一种双响应快速控释的纳米载体及所构成的纳米药物制备方法
阅读说明：本技术 一种双响应快速控释的纳米载体及所构成的纳米药物制备方法 (Double-response rapid controlled release nano-carrier and preparation method of nano-drug formed by nano-carrier ) 是由 柳森 沈灿 王健全 钱程 王智豪 汤雪聪 叶玮 于 2021-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种双响应快速控释的纳米载体及所构成的纳米药物制备方法,包括以下步骤：一端甲氧基封端的聚乙二醇(mPEG)经N,N’-羰基二咪唑(CDI)处理后与2,2’-二硫代二乙醇(DIT)反应,使其携带二硫键；进一步的,将携带二硫键的PEG与水溶性葡聚糖反应；进一步的,对葡聚糖进行乙酰化修饰,使其变为油溶性聚合物PEG-SS-AD；最后,以PEG-SS-AD包覆化疗药物制备药物载体。本发明制备的所制备的药物载体,具有谷胱甘肽与酸性环境双响应特性,两种响应控释因素相互增强、互相独立。一方面,GSH响应使油溶性核暴露,加速酸响应,是该纳米载体具有在肿瘤内快速裂解的特性；另一方面,单独GSH或酸性环境也能使纳米载体以较慢速率裂解,确保所负载药物能够从载体中释放出来。(The invention discloses a double-response rapid controlled release nano-carrier and a preparation method of a nano-drug formed by the nano-carrier, which comprises the following steps: processing polyethylene glycol (mPEG) with one end methoxy end capped by N, N '-Carbonyldiimidazole (CDI) and then reacting with 2,2' -Dithiodiethanol (DIT) to enable the polyethylene glycol (mPEG) to carry disulfide bonds; further, reacting PEG carrying disulfide bond with water soluble dextran; further, acetylation modification is carried out on the glucan to change the glucan into an oil-soluble polymer PEG-SS-AD; finally, the PEG-SS-AD is used for coating the chemotherapeutic drug to prepare a drug carrier. The prepared drug carrier has the dual response characteristics of glutathione and an acidic environment, and the two response controlled release factors are mutually enhanced and mutually independent. On one hand, GSH response exposes oil-soluble core, accelerates acid response, and is the characteristic that the nano-carrier is rapidly cracked in tumor; on the other hand, the GSH or the acidic environment alone can also lead the nano-carrier to be cracked at a slower rate, and ensure that the loaded drug can be released from the carrier.)
技术领域
本发明属于生物医用高分子聚合物材料
技术领域
，特别涉及一种双响应快速控释的纳米载体及所构成的纳米药物制备方法。背景技术
近年来，癌症成为导致死亡的最主要原因，开发高效的抗癌策略成为热点话题。纳米载体作为改善化疗疗效的一种策略，对改善药物的体内分布起到了重大突破，可以实现纳米药物在肿瘤内的富集。然而，通常情况下，药物的治疗活性只有从其载体中释放出来才能被激活，仅纳米载体的富集并不能提升有效药物的浓度，这就要求纳米载体在癌症部位能够快速释放出所包覆的药物。因此，理想的纳米载体需要具备在肿瘤微环境中快速裂解的特性。
目前已有的纳米载体的控释策略通常是利用肿瘤微环境破坏两亲性共聚物的亲疏水端的连接，使纳米粒子不再具有核壳式稳定结构，进而破裂、释放药物，但是这个过程相对较为缓慢。另外，也有一种可在肿瘤酸性微环境下逆转载体油溶性核的纳米载体，实现药物控释，然而表层对H+的阻碍一定程度上减缓了纳米载体控释速率。
综上所述，目前存在的有机纳米载体控释方法只是在一定程度上实现了加速药物释放速率，然而都存在控释速率限制因素。因此，如何通过对载体的设计，实现更加快速的药物释放，才能在实现纳米载体在肿瘤内富集的前提下，提高肿瘤内有效药物的浓度，进一步发挥其抑制肿瘤的作用，提高化疗有效性，是一项值得研究的课题。为此，我们提出了一种双响应快速控释的纳米载体及所构成的纳米药物制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种双响应快速控释的纳米载体及应用，设计了一种双响应纳米药物载体，可以在肿瘤微环境下，通过谷胱甘肽破坏药物载体的核壳结构，是油溶性核暴露出来，然后在肿瘤酸性环境下，逆转油溶性核的溶解性，使其转化为水溶性化合物，溶解后是化疗药物暴露出来成为游离药物，从而可以实现化疗药物的快速控释，可以有效解决背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种双响应快速控释的纳米载体，纳米载体包括是由两亲性共聚物（简写为：PEG -SS- AD）自组装构成，两亲性共聚物由谷胱甘肽（GSH)可降解的二硫键连接，两亲性共聚物的疏水端为pH响应性乙酰化葡聚糖（AD）构成，亲水端由聚乙二醇（PEG）构成且其分子量在1~20 KDa，其分子量太小或太大可能都可能导致无法形成纳米粒子；所述纳米载体包覆化疗药物构成纳米药物后，可以实现在肿瘤微环境下双响应快速释放所包覆的药物。进一步地，所述两亲性共聚物的亲水端和疏水端由GSH响应的二硫键连接。进一步地，所述化疗药物包括阿霉素、紫杉醇或喜树碱中的任一种。一种双响应快速控释的纳米载体所构成的纳米药物制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
S1.一端甲氧基封端的聚乙二醇（mPEG）与N,N'-羰基二咪唑（CDI）溶于N,N-二甲基甲酰胺中，充分反应20-26 h后，加入2,2'-二硫代二乙醇（DIT），室温下反应10-14h，透析，冻干后得到化合物A；
S2.将S1制得的化合物A溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入过量丁二酸酐，充分搅拌，反应20-26h，透析，冻干后得到化合物B；
S3.将S2制得的化合物B与葡聚糖溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基丁二酰亚胺作为催化剂，反应20-26h，透析，冻干后得到化合物C；
S4.将S3制得的化合物C溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入2-甲氧基丙烯与吡啶对甲苯磺酸盐，室温下反应1~12 h，透析，冻干后得到化合物D。
S5.将制得的PEG-SS-AD与化疗药物溶于有机溶剂中，充分溶解后滴入去离子水，超声乳化后去除有机溶剂，离心清洗后，冻干，得到化疗与光热治疗联合使用的纳米载体构成的纳米药物粉末。
优选地，所述S1中mPEG、CDI、DIT的摩尔比为1：（0.8~1.2）：（0.8~1.2）。
进一步地，所述S2中化合物A与丁二酸酐的摩尔比为1：（2.5~4）。
优选地，所述S3中化合物B与葡聚糖的摩尔比为1：（0.8~1.2）。
进一步地，所述S4中化合物C与2-甲氧基丙烯、吡啶对甲苯磺酸盐的摩尔比为2：（5~10）：(0.8~1.2)。
进一步地，所述S5中有机溶剂为二氯甲烷；所述PEG-SS-AD、化疗药物、有机溶剂的比例为10g：（0.2~1.5）g：（0.5~2）mL；所述有机溶剂与去离子水的体积比为1：（5~20）。
具体反应过程如下：
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
一、本发明制备的纳米载体如图是一种双响应性共聚物，在肿瘤环境下，GSH能够降解二硫键，致使构成纳米载体的PEG-SS-AD分解，纳米载体不再具有稳定的核壳结构，然后肿瘤微环境的酸性，逆转暴露出来的油溶性核的溶解性，使其转化为水溶性化合物，从而实现化疗药物的快速控释；
二、该纳米载体具有GSH与酸性环境的双响应特性，两种响应控释因素相互增强、互相独立；一方面，GSH响应使油溶性核暴露，加速酸响应；另一方面，单独GSH或酸性环境也能使纳米载体以较慢速率裂解，确保所负载药物能够从载体中释放出来，药物能短时间内在肿瘤部位有足够高的浓度，使其可以有效发挥作用杀死癌细胞；
三，相比现有技术，其合成方法设计合理，工艺上易于实现，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1所制备的纳米载体1H NMR图像；
图2为实施例1所制备的纳米载体在不同溶液中的分布图像；
图3为不同纳米载体药物释放曲线；
图4为细胞在不同纳米载体药物作用下存活率；
图5为肿瘤细胞在不同纳米载体药物作用下的体积。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
S1.将4.0 g一端甲氧基封端的聚乙二醇（mPEG，分子量为2 KDa）与0.162g N,N'-羰基二咪唑（CDI）溶于N,N-二甲基甲酰胺中，充分反应24 h后，加入0.26g 2,2'-二硫代二乙醇（DIT），室温下反应12h，透析，冻干后得到化合物A；
S2.将2.2 g化合物A溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.4g丁二酸酐，充分搅拌，反应24h，透析，冻干后得到化合物B；
S3.将1g 化合物B与1g 葡聚糖（分子量为 2KDa）溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.1g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与0.06g N-羟基丁二酰亚胺作为催化剂，反应24h，透析，冻干后得到化合物C。
S4.将0.1 g化合物C溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入10 mL 2-甲氧基丙烯与50 mg吡啶对甲苯磺酸盐，室温下反应3h，透析，冻干后得到化合物PEG-SS-AD。
S5.将50 mg化合物PEG-SS-AD、5 mg紫杉醇溶于2 mL二氯甲烷中，充分溶解后逐滴滴入到40 mL去离子水中，超声乳化后通过旋蒸除去体系中的二氯甲烷，离心清洗后，冻干，得到化疗与光热治疗联合使用的纳米载体构成的纳米药物粉末。
实施例2
S1.将10.0 g一端甲氧基封端的聚乙二醇（mPEG，分子量为5 KDa）与0.15 g N,N'-羰基二咪唑（CDI）溶于N,N-二甲基甲酰胺中，充分反应24 h后，加入0.27 g 2,2'-二硫代二乙醇（DIT），室温下反应12h，透析，冻干后得到化合物A；
S2.将2.2g化合物A溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.6g丁二酸酐，充分搅拌，反应24h，透析，冻干后得到化合物B；
S3.将2.5g 化合物B与1g 葡聚糖（分子量为 2KDa）溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.1g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与0.06g N-羟基丁二酰亚胺作为催化剂，反应24h，透析，冻干后得到化合物C。
S4.将0.1 g化合物C溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入10 mL 2-甲氧基丙烯与50 mg吡啶对甲苯磺酸盐，室温下反应5h，透析，冻干后得到化合物PEG-SS-AD。
S5.将50 mg化合物PEG-SS-AD、5 mg紫杉醇溶于2 mL二氯甲烷中，充分溶解后逐滴滴入到40 mL去离子水中，超声乳化后通过旋蒸除去体系中的二氯甲烷，离心清洗后，冻干，得到化疗与光热治疗联合使用的纳米载体构成的纳米药物粉末。
实施例3
S1.将4.0 g一端甲氧基封端的聚乙二醇（mPEG，分子量为2 KDa）与0.162g N,N'-羰基二咪唑（CDI）溶于N,N-二甲基甲酰胺中，充分反应20 h后，加入0.26g 2,2'-二硫代二乙醇（DIT），室温下反应10h，透析，冻干后得到化合物A；
S2.将2.2 g化合物A溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.4g丁二酸酐，充分搅拌，反应20h，透析，冻干后得到化合物B；
S3.将1g 化合物B与1g 葡聚糖（分子量为 2KDa）溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.1g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与0.06g N-羟基丁二酰亚胺作为催化剂，反应20h，透析，冻干后得到化合物C。
S4.将0.1 g化合物C溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入10 mL 2-甲氧基丙烯与50 mg吡啶对甲苯磺酸盐，室温下反应12h，透析，冻干后得到化合物PEG-SS-AD。
S5.将50 mg化合物PEG-SS-AD、5 mg阿霉素溶于2 mL二氯甲烷中，充分溶解后逐滴滴入到40 mL去离子水中，超声乳化后通过旋蒸除去体系中的二氯甲烷，离心清洗后，冻干，得到化疗与光热治疗联合使用的纳米载体构成的纳米药物粉末。
实施例4
上述实施例1各步骤的产物，采用1H NMR确认。如图1所示，3.50ppm处的吸收峰表示聚乙二醇的存在，在聚合物（C）中检测到葡聚糖在4.48~4.92的吸收峰，表明葡聚糖连接在聚乙二醇上，乙酰化葡聚糖后，甲基的吸收峰（聚合物（D）的红色部分）出现在1.33ppm。
对比测试
无响应性纳米载体药物的合成：取0.1 mmol的PCL（分子量为5K Da）与0.1 mmol的氨基聚乙二醇（分子量为5K Da），加入到N，N-二甲基甲酰胺溶剂中，再加入0.12 mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与0.12 mmolN-羟基丁二酰亚胺，室温下反应24 h，透析、冻干，得无响应性两亲性共聚物PCL-PEG。
实施例5
将上述实施例1 制备的纳米载体分别放入水中、0.2mmol/L的GSH溶液中、pH=6的环境溶液中、0.2mmol/LGSH和pH=6的溶液中。30min后，图2中可以观察到在水中，纳米载体具有良好的水分散性，尺寸也相对均一，大约在40nm左右；只含GSH的溶液中，纳米载体出现不稳定现象，分布情况不如在水中均一，纳米载体的粒径为32.7nm；只在pH=6的溶液中，纳米载体发生破裂，粒径为85.9nm；在含GSH、pH=6的溶液中，纳米载体破裂更加迅速，基本上观察不到完整的纳米载体。
实施例6
观察上述制备的双响应性纳米载体构成的纳米药物水中、0.2mmol/L的GSH溶液中、pH=6的环境溶液中、0.2mmol/LGSH和pH=6的溶液中，观察随时间变化释放紫杉醇的速度及释放量；图3中可以看出双响应性的纳米药物载体能在最快的时间内释放足量的药物紫杉醇，效果最优；单响应性纳米载体药物释放药物需要的时间略长，无响应性纳米载体药物需要时间最长。
实施例7
研究癌细胞分别注射上述无响应性纳米载体（PCL-PEG）、无响应性纳米载体药物、双响应性纳米载体药物的存活率；图4对比可见，无药物纳米载体的效果几乎不存在，无响应性纳米载体药物效果微弱，双响应性纳米载体药物效果最显著。
实施例8
观察肿瘤在分别注射上述无响应性纳米载体（PCL-PEG）、无响应性纳米载体药物、双响应性纳米载体药物后，随时间变化的体积变化；由图5，明显发现经过双响应性纳米载体药物治疗的肿瘤体积随时间变化没有变大，而且出现变小的现象。而其他两种治疗后，肿瘤体积都有所增加。表明双响应性纳米载体药物治疗肿瘤的能力最佳。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
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