具体实施方式

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明利用不同优化算法对SARS-COV-2病毒B.1.617.2突变株Spike蛋白的编码DNA序列进行优化，得到具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90%一致性的核苷酸序列的DNA分子。该DNA分子能够高效转录、更有利于与在真核表达系统中高效表达SARS-COV-2病毒B.1.617.2 突变株Spike抗原，并且具有良好的免疫原性，能够诱导特定的体液免疫和细胞免疫应答。

可以理解的是，在本发明中，“一致性”指的是核苷酸序列之间的相似性，包括与本发明所述的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90%（例如可以为，但不限于90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高）一致性的核苷酸序列。

可选地，优化还包括将SARS-COV-2病毒B.1.617.2 突变株基因信号肽替换为高效表达信号肽，以此提高该DNA序列在宿主内的表达效率。

本发明还提供了与上述DNA分子相关的生物材料：

（a）重组表达载体，包括本发明提供的DNA分子。其中载体可以为真核表达载体，通过细胞转录和翻译机制生成该DNA分子编码的蛋白。可选地，载体可具有表达信号，诸如强启动子、强终止密码子，启动子与克隆基因之间距离的调节，以及转录终止序列和PTIS的插入。优选地，所述真核表达载体包括pVAX1，但不限于其他能够表达DNA并且使细胞能够将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。

（b）细胞，将本发明提供的DNA分子或（a）所述的重组表达载体导入宿主细胞中得到。其中，宿主细胞可为真核细胞，典型的可以为昆虫细胞、酵母、禽类细胞或哺乳动物细胞，以及其他适宜的宿主细胞。所述细胞包括HEK293、CHO、COS-7等细胞。

（c）多肽，由本发明提供的DNA分子编码。基于该多肽，也可以提供能够与其特异性结合的抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。

可以理解的是，本发明提供的生物材料均可作为生物模块直接应用于不同需求和场景的生产中。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了上述的DNA分子或生物材料在制备预防和/或治疗SARS-COV-2病毒感染的疫苗，和/或，在制备预防和/或治疗SARS-COV-2病毒引起的相关疾病的药物中的应用，相关疾病例如肺部损伤、大脑损伤，肝肾损伤、心脏损伤。

优选地，所述SARS-COV-2病毒包括B.1.617.2 突变株、野生株、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株、B.1.526突变株、C.37突变株或B.1.617.1突变株。

基于上述编码SARS-COV-2病毒B.1.617.2 突变株抗原的DNA分子的有益效果，本发明还提供了包括上述DNA分子的DNA疫苗。

该DNA疫苗在哺乳动物细胞内能够有效转录并表达SARS-COV-2病毒B.1.617.2 突变株Spike抗原，激发出更为高效地免疫反应，对于体液免疫应答，该DNA疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体；对于细胞免疫应答，该DNA疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ和IL-4反应，而且能够诱导抗原特异性CD8IFNγ T细胞亚群的产生。

在一些实施方式中，所述DNA疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂，以增加其活性成分DNA分子在受试者体内产生免疫应答的能力。其中药学上可接受的佐剂可以选自铝佐剂和/或TLRs配体和/或金属离子如Mn²⁺、Zn²⁺和/或细胞因子和/或趋化因子佐剂等。

在另一些实施方式中，所述DNA疫苗还包括至少一种对SARS-COV-2病毒有治疗作用的药物，以加强该疫苗对SARS-COV-2病毒引起的相关疾病的治疗作用。

本发明提供的DNA疫苗其作用机理为：将SARS-COV-2病毒B.1.617.2 突变株表面抗原Spike抗原编码DNA首先利用不同优化算法对DNA序列进行优化，其次将其野生型基因信号肽替换为高效表达信号肽后、插入真核表达载体，将其导入宿主细胞内，使其在宿主细胞高效表达病毒Spike抗原，经过抗原提呈过程系统地激活抗病毒体液免疫应答及细胞免疫应答。激活的体液免疫应答所产生的抗体可以预防病毒的侵入，以及激活的细胞免疫应答可进一步清除受病毒感染的细胞，以及调节由于ADE的潜在副作用引发的不良反应。

基于上述作用机理，本发明还提供了上述的DNA疫苗的应用，包括：

（i）调整机体的免疫功能；

（ii）抗SARS-COV-2病毒感染；

（iii）防止免疫病理损伤。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。

实施例1：编码S蛋白的核酸优化筛选

为了增加靶蛋白在宿主细胞中的蛋白表达，需要对靶基因的核酸序列进行优化，核酸序列优化一般原理为：（1）根据宿主细胞对于核酸密码子的偏好性对简并密码子进行优化，使优化后的序列含有更多利于宿主细胞识别的核酸密码子；（2）在密码子偏好优化的基础上进一步优化核酸序列中的GC含量，使GC含量优化后的序列能够表达出更多的靶蛋白；（3）优化核酸序列使其能够转录出更加稳定的mRNA，利于靶蛋白的翻译；（4）改变宿主偏好性的密码子频度，提高CAI指数（密码子适应指数）。本申请通过对野生型SARS-COV-2病毒B.1.617.2突变株表面蛋白Spike的编码核苷酸序列进行优化，调整其中核苷酸序列中的GC含量；同时改变宿主偏好性的密码子频度，提高CAI(密码子适应指数)指数；减少形成RNA二级结构自由能，减少Negative CIS元件比例，降低序列中重复序列比例，此外进行信号肽的优化，并结合发明人该领域多年的经验形成的本公司特有的算法，从而能够进一步提高其表达量，得到优化后的核苷酸序列，并将其制成核酸疫苗。

优化过程：选取优化前野生B.1.617.2 突变株Spike（S蛋白）序列（EPI_ISL_3161912，GISAID）作为抗原序列，根据优化策略得到本发明当中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，采用常规商业化数据库优化策略得到SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。对本发明中优化前野生B.1.617.2序列、优化后SEQ ID NO：1以及常规商业化优化得到的SEQ ID NO：3的核苷酸序列进行评分；在DNA序列优化增加表达方面，优化效果与DNA优化的关键指标如：密码子优化指数成正相关，GC含量成正相关，与负调控元件的数量成负相关。如图1-图3所示，结果表明对B.1.617.2 突变株Spike序列进行优化后，发现本发明采用的优化策略在关键指标上与常规商业化优化策略相比有着明显的提升，可以预示本发明采用的优化策略能够增加优化基因的表达效率。

将上述B.1.617.2 突变株优化前野生序列、优化后本申请中SEQ ID NO：1以及常规商业化数据库得到的SEQ ID NO：3的3个核苷酸序列分别转化构建入pVAX1载体（ThermoFisher，货号：V26020）中，得到3种质粒DNA: pB.1.617.2-野生、pB.1.617.2和pB.1.617.2-常规优化。将3种质粒分别转染至HEK293T细胞株48h后提取RNA，采用qPCR的方法鉴定不同优化方式得到的质粒DNA的转录水平。结果如图4所示，本发明优化后B.1.617.2突变株DNA序列在RNA转录水平相比于优化前野生序列可以增加300多倍，而且在RNA转录水平相比于商业化数据库常规优化的分子可以增加6倍多，进一步的说明本发明的优化得到的核酸分子优于常规商业化数据库得到的分子。DNA疫苗转录水平的提高可以使得蛋白表达量得到提高，从而提高DNA疫苗的免疫效果，本发明设计获得的序列在转录水平取得了非常显著的提高，其蛋白表达量也得到显著的改善，从而获得显著的更优的免疫效果。

实施例2：DNA疫苗的构建过程

1.新冠病毒候选DNA疫苗的制备方法

1.1.质粒的构建

如实施例1所述，根据B.1.617.2 突变株序列（EPI_ISL_3161912，GISAID），优化获得SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO：1 所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BanHI与Xho I位点间，得到新冠病毒B.1.617.2 突变株质粒（pB.1.617.2）。

根据新冠野生型序列（MN908947.3，NCBI），优化获得SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BanH I与Xho I位点间，得到新冠病毒野生株质粒（pWT）。pWT野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前即将进入III期临床，具有非常优秀的免疫效果。

1.2.DNA疫苗序列转化

从-80℃冰箱中取100 μl DH10B感受态细胞悬液，冰上解冻。加入质粒DNA溶液（体积不超过10 μl）轻轻摇匀，冰上放置30 min。42℃水浴中热击70秒，迅速置于冰上冷却5min。向管中加入0.9ml的LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养45min，使细菌恢复正常生长状态。将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含适当抗生素的筛选平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16h。挑选形状均匀的单克隆菌体，使用无菌移液器头将克隆扎取后置入5ml 含有50mg/mL卡那霉素的LB选择培养基中37℃过夜培养。

1.3.DNA疫苗质粒提取

将上述菌液按照1:1000加入到200-400ml含有卡那霉素（50mg/mL母液，1:1000使用）的LB选择培养基中，37℃ 200rpm培养12-16h。用EndoFreen Plasmid Maxi kit（QIAGEN，德国）进行质粒提取：将上述培养12-16h的菌液8000rpm 4℃离心10min后弃上清收集菌体，加入10ml Buffer P1重悬菌液后加入10ml Buffer P2轻轻颠倒4-6次混匀，室温孵育5min充分裂解。向混液中加入10ml Buffer P3，轻轻颠倒4-6次混匀终止裂解后，全部转移至QIAfilter Cartridge中，室温孵育10min，加入栓塞过滤上清。将滤液转移至干净无内毒素50ml离心管中，加入2.5ml Buffer ER，轻轻颠倒10次混匀后放于冰上孵育30min。取出QIAGEN-tip 500加入10ml Buffer QBT平衡柱子，将上述液体转移至柱子中，利用重力流进行吸附质粒，用30ml Buffer QC洗涤2次，再用15ml Buffer QN进行洗脱。每管样品用10.5ml异丙醇沉淀，4℃，4000g离心30min。弃上清，加入70%乙醇洗涤1次，4℃，4000g离心10min。弃上清，晾干沉淀，每样加入500μl无内毒素水进行重悬质粒，得到DNA疫苗质粒。

实施例3：新冠病毒候选DNA疫苗哺乳动物细胞转录鉴定

为了验证实施例2构建的质粒在哺乳动物细胞内是否能够有效转录，通过DNA体外转染、提取RNA、qPCR的方法进行鉴定。

1. DNA疫苗体外转染

从液氮中取出冻存的HEK293T细胞株，37℃水浴后1000rpm离心5分钟除去DMSO。加入无血清的DMEM培养液洗涤一次，于含10%小牛血清的DMEM培养液5ml中，37℃，5% CO₂培养2-3代备用。37℃胰酶（含0.25%的EDTA）消化细胞1min并用完全培养基终止后，以2-4×10⁶细胞/孔的密度平铺于60mm培养皿，加5ml生长培养基（不含1%双抗）于37℃、5% CO₂培养箱中培养24h。

将4μg pWT和4μg pB.1.617.2 两种无菌质粒分别加入至500μl无血清OPTI-MEM培养基中，轻轻混匀，同时将24μl的阳离子脂质体于500μl无血清OPTI-MEM培养基中，轻轻混匀，室温放置5min，将上述两种质粒分别和脂质体1:1混合，室温放置20min，得到质粒DNA/脂质体复合物。

将上述质粒DNA/脂质体复合物按1ml/皿加入至上述培养24h的60mm培养皿中，于37℃，5% CO₂培养箱分别孵育至48小时进行后续实验。

2. 转染后RNA提取

消化收集上述分别转染至48小时的细胞，用1ml完全培养基重悬后，吸取100μl用于RNA提取，剩余重悬液进行后续WB样品制备。

将吸取的100μl细胞悬液4000rpm离心5分钟，弃上清，每样加入350μl TRK LysisSolution(含20%的β-巯基乙醇)进行裂解。每样再加入350μl的70%的乙醇（使用DEPC水配制）进行终止裂解，用枪吹打混匀。

将上述混合液转移至HiBind RNA Column柱内，10000g离心1min，弃滤液。每样柱内加入500μl Wash Buffer I, 10000g离心1min，弃滤液。每样柱内加入500μl WashBuffer II洗涤2次，每次均用10000g离心1min，弃滤液。将离心机转速调整至最高转速（17000g）离心2min以使柱内的乙醇挥发。将柱子转移至干净的无DNA和RNA酶的1.5ml离心管中，室温放置3-5min，彻底挥发乙醇后，每样加入50μl的RNase-Free Water，室温孵育5min, 17000g离心1min。将滤液吸出再次加入到柱子中，室温孵育5min, 17000g离心1min收集RNA，-80℃保存。

3. RNA反转录、qPCR反应

使用酶标仪定量RNA浓度（使用OD260/280进行读值），根据所需PCR数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照）配置溶液，每样先配置10μl反应体系（2μl 5×gDNAdigester Buffer、1μl gDNA digester、100ng的RNA，用RNase free ddH₂O将体积调至10μl），用枪轻轻吹打混匀，42℃孵育2min。向每样中加入10μl 2×Hifair II SuperMix plus，用枪轻轻吹打混匀后，按照25℃ 5min，42℃ 30min，85℃ 5min进行孵育。收取的cDNA放于-20℃备用。

将反转录得到的cDNA产物按照qPCR试剂盒进行反应。反应体系如下：Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)10μl，目的正、反向引物各0.4μl，cDNA模板1μl，无菌超纯水补足总体积为20μl。PCR反应条件：95 ℃、5 min，95℃、10 s，56℃、30s，72℃、30s共40个循环。目的基因的表达水平与内参相比后采用2^-△△C方法计算。

结论：如图5所示，新冠野生株pWT、pB.1.617.2突变株候选DNA疫苗在体外转染48小时后较空载体（pVAX1）均能高水平地促使抗原RNA的转录。

实施例4：新冠病毒候选DNA疫苗哺乳动物细胞抗原蛋白表达鉴定

为了进一步验证实施例2构建的质粒是否在哺乳动物细胞内可以有效表达，因此通过提取抗原蛋白，Western Blot方法进行鉴定。

1.蛋白提取

将新冠质粒pWT、pB.1.617.2分别转染到HEK293T细胞株中，转染48小时结束后，去除转染后的培养液，用预冷的PBS洗一遍，弃去PBS，加入150μl裂解液（使用前按1：100加入EDTA及蛋白酶抑制剂）混匀后吹打10次。置于12,000rpm 4度离心5分钟。吸出上清至1.5mL离心管中，每样取出50μl上清液，加入12.5μl 5×蛋白上样缓冲液，置于沸水中煮沸10min后，瞬离备用。

2.样品上样及SDS-PAGE电泳

将煮沸离心后的上清样本每孔加62.5μl于SDS-PAGE胶孔中，接通电源，调至恒压200V，时间设置45min进行电泳。电泳结束后取出SDS-PAGE进行转膜制作。取PVDF膜在甲醇中浸泡30s激活，将PVDF膜置于1×转膜平衡液中1min。

3.转膜

以正极为底面按照：eBlot L1转膜垫片、PVDF膜、凝胶、eBlot L1转膜垫片顺序依次叠加，每叠加一次用管子排除层间气泡。封闭：将PVDF膜从取出放入盛有1×TBST+5%脱脂奶粉的玻璃盒中，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗3次，每次10分钟，摇床90rpm摇动。一抗孵育：将PVDF膜放入一抗溶液（Rabbit anti S proteinpolyclonal antibody,1:4000）反应，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10分钟，在摇床中90rpm摇动。二抗孵育：将PVDF膜放入二抗溶液中（BDPharmingen HRP Anti human IgG，1:5000 稀释）反应，在摇床90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10分钟，摇床90rpm摇动。显色：取化学发光液A液3ml和B液3ml以1：1比例混合后加入到PVDF膜孵育1-2min，拍照。

结论：如图6所示，新冠野生株pWT、pB.1.617.2突变株候选DNA疫苗在体外转染48小时后与空载体（pVAX1）相比能够在细胞内高水平的表达抗原蛋白。

实施例5：新冠候选DNA疫苗免疫原性验证

为了评估实施例2制备的疫苗的免疫原性，以及免疫策略对体液免疫和细胞免疫应答的影响，从卡文斯百格公司购买了无特定病原体的6周龄C57BL/6雌性小鼠，并将其保存在艾棣维欣Advaccine实验室（苏州）的动物设施中。对于DNA疫苗的接种：将实施例1所述DNA疫苗根据不同分组的注射剂量先后注射到股骨前肌肉，然后进行电脉冲（EP）。电脉冲（EP）装置由两组具有0.2 Amp恒定电流的脉冲组成。第二脉冲组被延迟3秒。在每个组中，有两个52 ms的脉冲，脉冲之间的延迟为198 ms。将第一次初免计为0天，第14天进行第二次免疫（加强免疫）。实验分组：（1）对照组载体质粒pVAX1-25μg；（2）实验组野生型毒株pWT-25 μg；（3）实验组突变株pB.1.617.2-25 μg；第14，21天采集小鼠血液样品，用ELISA法测定血清的特异性抗体滴度。在加强免疫后第7天，处死被免疫的小鼠，以分析细胞免疫反应。

1.评估DNA疫苗引发的抗原特异性体液免疫应答

1.1.ELISA检测抗体浓度

使用基于ELISA方法评估针对SARS-CoV-2 RBD蛋白结合抗体。将Nunc 96孔ELISA平板在4℃下用1 µg / mL SARS-Cov-2 RBD蛋白（Acro Biosystems，DE，美国）包被过夜。将板洗涤3次，然后用含5％牛血清白蛋白（BSA）的PBS（含0.05％Tween 20，即PBST缓冲液）37℃下封闭1小时。将三倍连续稀释的小鼠血清添加到每个孔中，并在37℃下孵育1小时。将板再次洗涤五次，然后在37℃加入1：8000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP（GenScript，NJ，CN）孵育1小时后，随后检测结合抗体。最后洗涤后，通过使用TMB底物使板显影，并用50µl/孔2MH₂SO₄终止反应。在450 nm和620 nm处读数，血清抗体滴度的终点确定为最高稀释度的倒数，样本最高稀释度比阴性对照的吸光度高2.1倍(判定标准：实验组：对照组（阴性）OD450-620值≧2.1，判定该OD值下对应的最高稀释度为血清抗体滴度）。

结论：结果如图7和图8所示，新冠野生株pWT、pB.1.617.2突变株候选DNA疫苗初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体。上述ELISA试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外包被抗原，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的pB.1.617.2 DNA疫苗也取得了相当的显著的技术效果，且如前所述，pWT 是针对新冠野生株的拥有优秀的免疫效果的前期产品，从而更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。

2.进一步评估DNA疫苗引发的抗原特异性细胞应答

我们通过ELISpot分析，研究DNA疫苗是否可以促进细胞免疫。在加强免疫后7天分离脾细胞，进行IFN-γ 、IL-4阳性细胞ELISpot实验。

2.1 IFN-γ、IL-4 ELISpot实验

在加强免疫后第7天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含FBS的PBS终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。通过使用小鼠IL-4、IFN-γ 双色FlouroSpot试剂盒（MabTech，USA）进行IL-4 ELISpot、IFN-γELISpot测定。将通过上述方法分离的每只小鼠的脾脏细胞悬液以250,000的密度接种到每个包被有抗IL-4抗体、抗IFN-γ抗体的孔中，并在37℃的CO₂培养箱中用SARS-CoV-2 RBD肽库刺激20小时，每孔中肽库浓度为10μg/mL（终浓度）（溶于RPMI + 10％FBS）。根据产品说明书进行操作。培养基和PMA/Iono分别作为阴性和阳性对照。阳性斑点通过iSpot Reader（AID，德国Straßberg）进行定量检测。通过减去阴性对照孔来计算每百万个细胞的斑点形成单位（SFU）。

结论：IFN-γ、IL-4 ELISPOT结果如图9，图10所示，新冠野生株pWT、pB.1.617.2突变株候选DNA疫苗加强免疫后第7天均能有效诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ和IL-4反应。上述试验ELIspot试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的pB.1.617.2突变株DNA疫苗也取得了显著的技术效果，如前所述，pWT 是针对新冠野生株的拥有优秀的免疫效果的前期产品，从而更说明了本发明新冠 pB.1.617.2突变株DNA疫苗的良好免疫原性和广谱性。

3.进一步评估疫苗引发的抗原特异性细胞免疫应答的影响，尤其是CD8 T细胞功能的影响，在加强免疫后7天分离脾细胞，进行流式细胞仪检测实验。

分离脾细胞：在加强免疫后7天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含FBS的PBS终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。

流式细胞仪检测实验：通过上述方法获得的来自每只小鼠的脾脏细胞悬液，37℃，5％ CO₂下用SARS-CoV-2 RBD肽库或PMA/Iono刺激，同时利用1μg/ ml的Brefedlin A阻断（BD，CA，美国）6小时。对脾细胞进行胞外及细胞内细胞因子染色，将刺激的脾细胞用FVD-eFluor780染色，然后洗涤，并在室温下于黑暗中分别用抗小鼠CD4，CD8a抗体染色30分钟。用固定/通透缓冲液透化细胞，并用抗小鼠IFN-γ和抗小鼠TNF-α在4℃下进行45分钟细胞内染色。将细胞洗涤两次，并用200µL PBS重悬，然后使用流式细胞仪（ThermoFisher，MA，美国）进行采集，然后用FlowJo软件（BD，CA, 美国）进行分析。

结论：结果如图11所示，新冠野生株pWT、pB.1.617.2突变株候选DNA疫苗加强免疫后第7天, 能够显著诱导抗原特异性和CD8 IFNγT细胞亚群的产生。上述试验FACS试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的 pB.1.617.2突变株DNA疫苗也取得了相当的显著的技术效果，如前所述，pWT 是拥有优秀的免疫效果的前期产品，更说明了本发明 pB.1.617.2突变株DNA疫苗的良好免疫原性和广谱性。

综上，由实施例1-5的结果可知，本发明的pB.1.617.2突变株DNA疫苗不仅在哺乳动物细胞内能够有效转录和表达； 而且具有免疫原性，表现在体液免疫和细胞免疫应答中，对于体液免疫应答，pB.1.617.2突变株候选DNA疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体；对于细胞免疫应答，pB.1.617.2突变株候选DNA疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ和IL-4反应、而且能够诱导抗原特异性CD8IFNγ T细胞亚群的产生。

值得注意的是，pWT野生株疫苗是本公司前期针对SARS-Cov-2野生株的产品，目前已进入III期临床，具有非常优秀的免疫效果。上述试验中例如ELISA、ELIspot和FACS的检测中，均采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外包被抗原或者刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的pB.1.617.2突变株DNA疫苗也取得了显著的技术效果，更说明了本发明 pB.1.617.2突变株DNA疫苗的良好免疫原性和广谱性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 艾棣维欣(苏州)生物制药有限公司

<120> SARS-COV-2病毒B.1.617.2 突变株DNA疫苗及应用

<130> 20211119

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3834

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggattgga cttggattct ctttctcgtt gctgcagcca cacgcgttca tagctcgcag 60

tgcgtgaacc tgagaacacg gacccagctg cctccagctt acacaaatag cttcaccaga 120

ggcgtgtact acccggacaa ggtgttccgg tcctctgtgc tgcacagcac ccaggacctc 180

ttcctgccct ttttcagcaa cgtgacctgg ttccacgcta tccacgtgtc tggcacaaac 240

ggaaccaaaa gattcgacaa ccccgtgctg cctatcaatg atggagtcta cttcgcctct 300

atcgaaaaga gcaacatcat ccgcggctgg atcttcggca ccaccctgga cagtaagacc 360

cagagcctgc tcatcgtgaa caacgccacg aacgtggtga tcaaggtgtg tgaattccaa 420

ttttgcaacg acccctttct cgacgtgtac taccacaaga acaataaatc ttggatggag 480

agcggcgtgt acagctctgc taacaactgc actttcgagt acgtgtccca gccattcctg 540

atggacctgg aaggcaagca gggcaatttc aagaacctga gagaattcgt gtttaagaac 600

atcgacggct acttcaaaat ctattctaag cacaccccaa tcaacctggt ccgggacctg 660

ccacaaggct tcagcgccct ggaacctctg gtggacctgc ctatcggaat caacatcacc 720

cggttccaga ccctgctggc cctgtaccgg agctacctga cacctggcga cagcagctct 780

ggctggaccg ccggcgctgc cgcatattac gtcggctact tgcaacctag gaccttcctg 840

ctgaaataca acgagaacgg caccatcaca gatgccgttg attgcgccct ggaccccctg 900

agcgaaacca agtgtaccct gaaatccttc accgtggaaa agggcatcta ccagaccagc 960

aactttagag tacagcctac agaatctatc gttcggtttc caaacattac caacctgtgt 1020

cctttcggcg aggtgtttaa cgccacacgg ttcgccagcg tgtatgcctg gaatagaaag 1080

cggatcagca actgtgtggc cgactactcc gtgctgtaca atagcgccag cttctctaca 1140

tttaagtgct acggcgtgtc ccctacaaag ctgaacgacc tgtgcttcac aaacgtgtat 1200

gccgatagct tcgtgatccg gggcgatgag gtccggcaga tcgctcctgg ccagacaggc 1260

aagattgccg actacaacta caagctgccc gatgacttca ccggatgtgt gatagcctgg 1320

aacagcaaca acctggatag caaggtgggc ggcaactaca actaccggta ccgactgttt 1380

agaaagagca acctgaaacc ttttgagcgg gacatcagca cagagatcta ccaagccggc 1440

tctaagcctt gtaacggcgt ggagggcttc aactgttact tccctctgca gtcttacgga 1500

ttccagccta caaacggcgt gggataccag ccctatagag tggtggtgct gtcattcgag 1560

ctgctacatg cccctgccac cgtgtgcggc cctaagaagt ctaccaacct cgtgaagaac 1620

aagtgcgtga attttaactt caatggactg acaggcacag gcgtgctgac agagagcaac 1680

aaaaagttcc tgcccttcca gcagtttggc agagatatcg ctgacaccac agacgccgtg 1740

cgcgatcctc agaccctgga gatcctggac atcacccctt gctcctttgg aggagtgtcc 1800

gtgatcacac ctggaacgaa caccagcaac caggttgccg tgctgtacca gggcgtgaac 1860

tgcacagaag ttcctgtggc catccatgcc gatcagctga cgcccacgtg gcgggtgtac 1920

tctaccggca gcaatgtgtt ccagaccaga gccggctgcc ttattggcgc tgagcacgtg 1980

aataatagct atgaatgcga tatcccaatc ggagccggca tttgcgccag ctaccagacc 2040

cagacaaata gtcggagaag agccagatct gtggcctccc agagcatcat cgcatatacc 2100

atgagcctag gagccgaaaa cagcgtcgcc tattccaaca atagcatcgc catcccgaca 2160

aacttcacca tcagcgtgac caccgaaatc ctgcccgtga gcatgaccaa gacaagcgtg 2220

gactgtacaa tgtacatctg tggagactcc accgagtgca gcaacctgct gctgcagtac 2280

ggcagcttct gcacccagct gaacagagcc ctgacaggga tcgccgtgga acaggataag 2340

aacacccaag aggtgttcgc ccaagtgaag cagatctata agactccacc tattaaggac 2400

tttggcggct tcaacttcag ccaaatcctg cccgatccta gcaagccaag caagcggtcc 2460

ttcatcgagg acctgctgtt caacaaggtg accctggccg acgccggctt catcaagcag 2520

tatggcgact gtctgggcga tatcgccgct agagacctga tctgcgccca gaagttcaat 2580

ggcctgaccg tgctcccacc tctgctcacc gacgagatga tcgcccagta cacctctgcc 2640

ctgctggccg gcaccatcac cagcgggtgg acattcgggg ctggagctgc tctgcaaatc 2700

cccttcgcca tgcagatggc ctacagattc aacggcatcg gcgttaccca gaatgtgctg 2760

tatgaaaacc agaaactgat agctaaccag ttcaacagcg ccataggcaa aatccaggat 2820

agtctgagct ctacagccag cgccctggga aaactgcaga acgtggtgaa tcagaacgcc 2880

caggccctga atacactggt gaaacaactg agcagcaatt tcggcgccat cagcagcgtg 2940

ctgaatgata tcctgtctag actggacccc cccgaggccg aggtgcagat cgatagactg 3000

atcaccggca gactgcagtc cctgcagaca tacgtgactc aacagctgat cagagccgct 3060

gagatcagag cttctgctaa tttggctgcc acaaagatga gcgagtgcgt gctgggccag 3120

agcaaaagag tggacttctg cggcaagggc taccacctga tgagcttccc ccagagcgcc 3180

cctcacggcg tcgtgttcct gcacgtgact tacgtgcctg cccaggagaa gaacttcacc 3240

accgcccctg ccatctgcca cgacggcaag gcccacttcc cccgggaggg cgtgttcgtg 3300

agcaatggca cccactggtt cgtgacccaa agaaactttt acgagcccca gattatcacc 3360

accgacaaca ccttcgtgtc aggcaactgc gacgtggtga tcggcatcgt gaacaacact 3420

gtgtacgacc ctctgcagcc tgagctggac agcttcaagg aggaactgga caagtacttc 3480

aaaaaccaca catctcctga cgtggacctg ggcgatatca gcggcattaa cgcctctgtg 3540

gtgaacatcc agaaggaaat cgacagactg aacgaggtgg ccaagaacct gaatgagagc 3600

ctgatcgacc tgcaggagct gggcaagtac gagcagtaca tcaagtggcc ttggtacatc 3660

tggctgggct ttatcgccgg cctgatcgcc atcgtgatgg tcaccatcat gctgtgctgc 3720

atgaccagct gttgcagctg cctgaaaggc tgttgcagct gcggaagttg ctgcaagttt 3780

gacgaggacg actctgagcc tgtgctgaag ggcgtcaagc tgcactacac atga 3834

<210> 2

<211> 3852

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtggtggc gcctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtgtgg 60

gcctctcagt gcgtgaacct gaccaccaga acccagctgc ctcctgctta caccaactcg 120

ttcacacggg gagtgtacta ccccgacaag gtgttcagga gctcagtgct gcatagcacc 180

caagacctgt tcctgccatt cttcagcaac gtcacgtggt tccacgccat ccacgtgtct 240

ggaaccaacg gcaccaagag attcgacaac cccgtgctgc ctttcaacga tggagtgtac 300

ttcgctagca ccgagaagag caacatcatc cggggctgga tcttcggcac cacactggac 360

tccaagacac agagtctgct gatcgtgaac aacgccacca acgtcgtgat caaggtgtgt 420

gagttccagt tctgcaacga tcctttcctc ggcgtttact accacaagaa caacaagagc 480

tggatggaat cagaatttag ggtatattct tctgccaata actgtacgtt tgaatacgtg 540

tctcagcctt tcctaatgga cctggaaggc aaacagggca actttaagaa cctgagagaa 600

ttcgtgttta agaacatcga cggctatttc aagatctaca gtaagcacac ccctatcaac 660

ctggtgcggg acctgcccca ggggttttcc gcccttgaac ctctggtgga cctgcccatt 720

ggcatcaata tcacaagatt ccagaccctg ctggccctgc acagaagcta cctgacccct 780

ggcgacagca gcagcggatg gaccgccggc gccgccgcct actacgtggg atacctgcag 840

cctagaacct tcctactgaa atacaacgaa aacggtacca tcaccgacgc cgtggattgc 900

gctctggacc ctctgagcga aaccaagtgc accctgaaaa gctttaccgt ggagaagggc 960

atttatcaga caagcaactt tcgggtgcag cctaccgaga gcatcgtgag attccctaac 1020

atcaccaacc tgtgtccttt cggcgaggtg ttcaatgcca cacggttcgc cagcgtgtac 1080

gcctggaacc ggaagcggat cagcaactgc gtggccgact acagcgtgct gtataatagc 1140

gccagcttca gcacattcaa gtgctacggc gtgagcccca ccaagctgaa tgatctgtgc 1200

tttaccaacg tgtatgccga tagctttgtg atccgggggg acgaggtaag acagattgcc 1260

ccaggacaga caggcaaaat cgcagattac aactacaaac tgcctgacga cttcaccggc 1320

tgcgttatcg cctggaactc caacaacctg gacagcaagg tgggaggaaa ctacaactac 1380

ctgtaccgac tgttcagaaa gagcaacctg aagccattcg agagagatat ttcgacagag 1440

atctaccagg ccggaagcac accttgcaac ggcgtggaag gcttcaactg ctacttcccc 1500

ctgcagagct acggctttca gcccacaaac ggcgtcggct accagcctta cagagtggtg 1560

gtgctgagct tcgagctgct gcatgcccct gccaccgtgt gcgggcctaa gaagtccaca 1620

aatctggtaa agaataagtg tgtgaacttc aatttcaatg gcctgaccgg aacgggtgtg 1680

ctgaccgaat ctaataagaa gttcctgcct ttccagcagt tcggccgtga tatcgccgac 1740

accaccgacg ctgtccgcga tcctcaaacc ctggaaatcc tggacattac accttgcagc 1800

ttcggcggcg tgtccgtgat cacaccaggc acaaacacca gcaaccaggt ggctgtgctg 1860

taccaggacg tgaactgtac agaggtgcct gtggccatcc acgccgacca gctgacacct 1920

acatggagag tgtattcaac aggcagcaac gtcttccaga ccagagcagg atgcctgatc 1980

ggcgctgagc atgtgaacaa ctcctacgag tgcgacatcc ctatcggcgc cggcatctgc 2040

gctagttacc agactcaaac caactctcct cggcgggcta gaagcgtcgc ctcccagagc 2100

atcatcgctt ataccatgtc tctgggcgcc gagaacagcg tggcctacag caacaactcc 2160

atcgccattc ctaccaactt cacgatctca gttaccaccg agatcctgcc tgtgagcatg 2220

acaaagacca gcgtcgactg caccatgtac atctgcggcg attccacaga atgctccaac 2280

ctgctgctcc agtacggctc tttctgtacc cagctgaaca gagccctgac aggcatcgcc 2340

gtggaacagg ataagaacac tcaggaggtg ttcgcccagg tgaagcagat ctacaagacc 2400

cctccaatca aggactttgg cggctttaat ttcagccaaa tcctcccaga tcctagcaag 2460

cccagcaaga gaagcttcat cgaggacctg ctgttcaaca aggtcaccct ggctgacgcc 2520

ggcttcatca agcagtatgg cgactgcctg ggcgatatcg ccgcgaggga tctaatttgt 2580

gctcagaagt tcaacggcct gaccgtgctg ccccccctgc tgacagacga aatgatcgct 2640

cagtacacat ctgccctgct ggccggcacc atcacgagcg gctggacctt cggagccggc 2700

gccgccctgc agatcccctt cgctatgcag atggcctata gattcaacgg catcggcgtg 2760

acccagaacg tgctgtacga gaaccaaaaa ctgattgcca atcaatttaa ttccgcgatc 2820

ggaaagatcc aggactctct gagctctact gccagcgccc tgggcaagct gcaagacgtg 2880

gtgaaccaga atgctcaagc cctgaacacc ctggtgaagc agctgagcag caatttcgga 2940

gcaatcagct ctgtcctcaa cgacattctg tctagactag acaaggtgga agccgaagtg 3000

cagatcgatc ggcttatcac cggaagactg cagagcctgc agacatatgt tacacagcag 3060

ctgatcagag ccgccgagat cagagccagc gccaacctgg cagccacaaa aatgtccgag 3120

tgcgtcctcg gccaatctaa gcgggttgat ttctgtggca aaggctacca cctgatgagc 3180

ttcccccaaa gcgctcctca cggcgtggtg tttctgcacg tcacctacgt gcccgcccaa 3240

gagaagaact tcaccaccgc ccccgctatc tgccacgacg gcaaggccca cttccctcgg 3300

gaaggcgtgt tcgtgagtaa cggtacacac tggtttgtga cccaaagaaa cttctacgag 3360

cctcagatca tcaccaccga taacaccttt gtgagcggca actgcgatgt ggtgatcggc 3420

atcgtgaaca acacagtata cgaccccctg cagcccgagc tggacagctt taaagaggag 3480

ctcgataagt acttcaagaa ccacacatct ccagacgtgg acctgggcga catcagcggc 3540

atcaacgcca gtgttgtgaa catccagaaa gaaatcgata gactgaacga agtggccaag 3600

aatctgaacg agagcctgat cgacctgcag gagctgggca aatacgagca gtacatcaag 3660

tggccttggt acatctggct gggctttatc gccggcctga tcgccattgt gatggtgaca 3720

atcatgctgt gctgtatgac ctcttgctgc tcctgcctga aaggctgttg tagttgcggc 3780

agctgctgta aattcgatga ggatgactcc gagccggtcc tcaaaggcgt caagctgcac 3840

tacacctgat aa 3852

<210> 3

<211> 3831

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggattgga cctggattct gtttctggtg gcggcggcga cccgcgtgca tagcagccag 60

tgcgtgaacc tgcgcacccg cacccagctg ccgccggcgt ataccaacag ctttacccgc 120

ggcgtgtatt atccggataa agtgtttcgc agcagcgtgc tgcatagcac ccaggatctg 180

tttctgccgt tttttagcaa cgtgacctgg tttcatgcga ttcatgtgag cggcaccaac 240

ggcaccaaac gctttgataa cccggtgctg ccgattaacg atggcgtgta ttttgcgagc 300

attgaaaaaa gcaacattat tcgcggctgg atttttggca ccaccctgga tagcaaaacc 360

cagagcctgc tgattgtgaa caacgcgacc aacgtggtga ttaaagtgtg cgaatttcag 420

ttttgcaacg atccgtttct ggatgtgtat tatcataaaa acaacaaaag ctggatggaa 480

agcggcgtgt atagcagcgc gaacaactgc acctttgaat atgtgagcca gccgtttctg 540

atggatctgg aaggcaaaca gggcaacttt aaaaacctgc gcgaatttgt gtttaaaaac 600

attgatggct attttaaaat ttatagcaaa cataccccga ttaacctggt gcgcgatctg 660

ccgcagggct ttagcgcgct ggaaccgctg gtggatctgc cgattggcat taacattacc 720

cgctttcaga ccctgctggc gctgtatcgc agctatctga ccccgggcga tagcagcagc 780

ggctggaccg cgggcgcggc ggcgtattat gtgggctatc tgcagccgcg cacctttctg 840

ctgaaatata acgaaaacgg caccattacc gatgcggtgg attgcgcgct ggatccgctg 900

agcgaaacca aatgcaccct gaaaagcttt accgtggaaa aaggcattta tcagaccagc 960

aactttcgcg tgcagccgac cgaaagcatt gtgcgctttc cgaacattac caacctgtgc 1020

ccgtttggcg aagtgtttaa cgcgacccgc tttgcgagcg tgtatgcgtg gaaccgcaaa 1080

cgcattagca actgcgtggc ggattatagc gtgctgtata acagcgcgag ctttagcacc 1140

tttaaatgct atggcgtgag cccgaccaaa ctgaacgatc tgtgctttac caacgtgtat 1200

gcggatagct ttgtgattcg cggcgatgaa gtgcgccaga ttgcgccggg ccagaccggc 1260

aaaattgcgg attataacta taaactgccg gatgatttta ccggctgcgt gattgcgtgg 1320

aacagcaaca acctggatag caaagtgggc ggcaactata actatcgcta tcgcctgttt 1380

cgcaaaagca acctgaaacc gtttgaacgc gatattagca ccgaaattta tcaggcgggc 1440

agcaaaccgt gcaacggcgt ggaaggcttt aactgctatt ttccgctgca gagctatggc 1500

tttcagccga ccaacggcgt gggctatcag ccgtatcgcg tggtggtgct gagctttgaa 1560

ctgctgcatg cgccggcgac cgtgtgcggc ccgaaaaaaa gcaccaacct ggtgaaaaac 1620

aaatgcgtga actttaactt taacggcctg accggcaccg gcgtgctgac cgaaagcaac 1680

aaaaaatttc tgccgtttca gcagtttggc cgcgatattg cggataccac cgatgcggtg 1740

cgcgatccgc agaccctgga aattctggat attaccccgt gcagctttgg cggcgtgagc 1800

gtgattaccc cgggcaccaa caccagcaac caggtggcgg tgctgtatca gggcgtgaac 1860

tgcaccgaag tgccggtggc gattcatgcg gatcagctga ccccgacctg gcgcgtgtat 1920

agcaccggca gcaacgtgtt tcagacccgc gcgggctgcc tgattggcgc ggaacatgtg 1980

aacaacagct atgaatgcga tattccgatt ggcgcgggca tttgcgcgag ctatcagacc 2040

cagaccaaca gccgccgccg cgcgcgcagc gtggcgagcc agagcattat tgcgtatacc 2100

atgagcctgg gcgcggaaaa cagcgtggcg tatagcaaca acagcattgc gattccgacc 2160

aactttacca ttagcgtgac caccgaaatt ctgccggtga gcatgaccaa aaccagcgtg 2220

gattgcacca tgtatatttg cggcgatagc accgaatgca gcaacctgct gctgcagtat 2280

ggcagctttt gcacccagct gaaccgcgcg ctgaccggca ttgcggtgga acaggataaa 2340

aacacccagg aagtgtttgc gcaggtgaaa cagatttata aaaccccgcc gattaaagat 2400

tttggcggct ttaactttag ccagattctg ccggatccga gcaaaccgag caaacgcagc 2460

tttattgaag atctgctgtt taacaaagtg accctggcgg atgcgggctt tattaaacag 2520

tatggcgatt gcctgggcga tattgcggcg cgcgatctga tttgcgcgca gaaatttaac 2580

ggcctgaccg tgctgccgcc gctgctgacc gatgaaatga ttgcgcagta taccagcgcg 2640

ctgctggcgg gcaccattac cagcggctgg acctttggcg cgggcgcggc gctgcagatt 2700

ccgtttgcga tgcagatggc gtatcgcttt aacggcattg gcgtgaccca gaacgtgctg 2760

tatgaaaacc agaaactgat tgcgaaccag tttaacagcg cgattggcaa aattcaggat 2820

agcctgagca gcaccgcgag cgcgctgggc aaactgcaga acgtggtgaa ccagaacgcg 2880

caggcgctga acaccctggt gaaacagctg agcagcaact ttggcgcgat tagcagcgtg 2940

ctgaacgata ttctgagccg cctggatccg ccggaagcgg aagtgcagat tgatcgcctg 3000

attaccggcc gcctgcagag cctgcagacc tatgtgaccc agcagctgat tcgcgcggcg 3060

gaaattcgcg cgagcgcgaa cctggcggcg accaaaatga gcgaatgcgt gctgggccag 3120

agcaaacgcg tggatttttg cggcaaaggc tatcatctga tgagctttcc gcagagcgcg 3180

ccgcatggcg tggtgtttct gcatgtgacc tatgtgccgg cgcaggaaaa aaactttacc 3240

accgcgccgg cgatttgcca tgatggcaaa gcgcattttc cgcgcgaagg cgtgtttgtg 3300

agcaacggca cccattggtt tgtgacccag cgcaactttt atgaaccgca gattattacc 3360

accgataaca cctttgtgag cggcaactgc gatgtggtga ttggcattgt gaacaacacc 3420

gtgtatgatc cgctgcagcc ggaactggat agctttaaag aagaactgga taaatatttt 3480

aaaaaccata ccagcccgga tgtggatctg ggcgatatta gcggcattaa cgcgagcgtg 3540

gtgaacattc agaaagaaat tgatcgcctg aacgaagtgg cgaaaaacct gaacgaaagc 3600

ctgattgatc tgcaggaact gggcaaatat gaacagtata ttaaatggcc gtggtatatt 3660

tggctgggct ttattgcggg cctgattgcg attgtgatgg tgaccattat gctgtgctgc 3720

atgaccagct gctgcagctg cctgaaaggc tgctgcagct gcggcagctg ctgcaaattt 3780

gatgaagatg atagcgaacc ggtgctgaaa ggcgtgaaac tgcattatac c 3831