一种红外光远程控制的蛋白纳米凝胶及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种红外光远程控制的蛋白纳米凝胶及其制备方法和应用 (Infrared remote control protein nanogel and preparation method and application thereof ) 是由 刘小文 卓诗洁 陈健 张希灿 张鹏 张烽 余俊宇 于 2021-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种红外光远程控制的蛋白纳米凝胶及其制备方法和应用。该方法包括如下步骤：(1)将6支链氨基聚乙二醇、2,3-二甲基马来酸酐和三乙醇胺加入到二氯甲烷中,合成PEG-DAM；(2)将PEG-DAM、EDC和NHS加入到二甲基亚砜中,并加入β-环糊精合成PEG-DAM-βCD；(3)将IR825染料、EDC和NHS加入到二甲基亚砜中,并加入6支链氨基聚乙二醇,合成PEG-IR825；(4)将PEG-DAM-βCD溶解到水中,加入PEG-IR825和蛋白,合成得到蛋白纳米凝胶。该蛋白纳米凝胶可在酸性环境中轻微释放蛋白质,同时可通过远程近红外触发可编程的体外释放,起到对肿瘤织的靶向治疗。(The invention discloses an infrared light remote control protein nanogel and a preparation method and application thereof. The method comprises the following steps: (1) adding 6 branched-chain amino polyethylene glycol, 2, 3-dimethyl maleic anhydride and triethanolamine into dichloromethane to synthesize PEG-DAM; (2) adding PEG-DAM, EDC and NHS into dimethyl sulfoxide, and adding beta-cyclodextrin to synthesize PEG-DAM-beta CD; (3) adding an IR825 dye, EDC and NHS into dimethyl sulfoxide, and adding 6-branched aminopolyethylene glycol to synthesize PEG-IR 825; (4) dissolving PEG-DAM-beta CD into water, adding PEG-IR825 and protein, and synthesizing to obtain protein nanogel. The protein nanogel can slightly release protein in an acidic environment, and can be programmed to release in vitro through remote near-infrared triggering, so that targeted therapy on tumor tissues is realized.)
技术领域
本发明属于蛋白药物
技术领域
，特别涉及一种红外光远程控制的蛋白纳米凝胶及其制备方法和应用。背景技术
自1982年首次推出重组人胰岛素以来，治疗性蛋白正成为多种临床治疗的主导新药物。但由于天然治疗蛋白的理化性质与传统小分子药物完全不同，直接给药往往会因免疫原性、循环时间、安全性或靶向给药不满意等问题，限制了其广泛应用。
在癌症治疗中，考虑到周围环境与病理组织的不同理化性质，许多对pH、酶和光敏感的载体在蛋白质递送过程中的应用引起了广泛关注。抗药偶联(ADC)即将pH敏感的连接剂偶联到载体或治疗蛋白上的方式，取得了很大的进展，有着广阔的应用前景。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种红外光远程控制的蛋白纳米凝胶的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的红外光远程控制的蛋白纳米凝胶。
本发明的再一目的在于提供所述红外光远程控制的蛋白纳米凝胶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种红外光远程控制的蛋白纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成PEG-DAM：将6支链氨基聚乙二醇(6arm PEG-NH2)、2,3-二甲基马来酸酐(DAM)和三乙醇胺(TEA)加入到二氯甲烷(DCM)中进行反应，待反应结束后用氮气吹干二氯甲烷，透析、冻干，得到PEG-DAM；
(2)合成PEG-DAM-βCD：将步骤(1)中得到的PEG-DAM、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌反应(激活羧基)，再加入β-环糊精(βCD-NH2)，继续搅拌反应，待反应结束后透析、冻干，得到PEG-DAM-βCD；
(3)合成PEG-IR825：将IR825染料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到二甲基亚砜(DMSO)中，搅拌反应，再加入6支链氨基聚乙二醇(6arm PEG-NH2)，继续搅拌反应，待反应结束后透析、冻干，得到PEG-IR825；
(4)将步骤(2)中得到的PEG-DAM-βCD溶解到水中，然后加入步骤(3)中得到的PEG-IR825和蛋白进行反应，待反应结束后超滤，得到所述的红外光远程控制的蛋白纳米凝胶。
步骤(1)中所述的6支链氨基聚乙二醇(6arm PEG-NH2)、2,3-二甲基马来酸酐(DAM)和三乙醇胺的摩尔比为1：10～30：5～15；优选为1：10：6。
步骤(1)中所述的6支链氨基聚乙二醇(6arm PEG-NH2)优选为分子量20000(20k)的6支链氨基聚乙二醇。
步骤(1)中所述的二氯甲烷的用量为按每毫克(mg)6支链氨基聚乙二醇配比0.03±0.01ml二氯甲烷计算。
步骤(1)和(4)中所述的反应的时间为22～26小时；优选为24小时。
步骤(1)、(2)和(3)中所述的透析为在截留分子量14kDa的透析袋中进行透析；优选为在截留分子量14kDa的透析袋中24小时。
步骤(1)、(2)和(3)中所述的透析所用的透析液为去离子水。
步骤(1)中所述的冻干的温度优选为-20℃。
步骤(2)中所述的PEG-DAM、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和β-环糊精的摩尔比为1：6～12：6.6～13.2：10～20；优选为1：12：13.2：20。
步骤(2)中所述的二甲基亚砜为按每毫克(mg)PEG-DAM配比0.03±0.01ml二甲基亚砜计算。
步骤(2)和(3)中所述的搅拌反应的时间为15～30min；优选为30min。
步骤(2)和(3)中所述的继续搅拌反应的时间为22～26小时；优选为24小时。
步骤(3)中所述的将IR825染料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和6支链氨基聚乙二醇的摩尔比为10：12：13.2：1。
步骤(4)中所述的蛋白包括牛白蛋白(BSA)和α干扰素(IFNα)中的至少一种。
步骤(4)中所述的PEG-DAM-βCD、PEG-IR825和蛋白的质量比为1：1：0.01～0.1。
步骤(4)中所述的水的用量为按每毫克PEG-DAM-βCD配比1～1.5mL水计算。
一种红外光远程控制的蛋白纳米凝胶，通过上述任一项所述的方法制备得到。
所述的红外光远程控制的蛋白纳米凝胶在制备光热材料和/或抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗肿瘤药物可在酸性缓冲液(pH值5.0～6.5)中解离。
所述的抗肿瘤药物能够在近红外辐射下，负载的蛋白可程控释放，起到对肿瘤织的靶向治疗作用。
所述的近红外辐射为808nm激光照射；优选为808nm激光照射5～10min；更优选为808nm激光照射5～6min。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明公开了一种pH响应型纳米凝胶([email protected]βCD/蛋白质，称为[email protected]/蛋白质纳米凝胶)，它是由6支链聚乙二醇化的环糊精(β-CD)和近红外IR825染料通过主-客体识别相互作用形成的蛋白质传递系统，在自组装过程中高效装载蛋白药物。
(2)本发明中的[email protected]/蛋白质纳米凝胶通过两亲性聚合物和蛋白质自组装法制备的，能够高效地包封蛋白质，可承受在体外和体内的不利生理条件，并可以通过基于pH响应的2,3-二甲基马来酸酐(DAM)连接器在酸性环境中轻微释放蛋白质；此外，远程近红外光照射后，所引起IR825纳米凝胶内的温度升高可大大增强pH响应动力学，产生远程可控的蛋白药物定向释放，以增强癌症治疗。
(3)本发明中的[email protected]/蛋白质纳米凝胶首次被用于封装模型蛋白BSA，表现出高效的负载能力，其负载牛血清白蛋白的纳米凝胶在正常生理条件下是稳定的，在弱酸性溶液中部分解离，且由于共轭近红外染料IR825诱导温度升高，纳米凝胶的近红外辐射可大大改善pH响应释放动力学，表明在远程近红外辐射下，负载蛋白可程控释放；另外，作为一种治疗蛋白模型，INFα被纳米凝胶包裹，既可以通过远程近红外触发可编程的体外释放，也可以通过静脉注射增强癌症治疗后在体内肿瘤的积累，起到对肿瘤织的靶向治疗。
(4)本发明中通过使用pH响应型纳米凝胶修饰治疗性蛋白，改善治疗性蛋白直接给药中关于免疫原性、循环时间、安全性或靶向给药不满意等问题，同时通过IR825光热效应和治疗性蛋白的靶向协同作用，可有效抑制肿瘤的生长，这种配方技术有可能系统地提供治疗蛋白，以进行精确治疗。
(5)在近红外辐照下，本发明中的[email protected]/蛋白纳米凝胶能显著改善远距离激光(NIR)诱导的高温解离动力学，实现治疗蛋白的可编程控制释放，延长蛋白药物的体内循环时间，达到最佳的药物动力学和治疗效果，为潜在的治疗提供了一种有前景的治疗性蛋白制剂策略。
附图说明
图1是本发明制备蛋白纳米凝胶的示意图。
图2是PEG-DAM的核磁氢谱图(以氘代氯仿(CDCl3)为溶剂，图中a表示PEG-DAM中PEG聚乙二醇上氢的化学位移，b表示PEG-DAM中DAM上甲基氢的化学位移)。
图3是PEG-DAM-βCD的核磁氢谱图(以氘代氯仿(CDCl3)为溶剂，图中a表示PEG-DAM-βCD中PEG聚乙二醇上氢的化学位移，b表示PEG-DAM-βCD中DAM上甲基氢的化学位移，c表示PEG-DAM-βCD中的βCD上羟基氢的化学位移，d表示PEG-DAM-βCD中的βCD上氨基氢的化学位移)。
图4是PEG-IR825的核磁氢谱图(以氘代DMSO((CD3)2SO)为溶剂，图中a表示PEG-IR825中PEG聚乙二醇上氢的化学位移，b～g表示PEG-IR825中的IR825上各类氢的化学位移)。
图5是PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA在不同pH缓冲液中孵育24小时后的粒径检测结果图。
图6是PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα在不同pH缓冲液中的粒径检测结果图。
图7是PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA在不同pH缓冲液中孵育24小时后的电镜图。
图8是PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα在不同pH缓冲液中的电镜图。
图9是在PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA不同pH缓冲液中孵育24小时后的圆二色谱图。
图10是PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA不同处理下的电泳图。
图11是PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα不同处理下的电泳图。
图12是利用808nm激光照射(6分钟)PEG-IR 825和PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA的温度变化曲线图和红外成像图；其中，A为温度变化曲线图；B为红外成像图。
图13是PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα和其他对照组的体外细胞毒性大小图。
图14是PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα和PEG-IR825在不同时间的体内分布以及主要器官的荧光成像图。
图15是主要器官的体外荧光定量图。
图16是主要器官中IFNα含量的检测结果图。
图17是在808nm激光照射下小鼠肿瘤部位的温度变化情况图。
图18是各组肿瘤生长情况图。
图19是各组小鼠体重变化情况图。
图20是各组肿瘤H&E染色切片的成像图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明实施例中涉及的β-环糊精，IR825染料，2,3-二甲基马来酸酐(DAM)，牛白蛋白(BSA)和α干扰素(IFNα)可通过常规市售获得；6支链氨基聚乙二醇(6arm PEG-NH2；分子量20k；简称PEG)，购于biomark公司。
本发明实施例中涉及的小鼠乳腺癌细胞(4T1)：由ATCC(American Type CultureCollection,ATCC)提供；在含10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1％(w/v)青霉素/链霉素的RPI-1640培养基中培养，37℃，5％CO2。
本发明实施例中涉及的balb/c小鼠(BALB/c小白鼠，雌性，6-8周，体重20-25g)购自广东省动物中心。所有动物实验均按照《动物生命保护指南》进行，并经暨南大学实验动物伦理委员会批准。
实施例1蛋白纳米凝胶的合成
(1)合成PEG-DAM：将100mg 6支链氨基聚乙二醇(6arm PEG-NH2；分子量20k；简称PEG)(1eq,5*10-6mol,6eq；注：1eq为PEG的量；6eq为1eq PEG的氨基量)，37.8mg 2,3-二甲基马来酸酐(DaM；购于Sigma)(60eq,5*10-5mol)和0.02ml三乙醇胺(TEA)(30eq,3*10-5mol)加入圆底瓶中，溶解于3ml二氯甲烷(DCM)中进行反应，反应持续24小时，然后用氮气吹干DCM，得到粗产物，然后将粗产物溶解于水中后将溶液转移到截留分子量为14kDa的透析袋中，在一个装有去离子水的大烧杯中透析24小时，再转移到50ml离心管中，-20℃冷冻，在冻干机中冻干得到产物，将产物命名为PEG-DAM，其核磁氢谱如图2所示。
(2)合成PEG-DAM-βCD：将100mg PEG-DAM(1eq,4.97*10-6mol)溶于3ml二甲基亚砜(DMSO)中。然后加入11.4mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(12eq,5.96*10-5mol)和7.6mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(13.2eq,6.6*10-5mol)激活羧基(搅拌)30min。加入112.8mg的β-环糊精(βCD-NH2)(20eq,2*4.97*10-5mol)，室温搅拌24h。将产品转移到透析袋(截留分子量14kDa)中，在装有2L去离子水的大烧杯中透析24小时，最后通过冻干得到产品，将其命名为PEG-DAM-βCD，其核磁氢谱如图3所示。
(3)合成PEG-IR825:将45.2mg IR825染料(10eq,5*10-5mol)溶于3ml DMSO中，然后加入11.4mg EDC(12eq,5.96*10-5mol)和7.6mg NHS(13.2eq,6.6*10-5mol)激活羧基(搅拌)30min。加入6支链氨基聚乙二醇(6arm PEG-NH2；分子量20k)(1eq,4.97*10-6mol)100mg，室温搅拌24h。将产品转移到透析袋(截留分子量14kDa)中，在装有2L去离子水的大烧杯中透析24小时，最终产品经冻干得到，将其命名为PEG-IR825，其核磁氢谱如图4所示。
(4)合成PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA(or IFNα)，又称[email protected]/protein：
①在水中溶解10mg PEG-DAM-βCD(约10mL～15mL)，然后慢慢加入10mg PEG-IR825和适当量的牛白蛋白(BSA)(1mg)进行反应，反应时间为24小时，最后用超滤法得到产物PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA，又称[email protected]/BSA；
②参考步骤①的合成方法，将牛白蛋白替换为α干扰素(IFNα，10μg)，合成得到PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα，又称[email protected]/IFNα。
(5)性质表征：
将PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA和PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα分别加入到pH值为5.0、6.5和7.4的PBS缓冲液中(将步骤(4)中合成的产物稀释10倍后用于电镜下观察形态，稀释50倍用于粒径及其他检测)孵育24小时。然后进行如下检测：
①紫外-可见-近红外吸收光谱由Perkin Elmer 750紫外-可见-近红外分光光度计记录。使用Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments,UK)测定了不同pH(5.0、6.5和7.4)条件下的PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA(或IFNα)的水动力直径。结果如图5和6所示：通过监测在不同pH值缓冲液中培养24h后的粒径大小变化，评价[email protected]/BSA的pH响应释放特性。即使在孵育24小时后，[email protected]/BSA仍在pH 7.4下保持稳定。然而，[email protected]/BSA酸性培养的粒径测定显示粒径减小，这是由连接分子DaM和PEG之间的酰胺键断裂导致的(图5)。[email protected]/IFNα在不同pH值缓冲液中孵育24h，随着时间和酸度的增加，粒径减小，表明[email protected]/IFNα在pH 6.5和pH 5.0的酸性缓冲液中解离(图6)。
②采用透射电子显微镜(TEM)对不同pH(5.0、6.5和7.4)条件下PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA(或IFNα)的形态进行了表征。结果如图7和8所示：表明PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA(或IFNα)在酸性缓冲液中解离，酸度越高，解离越明显。
③用圆二色谱(CD)观察在不同pH(5.0、6.5和7.4)缓冲液中孵育24小时后，PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA(简称[email protected]/BSA)配方中蛋白(BSA)的结构变化，以BSA为对照(溶剂为水，同蛋白浓度进行试验)。在不同pH缓冲液中孵育24小时后的圆二色谱如图9所示：在不同pH条件孵育后的圆二色性几乎没变化，表明BSA的空间结构没变化，即为活性不受到影响。
④采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测该制剂在酸性缓冲液中，在808nm激光作用下或不使用808nm激光作用下的蛋白释放行为，即将在pH值为5.0、6.5和7.4的缓冲液中PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA和PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα分别用808nm激光作用10min，然后进行SDS-PAGE电泳，以不使用808nm激光的为对照，以单独的BSA或IFNα为空白对照。结果如图10和11所示：表明PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA(或IFNα)在酸性缓冲液中解离，但不完全。同时经过红外光辐照10分钟后，进一步增强其降解释放出蛋白。
⑤通过FLUKE红外热像仪对PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA和PEG-IR825(上述步骤(3)合成得到)的光热性能进行了验证，具体步骤如下：将PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA和PEG-IR825加入到PBS缓冲液(pH 7.4)中，利用808nm激光照射6分钟，然后利用红外热像仪观察PEG-IR 825和PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA的温度变化。结果如图12所示：表明以BSA为模型蛋白的[email protected]/蛋白形式不影响IR825，仍保持其光热特性，为后续的光热治疗奠定基础。
实施例2体外实验
细胞培养实验：从ATCC(American Type Culture Collection,ATCC)中获得小鼠乳腺癌细胞(4T1)，在37℃、5％CO2、含10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1％(w/v)青霉素/链霉素的培养基中培养(用10mL培养皿进行培养，总细胞数约为12×106cell)，然后经MTT实验(先使用96孔板孵育24h，接种量为30000～40000/孔，培养至细胞数70000～80000/孔，而后加入药物进行相关操作后孵育24h，用MTT法测细胞存活率)，研究PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα(简称[email protected]/IFNα)对于4T1肿瘤细胞的杀伤作用(以IR825计，浓度分别为0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156mM)，以IR825染料、PEG-IR825、IR825+L，PEG-IR825+L，[email protected]/IFNα+L为对照(+L的表示进行红外光辐照，808nm，约10min)。
结果如图13所示：[email protected]/IFN经近红外照射的局灶性纳米粒子(NGs)对4T1肿瘤细胞的杀伤能力最高，但与IR 825和PEG-IR 825近红外照射组差异极小，说明治疗作用主要来源于IR 825的光热作用。这可能是由于在正常生理环境下，[email protected]/IFN干扰素NGs的干扰素释放很难达到治疗效果。
实施例3体内实验
动物模型选用balb/c小鼠，接种小鼠肿瘤时，将4T1细胞(约2x106)悬浮在适量的PBS缓冲液(pH 7.4)中，皮下注射到小鼠背部(接种肿瘤后等到肿瘤体积约60～90mm3(约1-2周)，再进行如下实验：
(1)为了研究小鼠体内行为，将PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα([email protected]/IFNα)和PEG-IR825静脉注射到小鼠体内200μL/只(IR825 10mg/kg，IFNα：1mg/kg)。在不同时间点(2、4、8、12、24h)，利用小动物成像系统观察PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα和PEG-IR825的体内分布情况。最后，在24h后处死小鼠，通过体内成像系统获得肝(liver；简称Li)、脾(spleen；简称sp)、肾(kidney；简称ki)、心(heart；简称he)、肺(lungs；简称lu)、肿瘤(tumour；简称tu)等用于体外成像的器官。其相对荧光强度和干扰素α含量分别是由小动物成像系统和elisa试剂盒进行测定。
PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα和PEG-IR825在不同时间的体内分布以及主要器官荧光成像如图14所示，主要器官的体外荧光定量结果如图15所示，主要器官中IFNα含量检测结果如图16所示：结果说明[email protected]/IFNα在注射后2h静脉给药后在肿瘤组织积累良好，并表现出长期滞留效应，观察到的荧光来自IR 825，而没有自组装形成纳米凝胶的PEG-IR825则表现出非常有限的肿瘤积聚和快速的代谢，在4小时内被肿瘤排除在外。此外，IFNα测定结果也表明[email protected]/IFNαNGs在肿瘤中较天然IFNα有良好的积累。
(2)采用FLUKE红外热成像仪研究了PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα在体内的光热特性。用808nm激光1.5W/cm2照射小鼠背部肿瘤部位5min，用FLUKE红外热成像仪检测温度变化情况。结果如图17所示。
(3)联合治疗
1)将4T1肿瘤(约100mm3)小鼠分为6组:
①对照组(未治疗)(Control)；
②静脉输液注射PEG-IR825和辐射波长808纳米的激光(1.5W/cm2)照射小鼠背部肿瘤部位5min(PEG-IR825(L+))；
③输液注射干扰素α(IFNα)；
④输液注射PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/BSA和辐射波长808纳米的激光照射小鼠背部肿瘤部位5min(1.5W/cm2)([email protected]/BSA(L+))；
⑤输液注射PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα([email protected]/IFNα)；
⑥输液注射PEG-IR825/PEG-DAM-βCD/IFNα和辐射波长808纳米的激光照射小鼠背部肿瘤部位5min(1.5W/cm2)([email protected]/IFNα(L+))。
各组静脉注射量(对照组除外)相同，IR825和INFα的剂量分别为10mg/kg和1mg/kg(各药物均按IR825浓度换算)(IR825通过紫外分光光度计定量，INFα通过elisa试剂盒检测)。记录各组小鼠体重，每2天用数字卡尺测量肿瘤长度和宽度，连续3周。肿瘤体积计算公式为：width2×length/2(width为肿瘤的宽度，length为肿瘤的长度)。
2)3周后，将上述各组小鼠处死后，收集肿瘤组织、切片，然后进行苏木精和伊红(H&E)染色，利用苏木精和伊红(H&E)染色法分析了不同治疗方法下肿瘤的组织学性质。收集不同组的H&E染色肿瘤切片，通过共聚焦成像评估肿瘤损伤情况。
肿瘤大小(图18)、小鼠体重(图19)和H&E染色切片(图20)清楚显示：[email protected]/IFNαNGs在近红外照射下能有效抑制肿瘤生长，与无近红外的[email protected]/IFNα和有近红外的[email protected]/BSA相比，表明IR 825具有协同治疗作用，并由近红外引起的升温触发释放治疗性IFNα。值得注意的是，在无近红外的情况下[email protected]/IFNα的治疗效果有限，我们推测这是由于[email protected]/IFNα的微酸性肿瘤微环境无法成功触发纳米凝胶的解离，从而导致天然IFNα难以从[email protected]/IFNα中释放。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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