一种地胆草有效部位及其在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的药物中的应用
阅读说明：本技术 一种地胆草有效部位及其在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的药物中的应用 (Effective part of elephantopus scaber and application thereof in preparation of medicine with respiratory syncytial virus resisting effect ) 是由 王国才 李药兰 李满妹 张玉波 陈能花 吴忠南 于 2021-01-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及天然药物化学技术领域,具体公开了一种地胆草有效部位及其在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的药物中的应用。所说的地胆草有效部位的制备方法,其包含如下步骤：(1)取地胆草用乙醇提取得地胆草乙醇提取物；(2)将地胆草乙醇提取物用水混悬,然后分别用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物；(3)取石油醚萃取物上硅胶柱,采用混合有机溶剂A进行洗脱,收集洗脱部位,浓缩干燥即得硅胶洗脱部位A；(4)取硅胶洗脱部位A再次上硅胶柱,采用混合有机溶剂B进行洗脱,收集洗脱部位,即得所述的地胆草有效部位。由该方法制备得到的地胆草有效部位具有优异的抗呼吸道合包病毒作用。(The invention relates to the technical field of natural medicinal chemistry, and particularly discloses an effective part of elephantopus scaber and application thereof in preparing a medicament with an effect of resisting respiratory syncytial virus. The preparation method of the effective part of the elephantopus scaber comprises the following steps: (1) extracting herba elephantopi with ethanol to obtain herba elephantopi ethanol extract; (2) suspending the elephantopus scaber ethanol extract with water, and extracting with petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol respectively to obtain petroleum ether extract, ethyl acetate extract and n-butanol extract; (3) loading the petroleum ether extract on a silica gel column, eluting by using a mixed organic solvent A, collecting an elution part, concentrating and drying to obtain a silica gel elution part A; (4) and (3) putting the silica gel elution part A on a silica gel column again, eluting by adopting a mixed organic solvent B, and collecting the elution part to obtain the effective part of the elephantopus scaber. The effective part of the elephantopus scaber prepared by the method has excellent effect of resisting respiratory syncytial virus.)
技术领域
本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及一种地胆草有效部位及其在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的药物中的应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)感染在世界范围内广泛存在，人群普遍易感，并可发生重复感染以及与多种呼吸道病毒的共感染。因此，RSV是一种常见的人类病原体，而且对全球的新生儿的健康都存在威胁。RSV的感染途径主要分为空气传播和接触传播，可通过眼、鼻、喉进入人体，所以近距离的接触携带RSV的人或物会有一定的感染风险，尤其是婴幼儿或者免疫力低下的人群。临床表现主要为，高热、胸闷、气促、喘息、咳嗽等上呼吸道感染症状，长期感染会导致病毒进入下呼吸道引起细支气管炎、肺炎等。婴幼儿是下呼吸道感染主要人群之一，其中肺炎和细支气管炎是引起婴幼儿住院治疗
与死亡的主要原因之一。另外，老年人以及免疫力低下人群也是下呼吸道感染的主要病原体。据WHO报道，RSV每年约感染6.4千万人，其中死亡率约占0.25％。
安全有效的RSV疫苗能防止高危人群因感染RSV而出现下呼吸道疾病，降低住院率与死亡率。20世纪研究的福尔马林灭火疫苗是第一个RSV疫苗，但是它最终以失败而告终。虽然后期也研制了不少种类的疫苗，如减毒活疫苗、载体疫苗和亚单位疫苗等，但是至今仍没有研制出安全有效的RSV疫苗用于临床。
目前，临床上用于抗RSV感染的药物种类较少，主要为利巴韦林、帕利珠单抗(Palivizumab)和一些广谱抗病毒的中成药。大量临床数据显示利巴韦林副作用极强，不适用于孕妇和儿童，多用于重症患者；而广谱抗病毒的中成药，例如，莲花清瘟颗粒/胶囊、清热消炎宁胶囊等对RSV感染的作用机理也尚不明确。因此，进一步开发具有抗呼吸道合胞病毒作用的药物具有重要的意义。
本发明课题组在专利CN102219687A中公开了含有一系列咖啡酰奎宁酸类成分的地胆草提取物，实验表明其抗呼吸道合胞病毒的IC50值小于5.0μg/mL，具有较好的抗呼吸道合胞病毒作用。但是，发明人认为目前针对地胆草的抗呼吸道合胞病毒活性物质基础仍然未全面了解，地胆草中仍然存在大量的具有抗病毒作用的有效部位以及有效成分有待进一步开发。
发明内容
针对现有技术对于地胆草抗呼吸道合胞病毒有效部位开发不足，本发明首先提供一种地胆草有效部位的制备方法。由该方法制备得到的地胆草有效部位具有优异的抗呼吸道合胞病毒作用。
本发明的技术方案如下：
一种地胆草有效部位的制备方法，其包含如下步骤：
(1)取地胆草用乙醇提取得地胆草乙醇提取物；
(2)将地胆草乙醇提取物用水混悬，然后分别用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物；
(3)取石油醚萃取物上硅胶柱，采用混合有机溶剂A进行洗脱，收集洗脱部位，浓缩干燥即得硅胶洗脱部位A；
(4)取硅胶洗脱部位A再次上硅胶柱，采用混合有机溶剂B进行洗脱，收集洗脱部位，即得所述的地胆草有效部位。
优选地，步骤(1)中所述的乙醇为体积分数为80～100％的乙醇。
优选地，步骤(1)中所述的提取是指加热回流提取。
优选地，步骤(3)中混合有机溶剂A由石油醚和乙酸乙酯组成；
步骤(3)的具体洗脱条件为：取石油醚萃取物上硅胶柱，先用体积比为95～90:5～10的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；然后再用体积比为85～80:15～20的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为85～80:15～20的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥得硅胶洗脱部位A。
进一步优选地，步骤(3)的具体洗脱条件为：取石油醚萃取物上硅胶柱，先用体积比为92:8的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；然后再用体积比为85:15的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为85:15的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥得硅胶洗脱部位A。
优选地，步骤(4)中混合有机溶剂B由氯仿和甲醇组成；
步骤(4)的具体洗脱条件为：取硅胶洗脱部位A上硅胶柱，先用体积比为99～97:1～3的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱；然后再用体积比为95～92:5～8的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为95～92:5～8的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥即得所述的地胆草有效部位。
进一步优选地，步骤(4)中混合有机溶剂B由氯仿和甲醇组成；
步骤(4)的具体洗脱条件为：取硅胶洗脱部位A上硅胶柱，先用体积比为98:2的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱；然后再用体积比为94:6的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为94:6的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥即得所述的地胆草有效部位。
发明人经大量的实验研究表明，在本发明制备地胆草有效部位过程中，能否制备得到具有抗呼吸道合胞作用的有效部位，这和步骤(3)和(4)的硅胶洗脱条件密切相关；研究表明步骤(3)和(4)不能颠倒，即：必须先采用步骤(3)所述条件的由石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂A进行洗脱，然后再采用步骤(4)所述条件的由氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂B进行洗脱才能得到抗呼吸道合包病毒作用优异的地胆草有效部位。如果将步骤(3)和(4)进行颠倒或步骤(3)和(4)的有机溶剂的比例不同，则得不到抗呼吸道合包病毒作用优异的地胆草有效部位，或者根本得不到具有抗呼吸道合包病毒作用的地胆草有效部位。
进一步研究表明，上述方法制备得到的地胆草有效部位中含有异去氧地胆草内酯和去氧地胆草内酯。
将本发明所述方法制备得到的地胆草有效部位采用硅胶薄层板进行检测，用硫酸-香草醛显色，发现所述的地胆草有效部位中主要含有两个显紫色成分以及三个紫色较弱的其它成分；进一步将所述的地胆草有效部位上硅胶柱，连续用体积比为96:4的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱，分离得到2个主要成分，经结构鉴定，该两个主要成分为异去氧地胆草内酯和去氧地胆草内酯。由此可见确定，采用本发明所述方法制备得到的地胆草有效部位主要含有异去氧地胆草内酯和去氧地胆草内酯，以及还含有其它少量的地胆草内酯类化合物。
本发明还提供一种由上述制备方法制备得到的地胆草有效部位。
本发明还提供一种上述地胆草有效部位在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的药物中的应用。
有益效果：本发明提供了一种全新的制备地胆草有效部位的方法，由该方法制备得到的地胆草有效部位具有优异的抗呼吸道合包病毒作用；实验表明，其对呼吸道合胞病毒的IC50值优于专利CN102219687A中公开了含有一系列咖啡酰奎宁酸类成分的地胆草提取物对呼吸道合胞病毒的IC50值。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1地胆草有效部位的制备
(1)取干燥的地胆草全草400g，用4L体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取，提取时间为1.5h，提取次数为2次，合并两次提取液浓缩干燥后即得所述的地胆草乙醇提取物；
(2)将地胆草乙醇提取物用10倍量水混悬，然后分别用与水等量的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，浓缩萃取液得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物；
(3)将石油醚萃取物上硅胶柱(硅胶柱中的硅胶填料的重量用量为乙酸乙酯萃取物的30倍)，先用5倍柱体积的体积比为92:8的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱(该部位弃去不要)；然后再用8倍柱体积的体积比为85:15的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为85:15的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥得硅胶洗脱部位A；
(4)取硅胶洗脱部位A上硅胶柱，先用5倍柱体积的体积比为98:2的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱(该部位弃去不要)；然后再用8倍柱体积的用体积比为94:6的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为94:6的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥即得所述的地胆草有效部位。
将本实施例制备得到的地胆草有效部位采用硅胶薄层板进行检测，用硫酸-香草醛显色，发现所述的地胆草有效部位中主要含有两个显紫色成分以及三个紫色较弱的其它成分；进一步将所述的地胆草有效部位上硅胶柱，连续用体积比为96:4的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱，分离得到2个主要成分，经结构鉴定，该两个主要成分为异去氧地胆草内酯和去氧地胆草内酯。由此可见确定，本实施例制备得到的地胆草有效部位主要含有异去氧地胆草内酯和去氧地胆草内酯，以及还含有其它少量的地胆草内酯类化合物。
对比例1地胆草有效部位的制备
(1)取干燥的地胆草全草400g，用4L体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取，提取时间为1.5h，提取次数为2次，合并两次提取液浓缩干燥后即得所述的地胆草乙醇提取物；
(2)将地胆草乙醇提取物用10倍量水混悬，然后分别用与水等量的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，浓缩萃取液得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物；
(3)取石油醚萃取物上硅胶柱，先用5倍柱体积的体积比为98:2的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱(该部位弃去不要)；然后再用8倍柱体积的用体积比为94:6的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为94:6的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥得硅胶洗脱部位A。
(4)将硅胶洗脱部位A上硅胶柱(硅胶柱中的硅胶填料的重量用量为乙酸乙酯萃取物的30倍)，先用5倍柱体积的体积比为92:8的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱(该部位弃去不要)；然后再用8倍柱体积的体积比为85:15的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为85:15的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥即得所述的地胆草有效部位。
对比例1与实施例1的区别在于，对比例1将实施例1的步骤(3)和(4)进行了颠倒；即先采用由氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱，然后再由石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱。
对比例2地胆草有效部位的制备
(1)取干燥的地胆草全草400g，用4L体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取，提取时间为1.5h，提取次数为2次，合并两次提取液浓缩干燥后即得所述的地胆草乙醇提取物；
(2)将地胆草乙醇提取物用10倍量水混悬，然后分别用与水等量的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，浓缩萃取液得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物；
(3)将石油醚萃取物上硅胶柱(硅胶柱中的硅胶填料的重量用量为乙酸乙酯萃取物的30倍)，先用5倍柱体积的体积比为85:15的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱(该部位弃去不要)；然后再用8倍柱体积的体积比为75:25的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为75:25的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥得硅胶洗脱部位A；
(4)取硅胶洗脱部位A上硅胶柱，先用5倍柱体积的体积比为98:2的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱(该部位弃去不要)；然后再用8倍柱体积的用体积比为94:6的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为94:6的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥即得所述的地胆草有效部位。
对比例2与实施例1的区别在于，对比例2步骤(3)中由石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂的洗脱条件不同。
对比例3地胆草有效部位的制备
(1)取干燥的地胆草全草400g，用4L体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取，提取时间为1.5h，提取次数为2次，合并两次提取液浓缩干燥后即得所述的地胆草乙醇提取物；
(2)将地胆草乙醇提取物用10倍量水混悬，然后分别用与水等量的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，浓缩萃取液得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物；
(3)将石油醚萃取物上硅胶柱(硅胶柱中的硅胶填料的重量用量为乙酸乙酯萃取物的30倍)，先用5倍柱体积的体积比为92:8的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱(该部位弃去不要)；然后再用8倍柱体积的体积比为85:15的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为85:15的石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥得硅胶洗脱部位A；
(4)取硅胶洗脱部位A上硅胶柱，先用5倍柱体积的体积比为95:5的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱(该部位弃去不要)；然后再用8倍柱体积的用体积比为90:10的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂进行洗脱；收集体积比为90:10的氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂洗脱下来的洗脱部位，浓缩干燥即得所述的地胆草有效部位。
对比例3与实施例1的区别在于，对比例2步骤(4)中由氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂的洗脱条件不同。
实验例1地胆草有效部位抗RSV活性研究
采用空斑减数实验法测试地胆草有效部位抗RSV活性，具体方法如下：(1)取HEp-2细胞接种于24孔细胞培养板中(每孔接种1mL，细胞密度为2×105cell/mL)，接着置于37℃，5％CO2培养箱中培养至长成细胞单层；(2)每孔加入100PFU/mL呼吸道合胞病毒悬液100μL，不同浓度药物100μL，同时设置细胞对照组和病毒对照组；置于37℃，5％CO2培养箱中培养2h。每15min十字交叉轻轻摇晃，使病毒均匀充分的吸附并穿入细胞；(3)待病毒吸附2h后，吸弃病毒液，用PBS洗涤2次，各孔加入0.5mL琼脂糖凝胶覆盖液，待覆盖液凝固后，加入0.5mL对应浓度的药物，细胞对照组和病毒对照组加入等体积的维持液；(4)将24孔板置于细胞培养箱中培养4～5d后，加入10％甲醛固定过夜，弃去琼脂糖凝胶后，1％结晶紫染色30min，自来水轻轻冲洗24孔培养板，晾干并统计空斑数。计算样品的空斑抑制率，进而计算出半数抑制浓度IC50；空斑抑制率＝[(病毒组的空斑数-药物组的空斑数)/病毒组的空数]×100％。
采用上述方法，测试如下实验组药物的抗呼吸道合胞病毒活性；测试结果见表1。
实验组1：实施例1制备得到的地胆草有效部；
实验组2：对比例1制备得到的地胆草有效部；
实验组3：对比例2制备得到的地胆草有效部；
实验组4：对比例3制备得到的地胆草有效部；
实验组5：异去氧地胆草内酯；
实验组6：去氧地胆草内酯。
表1.地胆草内酯类化合物抗RSV活性测试结果
实验组
成分
IC50(μg/mL)
实验组1
实施例1制备得到的地胆草有效部
1.18
实验组2
对比例1制备得到的地胆草有效部
135.56
实验组3
对比例2制备得到的地胆草有效部
158.44
实验组4
对比例3制备得到的地胆草有效部
92.32
实验组5
异去氧地胆草内酯
3.17
实验组6
去氧地胆草内酯
10.25
由上述实验结果可知，实施例1制备得到的地胆草有效部其抗呼吸道合胞病毒活性的IC50值为1.18μg/mL，小于专利CN102219687A中公开了含有一系列咖啡酰奎宁酸类成分的地胆草提取物对呼吸道合胞病毒的IC50值；这说明采用该全新方法制备了抗呼吸道合胞病毒更加优异的地胆草有效部位。且实施例1制备得到的地胆草有效部其抗呼吸道合胞病毒活性的IC50值都小于单体化合物异去氧地胆草内酯和去氧地胆草内酯，这可能是由于实施例1制备得到的地胆草有效部其中的异去氧地胆草内酯和去氧地胆草内酯与其它少量的地胆草内酯类化合物产生了协同抗呼吸道合胞病毒活性。
由上述实验结果还可以看出，对比例1～3制备得到的地胆草有效部其抗呼吸道合胞病毒活性的IC50值远远大于实施例1制备得到的地胆草有效部；这说明步骤(3)和(4)的硅胶洗脱条件对地胆草有效部位的抗呼吸道合包病毒作用起着决定性作用；步骤(3)和(4)不能颠倒，即：必须先采用步骤(3)所述条件的由石油醚和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂A进行洗脱，然后再采用步骤(4)所述条件的由氯仿和甲醇组成的混合有机溶剂B进行洗脱才能得到抗呼吸道合包病毒作用优异的地胆草有效部位。如果将步骤(3)和(4)进行颠倒或步骤(3)和(4)的有机溶剂的比例不同，则得不到抗呼吸道合包病毒作用优异的地胆草有效部位。
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