一种提取银杏叶活性成分的方法
阅读说明：本技术 一种提取银杏叶活性成分的方法 (Method for extracting active components from ginkgo leaves ) 是由 肖伟 倪付勇 温建辉 谢雪 李明 王永香 吴云 王振中 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提取银杏叶活性成分的方法,其特征在于,该方法采用中低压制备液相色谱仪对银杏内酯粗品进行分离纯化,其中,所述分离纯化采用的色谱条件包括：采用反相硅胶作为所述中低压制备液相色谱仪的填料,以甲醇-水溶液作为流动相。本发明的方法生产成本低,无需使用大量的有机试剂,为大量、同时快速制备高纯度白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K提供了一种新方法。(The invention discloses a method for extracting active ingredients of ginkgo leaves, which is characterized in that a medium-low pressure preparative liquid chromatograph is adopted to separate and purify a crude product of ginkgolides, wherein the chromatographic conditions adopted for separation and purification comprise: and reversed phase silica gel is used as a filler of the medium-low pressure preparation liquid chromatograph, and a methanol-water solution is used as a mobile phase. The method has low production cost, does not need to use a large amount of organic reagents, and provides a new method for rapidly preparing a large amount of high-purity bilobalide, bilobalide A, bilobalide B, bilobalide C and bilobalide K.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种提取银杏叶活性成分的方法，尤其涉及一种同时快速制备白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K的方法。
背景技术
银杏内酯(ginkgolide)化合物属于萜类化合物，由倍半萜内酯和二萜内酯组成，是银杏叶中一类重要的活性成分，主要有白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K、银杏内酯L、银杏内酯M。银杏内酯类成分的化学结构很奇特，分子骨架小、结构紧密，分子中碳骨架高度官能团化，整个分子呈扭曲的笼形结构，6个五元环互相缠绕在一起，包含1个螺[4,4]壬烷碳骨架、3个γ-内酯环、1个四氢呋喃环、1个叔丁基侧链和十几个手性中心，如银杏内酯B含有11个立体中心。研究发现，银杏内酯是一类高效的血小板活化因子受体(PAF)拮抗剂。PAF是由血小板和多种炎症组织分泌产生的一种内源性磷脂，可有效诱导血小板聚集，被称为心脑血管疾病的杀手。银杏内酯可通过对PAF的特异性抑制作用，改善脑部血液循环及能量代谢，在预防和治疗心脑血管疾病方面显示了较好的市场前景。
前期文献报道多是白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K其中一个或少量几个化合物的制备方法，且工序长、制备方法繁琐。因此，有必要提出一种能快速分离制备以上几个化合物的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种同时快速制备白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K的方法。具体来说，本发明提出了一种提取银杏叶活性成分的方法，其特征在于，该方法采用中低压制备液相色谱仪对银杏内酯粗品进行分离纯化，其中，色谱条件包括：所述中低压制备液相色谱仪采用反相硅胶为填料，以甲醇-水溶液为流动相。
在本发明的一些具体实施方案中，，所述银杏内酯粗品由银杏叶经乙醇提取、水分散、过滤、萃取、浓缩干燥而来。
在本发明的一些具体实施方案中，所述银杏叶内酯粗品粗品制备方法如下：
取银杏叶与乙醇加热回流提取，过滤、浓缩，得浓缩液；
向所述浓缩液加水分散，滤去不溶物，得银杏叶提取物；
乙酸乙酯作为萃取溶剂进行萃取，萃取液浓缩干燥得银杏内酯粗品。
在本发明的一些具体实施方案中，所述银杏叶提取物的制备方法如下：
取银杏叶用乙醇回流提取，过滤，获得滤液，减压浓缩至25℃时的相对密度为1.05g/ml；
再与乙醇混合至体积分数为80％，静置，过滤，收集滤液减压浓缩至无醇味；
取上述滤液与水按照体积比为1:1混合，静置，滤去不溶物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述银杏叶与乙醇的质量体积比为1:10～30。
在本发明的一些具体实施方案中，所述乙醇为乙醇的水溶液，浓度为60％～95％(体积分数)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述反相硅胶包括但不限于：以YMC-C18、Acuity-C18或XB-C18为分离填料。
在本发明的一些具体实施方案中，所述甲醇-水溶液的比例为30-50:70-50(V/V)；优选为35-45:65-55。
在本发明的一些具体实施方案中，如前所述的色谱条件包括：检测波长为202～254nm，优选为220nm。按料液比1g：10～30mL，利用中低压制备液相洗脱，流速为50～100mL/min。
在本发明的一些具体实施方案中，前述提取银杏叶活性成分的方法包括：
取银杏叶用10倍量75％乙醇回流提取两次，2h/次，滤过，滤液减压浓缩至25℃时的相对密度1.05g/mL；
搅拌加入乙醇至乙醇体积分数为80％，静置过夜，滤过，弃去不溶物，滤液减压浓缩至无醇味，加水稀释至1:1混合分散，乙酸乙酯萃取3～5次，收集萃取液，浓缩干燥，银杏内酯主要集中在乙酸乙酯萃取部位，得银杏内酯粗品；
利用Reveleris中低压制备色谱仪(美国GRACE公司)，以“YMC-C18，400mm×80mm,10μm”的填料色谱柱为分离柱，流动相甲醇-水溶液比例为35:65，流速为100mL/min，波长为220nm，等度洗脱，快速纯化，获得白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K单体。
本发明所使用的中低压制备色谱技术即闪式制备色谱技术，其最大特点是分离速度快，可制备毫克级至百克级的样品。通常，该技术可使用正相填料和反相填料，具有比常压柱色谱分辨率高，分离速度快的特点；其还具有比高效制备液相制备量大、时间短、工作效率高、节约生产成本的优点。
使用本发明中的方法首先采用乙酸乙酯萃取富集银杏内酯粗品，然后利用中低压制备液相分离纯化得到高质量分数的银杏内酯单体，该法所制得的白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K纯度均在99％以上，回收率也均在90％以上，达到含量测定用对照品的要求，其生产成本低，无需使用大量的有机试剂，为大量、同时快速制备高纯度白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K提供了一种新方法。
附图说明
图1为白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K中低压制备的液相色谱图；
图2为银杏内酯混合对照品的高效液相色谱图；
图3为制备得到的白果内酯的高效液相色谱图；
图4为制备得到的银杏内酯A的高效液相色谱图；
图5为制备得到的银杏内酯B的高效液相色谱图；
图6为制备得到的银杏内酯C的高效液相色谱图；
图7为制备得到的银杏内酯K的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯、和银杏内酯C和银杏内酯K的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换或改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K的制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，中低压制备色谱仪，适用于4g-330g中压制备色谱柱。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、银杏内酯粗品制备工艺
取银杏叶20.0kg，依次用10倍量75％乙醇回流提取两次(2h/次)，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.05g/mL(25℃)。搅拌加入乙醇至乙醇体积分数为80％，静置过夜，滤过，弃去不溶物，滤液减压浓缩至无醇味，加水稀释至1:1，乙酸乙酯萃取3～5次，收集萃取液，浓缩干燥，得260g银杏内酯粗品备用。
2、中低压制备条件选择
2.1填料的筛选
选择反相硅胶(YMC-C18，10μm)和硅胶为填料进行色谱分离，结果表明利用反相硅胶可避免正相硅胶死吸附大、样品损失多的问题，且预试验证明，采用反相硅胶为填料，白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K的分离度较好，故选择YMC-C18为分离填料。
2.2洗脱剂的选择
采用Reveleris中低压制备色谱仪，以甲醇-水、甲醇-0.5％甲酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.5％甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.5％甲酸水溶液系统为流动相，考察各系统下不同配比的洗脱效果，由于乙腈与甲醇相比毒性大，且分离效果相对较差，相比之下选择甲醇作为流动相较好；而银杏二萜内酯以甲醇-水为洗脱系统可达到很好的分离效果，不必再引入甲酸而增加成本，且减少环境污染，因此最终确定以甲醇-水溶液(35:65)为洗脱系统，(0～40min)，制备色谱图见图1，故选择甲醇-水(v/v)溶液系统。
2.3样品的制备
利用Reveleris中低压制备色谱仪(美国GRACE公司)，以自制C18填料色谱柱(400mm×80mm,10μm)为分离柱，柱温为室温，流动相甲醇-水溶液(35:65)，流速100mL/min。取银杏总内酯粗品粗品30g(白果内酯的质量分数4.8％、银杏内酯A的质量分数3.0％、银杏内酯B的质量分数1.1％、银杏内酯C的质量分数0.65％、银杏内酯K的质量分数0.03％)，用适量75％丙酮溶解，进样体积为100mL，进样量10.0g，时间40min/次，3次进样。减压浓缩收集液，冷冻干燥，分别得白果内酯白色粉末1.37g，回收率为95.1％，纯度大于99.9％；银杏内酯A白色粉末0.85g，回收率94.4％，纯度大于99.9％；银杏内酯B白色粉末0.3g，回收率90.9％，纯度大于99.9％；银杏内酯C白色粉末0.18g，回收率92.3％，纯度大于99.9％；银杏内酯K白色粉末0.0082g，回收率91.1％，纯度大于99.9％。白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K采用高效液相色谱仪进行检测，检测结果如图2～图7所示，图2为银杏内酯混合对照品的高效液相色谱图，图3为本发明实施例1制备得到的银杏内酯C的高效液相色谱图，图4为本发明实施例1制备得到的白果内酯的高效液相色谱图，图5为本发明实施例1制备得到的银杏内酯A的高效液相色谱图，图6为本发明实施例1制备得到的银杏内酯B的高效液相色谱图，图7为本发明实施例1制备得到的银杏内酯K的高效液相色谱图。
实施例2
1、银杏内酯粗品制备工艺
取银杏叶20.0kg，依次用10倍量75％乙醇回流提取两次(2h/次)，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.05g/mL(25℃)。搅拌加入乙醇至乙醇体积分数为80％，静置过夜，滤过，弃去不溶物，滤液减压浓缩至无醇味，加水稀释至1:1，乙酸乙酯萃取3～5次，收集萃取液，浓缩干燥，得256g银杏内酯粗品备用。
2、中低压制备条件选择
2.1填料的筛选
选择反相硅胶(Acuity-C18，10μm)和硅胶为填料进行色谱分离，结果表明利用反相硅胶可避免正相硅胶死吸附大、样品损失多的问题，且预试验证明，采用反相硅胶为填料，白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K的分离度较好，故选择Acuity-C18为分离填料。
2.2洗脱剂的选择
采用Reveleris中低压制备色谱仪，以甲醇-水、甲醇-0.5％甲酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.5％甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.5％甲酸水溶液系统为流动相，考察各系统下不同配比的洗脱效果，最终确定以甲醇-水溶液(40:60)为洗脱系统，(0～37min)，在该洗脱剂下同样取得了较好的分离效果。
2.3样品的制备
利用Reveleris中低压制备色谱仪(美国GRACE公司)，以自制C18填料色谱柱(400mm×80mm,10μm)为分离柱，柱温为室温，流动相甲醇-水溶液(40:60)，流速100mL/min。取银杏总内酯粗品粗品30g(白果内酯的质量分数4.5％、银杏内酯A的质量分数2.8％、银杏内酯B的质量分数1.2％、银杏内酯C的质量分数0.62％、银杏内酯K的质量分数0.035％)，用适量75％丙酮溶解，进样体积为100mL，进样量10.0g，时间37min/次，3次进样。减压浓缩收集液，冷冻干燥，分别得白果内酯白色粉末1.26g，回收率为93.3％，纯度大于99.9％；银杏内酯A白色粉末0.80g，回收率95.2％，纯度大于99.9％；银杏内酯B白色粉末0.33g，回收率91.7％，纯度大于99.9％；银杏内酯C白色粉末0.17g，回收率91.4％，纯度大于99.9％；银杏内酯K白色粉末0.096g，回收率91.4％，纯度大于99.9％。
以上制得的白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K均采用高效液相色谱仪进行检测和验证。
实施例3
1、银杏内酯粗品制备工艺
取银杏叶20.0kg，依次用10倍量75％乙醇回流提取两次(2h/次)，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.05g/mL(25℃)。搅拌加入乙醇至乙醇体积分数为80％，静置过夜，滤过，弃去不溶物，滤液减压浓缩至无醇味，加水稀释至1:1，乙酸乙酯萃取3～5次，收集萃取液，浓缩干燥，得276g银杏内酯粗品备用。
2、中低压制备条件选择
2.1填料的筛选
选择反相硅胶(XB-C18，10μm)和硅胶为填料进行色谱分离，结果表明利用反相硅胶可避免正相硅胶死吸附大、样品损失多的问题，且预试验证明，采用反相硅胶为填料，白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K的分离度较好，故选择XB-C18为分离填料。
2.2洗脱剂的选择
采用Reveleris中低压制备色谱仪，以甲醇-水、甲醇-0.5％甲酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.5％甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.5％甲酸水溶液系统为流动相，考察各系统下不同配比的洗脱效果，最终确定以甲醇-水溶液(45:55)为洗脱系统，(0～35min)，在该洗脱剂下同样取得了较好的分离效果。
2.3样品的制备
利用Reveleris中低压制备色谱仪(美国GRACE公司)，以自制C18填料色谱柱(400mm×80mm,10μm)为分离柱，柱温为室温，流动相甲醇-水溶液(45:55)，流速100mL/min。取银杏总内酯粗品粗品30g(白果内酯的质量分数4.7％、银杏内酯A的质量分数2.9％、银杏内酯B的质量分数1.5％、银杏内酯C的质量分数0.67％、银杏内酯K的质量分数0.04％)，用适量75％丙酮溶解，进样体积为100mL，进样量10.0g，时间37min/次，3次进样。减压浓缩收集液，冷冻干燥，分别得白果内酯白色粉末1.28g，回收率为90.8％，纯度大于99.9％；银杏内酯A白色粉末0.85g，回收率97.7％，纯度大于99.9％；银杏内酯B白色粉末0.42g，回收率93.3％，纯度大于99.9％；银杏内酯C白色粉末0.19g，回收率94.5％，纯度大于99.9％；银杏内酯K白色粉末0.0108g，回收率90％,纯度大于99.9％。
以上制得的白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯K均采用高效液相色谱仪进行检测和验证。
实施例4
1、银杏内酯粗品制备工艺
取银杏叶20.0kg，依次用10倍量75％乙醇回流提取两次(2h/次)，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.05g/mL(25℃)。搅拌加入乙醇至乙醇体积分数为80％，静置过夜，滤过，弃去不溶物，滤液减压浓缩至无醇味，加水稀释至1:1，乙酸乙酯萃取3～5次，收集萃取液，浓缩干燥，得259g银杏内酯粗品备用。
2、样品的制备
利用Reveleris中低压制备色谱仪(美国GRACE公司)，以自制C18填料色谱柱(YMC-C18，400mm×80mm,10μm)为分离柱，柱温为室温，流动相甲醇-水溶液(25:75)，流速100mL/min。取银杏总内酯粗品粗品30g(白果内酯的质量分数4.8％、银杏内酯A的质量分数2.6％、银杏内酯B的质量分数1.3％、银杏内酯C的质量分数0.69％、银杏内酯K的质量分数0.05％)，用适量75％丙酮溶解，进样体积为100mL，进样量10.0g，进行分离制备，运行2h后除白果内酯、银杏内酯C可以制备得到，其他几个无法制备得到。
因此，此制备条件无法满足制备所有目标产物。
实施例5
1、银杏内酯粗品制备工艺
取银杏叶20.0kg，依次用10倍量75％乙醇回流提取两次(2h/次)，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.05g/mL(25℃)。搅拌加入乙醇至乙醇体积分数为80％，静置过夜，滤过，弃去不溶物，滤液减压浓缩至无醇味，加水稀释至1:1，乙酸乙酯萃取3～5次，收集萃取液，浓缩干燥，得263g银杏内酯粗品备用。
2、样品的制备
利用Reveleris中低压制备色谱仪(美国GRACE公司)，以自制C18填料色谱柱(YMC-C18，400mm×80mm,10μm)为分离柱，柱温为室温，流动相甲醇-水溶液(65:35)，流速100mL/min。取银杏总内酯粗品粗品30g(白果内酯的质量分数4.5％、银杏内酯A的质量分数2.3％、银杏内酯B的质量分数1.6％、银杏内酯C的质量分数0.63％、银杏内酯K的质量分数0.04％)，用适量75％丙酮溶解，进样体积为100mL，进样量10.0g，进行分离制备，运行25min后所有目标化合物堆积在一起洗脱下来，不能有效分离，无法得到目标产物。
因此，此制备条件无法满足制备所有目标产物。
对比实验：
根据CN105801600A提供方法制备银杏内酯类化合物如下：制备得到的白果内酯的收率为85.9％、银杏内酯A的收率为80.5％、银杏内酯B的收率为83.7％、银杏内酯C的收率为83.8％，纯度均大于99％，但无法制备得到银杏内酯K。另外，制备的样品收率均低于本发明实验。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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