上述标准储备液N-去甲荷叶碱、O-去甲荷叶碱、荷叶碱和莲碱各0.5、1、1、1mL至25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。

标准曲线的建立：取混合对照品溶液，分别精密进样1、2、5、10、20μL，以对照品的质量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，建立荷叶中四个生物碱成分定量的标准曲线。实验结果表明，各成分在各自范围内呈现良好的线性关系，结果见表11。

表11四种生物碱线性回归方程

供试品溶液的制备：取本发明实施例制备的三批荷叶生物碱约6mg，精密称定，至100mL量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。供试品溶液按上述液相色谱条件进行分析，得到的荷叶纯化物中四种生物碱的含量见表12，图1。

表12纯化物中主要生物碱含量

注：荷叶碱转移率，是指纯化物中的荷叶碱占荷叶醇提物中荷叶碱的比例，即表示经过纯化过程有多少荷叶碱转移到了终产品中。

在以上最佳制备条件，进行三次制备实验，得到的荷叶生物碱的得率及转移率见表13。

表13荷叶生物碱的得率及转移率

注：荷叶生物碱的得率，是指最终得到的荷叶生物碱纯化物质量占所用荷叶药材质量的比例；荷叶碱转移率，是指纯化物中荷叶碱的质量占药材中荷叶碱质量的比例，即表示经过纯化过程，原药材中有多少荷叶碱转移到了最终的荷叶生物碱中

综上所述，本发明制备的荷叶生物碱纯度好，其中，荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、莲碱含量高，其中荷叶碱含量最高，可达30.12％，纯化过程中，荷叶碱的转移率高，高达43.15％，得率也较高，为0.13％～0.14％。本发明制备的荷叶生物碱可以用于制备减肥降脂的药物，对促进荷叶资源的合理利用，加强荷叶减肥降脂其相关产品的深度开发具有重要的意义，临床及市场前景优良。