具体实施方式

我们发现的是，活化的吗啉代亚基的两个非对映体，可通过其物理性质进行拆分，以允许制备非对映体纯的异构体。这允许在受控的反应条件下制备立体化学纯的或基本上立体化学纯的PMO，其可随后用于选择性制备具有所需立体化学的寡核苷酸。

实施方案亦可提供用于将上文所公开的化合物的非对映体混合物分离成立体化学纯的或基本上立体化学纯的化合物的方法。一旦被分离，来自前述非对映体混合物的所述纯的非对映体便可用于通过立体选择性偶联反应制备非对映体纯的化合物。

如本文所述制备的非对映体纯的化合物和基本上非对映体纯的化合物，可以是非对映体纯的磷酰二胺寡核苷酸。这些非对映体纯的和基本上非对映体纯的磷酰二胺寡核苷酸可具有多种用途。例如，其可用作药物。可针对潜在优于磷酰二胺寡核苷酸的非对映体的不均一混合物(立体随机的混合物)的特性对其进行选择。例如，可针对在效力、功效、稳定性、安全性和特异性上的差异对其进行选择。非对映体纯的和基本上非对映体纯的低聚物可具有不同于低聚物的立体化学不均一混合物的物理特性、化学特性和生物学特性。

“立体异构体”是指仅原子在空间的排列上不同的异构体。

“非对映体”是指互相不为镜像的立体异构体。

“对映体”是指彼此为不可重叠的镜像的立体异构体。对映体包括“对映体纯的”异构体，其基本上包含单对映体，例如，大于或等于90％、92％、95％、98％或99％或者等于100％的单对映体。

“活化单体”是指这样的5’-O-磷酸化吗啉代亚基，其含有具有离去基团的活性磷，包括但不限于氯化物离去基团和卤化物离去基团，其经历与亲核试剂的置换反应，所述亲核试剂包括但不限于胺和醇。

“R”和“S”作为描述异构体的术语，为不对称取代原子的立体构型的描述符，所述原子包括但不限于：碳、硫、磷和铵态氮。将不对称取代原子标示为“R”或“S”，通过应用Cahn-Ingold-Prelog优先规则来完成，如本领域技术人员众所周知的，和描述于International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)Rules for theNomenclature of Organic Chemistry(用于有机化学命名法的国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)规则).E部分，立体化学。

可通过其使平面偏振光的平面旋转的方向来表征对映体，如化学领域的技术人员所众所周知的。如果其使所述光顺时针旋转(如通过所述光射向的观察者所见)，则将所述对映体标记(+)，且表示右旋的。其镜像将使平面偏振光以逆时针方向旋转，且标记(-)，或左旋的。对映体纯的化合物围绕平面偏振光旋转的方向，称为旋光符号(sign of opticalrotation)，可用已知为旋光仪的标准设备容易地测定。

“消旋的”是指含有等份的各对映体的混合物。

“非消旋的”是指含有不等份的各对映体的混合物。非消旋混合物可富含R-或S-构型，包括但不限于约50/50、约60/40以及约70/30的R-/S-对映体混合物或者S-/R-对映体混合物。

“基本上立体化学纯的”和“基本立体化学纯净”是指分别为对映体过量的或非对映体过量的对映体或非对映体，其等于或大于80％。在一些实施方案中，“基本上立体化学纯的”和“基本立体化学纯净”是指分别为对映体过量的或非对映体过量的以下对映体或非对映体，其等于或大于87％、等于或大于90％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％或者等于或大于99％。“基本上非对映体纯的”是指为未非对映体过量的非对映体，其等于或大于87％、等于或大于90％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％或者等于或大于99％。

对映体的“对映体过量”(ee)为[(主要对映体的摩尔分数)-(次要对映体的摩尔分数)]×100。两种非对映体的混合物中的一种非对映体的非对映体过量(de)为类似定义的。

如在本文中使用的“药学上可接受的盐”，是指本公开内容中的化合物的酸加成盐或碱加成盐。药学上可接受的盐为这样的任何的盐，其保留母体化合物的活性，且不会对其给予的受试者和在其给予的情况下带来任何不适当的有害或不合乎需要的作用。药学上可接受的盐包括但不限于金属络合物以及无机酸和羧酸二者的盐。药学上可接受的盐亦包含金属盐，例如铝盐、钙盐、铁盐、镁盐、锰盐和络盐。此外，药学上可接受的盐包括但不限于：酸式盐，例如醋酸盐、天冬氨酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、乙酰氧乙基(axetil)盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、丁酸盐、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯苯甲酸盐、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐、乙磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酸盐、羟乙酰基胺基苯砒酸盐、环己胺磺酸盐(hexamic)、己基间苯二酚盐(hexylresorcinoic)、海巴酸(hydrabamic)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、羟萘甲酸盐、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、粘康酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、对硝基甲磺酸盐、扑酸盐、泛酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、邻苯二甲酸盐、多聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、氨基磺酸盐、对氨基苯磺酸盐(sulfanlic)、磺酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐(teoclic)、甲苯磺酸盐，等等。

治疗剂的组合(例如化合物1和CDK 4/6抑制剂)的“有效量”为这样的量，与留在受试者或患者中的未治疗的HCC或IHCC相比，其足以提供可观察到的治疗益处。

可将如在本文中报道的活性物质与药学上可接受的载体组合以提供其药物制剂。载体和制剂的具体选择将取决于意图所述组合物给予的具体途径。

如在本文中使用的“药学上可接受的载体”是指无毒的载体、辅料或溶媒，其不会破坏与之一起进行配制的化合物的药理活性。可用于本发明的组合物的药学上可接受的载体、辅料或溶媒，包括但不限于山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明的组合物可适于胃肠外给予、口服给予、雾化吸入给予、局部给予、直肠给予、鼻内给予、经颊给予、阴道给予或植入型药盒给予等。在一些实施方案中，所述制剂包含来自天然或非天然来源的成分。在一些实施方案中，所述制剂或载体可以无菌形式提供。无菌载体的非限制性实例包括无内毒素水或无热原水。

如在本文中使用的术语“胃肠外的”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。在具体的实施方案中，将所述化合物静脉内给予、口服给予、皮下给予或经由肌内给予来给予。本发明组合物的无菌注射形式可以是水性或油质混悬剂。可使用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂，按照本领域已知的技术来配制这些混悬剂。所述无菌注射制品亦可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬剂。水、林格氏液和等渗氯化钠溶液在可用的所述可接受的溶媒和溶剂之列。此外，通常将无菌不挥发性油用作溶剂或助悬介质。

本发明的实施方案提供制备立体化学纯的异构体或基本上立体化学纯的异构体，接着提供使用所述纯异构体立体选择性制备非对映体纯的磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)。制备可以是通过分离氯化磷酰胺核苷酸的非对映体混合物进行。分离可通过例如色谱法进行；例如，高效液相色谱法或“HPLC”。分离亦可通过结晶来完成。

分离的单体可称为“活性”单体。对于“活性的”，其意指所述单体包含对多种亲核试剂有反应性的氯化磷酰胺部分，所述亲核试剂包括但不限于：胺、醇/醇盐、硫醇/硫醇盐、烷基锂和格式试剂。

I.非对映异构体的制备

在一个实施方案中，可通过分离单体的非对映体混合物来制备立体化学纯的或基本上立体化学纯的活化单体。可通过允许使用物理特性来区分立体异构体的方法来完成分离。例如，可通过色谱法或结晶来完成分离。合适的色谱类型包括，例如但不限于高效液相色谱法(HPLC)、模拟移动床色谱法、逆流色谱法和其他类型的分离色谱法。例如，可使非对映体混合物进行HPLC，洗脱出快速流动流分和慢速流动流分。这些流分各自为不同量的立体化学纯的或基本上立体化学纯的单体。如下所述，可通过使用受控反应条件的立体选择性偶联，将这些单体用于制备具有所需立体化学的低聚物。

我们进一步确定的是，一旦被分离，所述立体化学纯的活化单体便具有足以用于进一步化学反应的稳定性。此外，我们确定的是，所述立体化学纯的活化单体可进行立体选择性化学反应。因此，如在下文中更详细地论述，这些立体化学纯的活化单体可用于立体选择性偶联反应以制备立体化学纯的产物。

如上所述，实施方案可提供一种或多种立体化学纯的或基本上立体化学纯的表1的化合物，其可利用所述立体异构体中的不同物理特性来制备。另外的实施方案亦可提供表1化合物的对映体。通常所述对映体的立体化学因所述吗啉代环的立体化学的改变而不同于表1化合物的立体化学。

表1

其中R3为任选取代的三苯甲基(triphenylmethyl)(亦称为“trityl”)、任选取代的苄基或磺酰基。R4、R5和R6可以是-C(O)R7或-C(O)OR8，其中R7为甲基、乙基或苯基，且R8为苄基或2,2,2-三氯乙基。R₉可以是任选取代的烷基、氰乙基(用作保护基团，参见例如美国专利申请公布号US2013/0197220)、酰基、磺酰基、缩醛/缩酮、碳酸酯、氨基甲酸酯、任选取代的苄基、4-特戊酰氧基苄基和甲硅烷基。

在一些实施方案中，所述任选取代的苄基为4-甲氧苄基(PMB、MPM)。在一些实施方案中，磺酰基为可裂解磺酰基。在一些实施方案中，磺酰基为2-硝基苯磺酰基、4-硝基苯磺酰基或2,4-二硝基苯磺酰基。

R1和R2可以是相同的或不同的，且可以是-H，任选取代的C1-C3烷基、任选取代的苯基、任选取代的萘基，或者与其连接的氮形成任选取代的杂环，所述杂环可以是例如吡咯烷、哌嗪或吗啉。

任选取代的部分可使用甲基、乙基、卤素、硝基或氰基中的一个或多个取代。

R3可以是三苯甲基(Tr)，其可以是取代的三苯甲基，包括但不限于例如MMTr(对甲氧基苯基二苯甲基)、苄基、4-甲氧苄基(PMB、MPM)、3,4-二甲氧苄基、二苯甲基(Dpm)。

R4、R5、R6可以是-H、-C(O)R7或-C(O)OR7，其中R7为烷基(甲基、乙基、异丙基或其他C1-C6烷基)或芳基(包括但不限于苯基、4-甲氧基苯基、4-溴苯基和4-硝基苯基)。

II.立体选择性偶联

除确定了分离技术可能用于制备基本上立体化学纯的大量活化单体之外，我们亦确定的是，在某些反应条件下，这些活化单体可用于完成立体选择性偶联，以用于制备立体化学纯的二核苷酸、立体化学纯的三核苷酸和更大的立体化学纯的低聚物。通过使用本文所报道的方法，新形成的PMO键合的手性可通过用于形成所述低聚物的立体化学纯的活性单体的手性来特异性编码。

用于立体选择性偶联的典型反应条件包括在非质子溶剂中的反应。这些溶剂可以是，例如但不限于乙腈、四氢呋喃(THF)、1,3-二甲基咪唑烷酮、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、二甲基乙酰胺(DMAc)、二氯甲烷(DCM)、1,2-二氯乙烷(DCE)、氯仿、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、2-甲基四氢呋喃和乙酸异丙酯。可在存在非亲核叔胺碱和芳族碱的情况下进行偶联反应。合适的碱包括但不限于二异丙基乙胺、三乙胺、2,6-二甲基吡啶、三甲基吡啶(可力丁)和N-乙基吗啉。反应温度范围可从室温(约20℃)至50℃。在某些情况下可应用超声处理来帮助溶解底物。

为证实立体选择性偶联的可行性，通过快洗脱的和慢洗脱的基本上立体化学纯的活性单体(氯化磷酰胺)的立体选择性PMO偶联来制备多种基本上立体化学纯的PMO二核苷酸。下文表2概述了这些基本上立体化学纯的PMO二核苷酸的HPLC保留特征。该表比较了从该表左侧所列的5’-端单体与上方所列的3’-端单体的较快洗脱和较慢洗脱的异构体二者的组合制备的二核苷酸的保留时间。该表证实的是，基本上立体化学纯的活性单体的立体选择性偶联产生具有不同物理特性的不同的非对映体纯的二核苷酸。

用于表征表2的所述基本上立体化学纯的PMO二核苷酸的分析型HPLC条件如下报道：

实施例

III.活化单体的非对映体分离的实施例

以下实施例显示根据如在本文中所示的某些实施方案的活化单体的非对映体分离。

A.U-单体

用于活化的U单体的分析型HPLC条件：

用于活化的U单体的制备型HPLC条件：

Chiralpak IC，21x 250mm，5μ；使用乙酸乙酯以11ml/分钟洗脱柱，室温，260nm检测。

[U₁的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.18(br,1H),7.45(m,6H),7.15-7.32(m,10H),6.12(dd,1H,J＝2.0&9.6Hz),5.62(d,1H,J＝8.0Hz),4.39(m,1H),4.11(m,2H),3.39(d,1H,J＝11Hz),3.15(d,1H,J＝11Hz),2.65(s,3H),2.62(s,3H),1.49(t,1H,J＝11Hz),1.39(t,1H,J＝11Hz)

[U₂的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.07(br,1H),7.44(m,6H),7.14-7.34(m,10H),6.12(dd,1H,J＝2&9Hz),5.61(d,1H,8.0Hz),4.39(m,1H),4.08(m,2H),3.39(d,1H,J＝12Hz),3.15(d,1H,J＝12Hz),2.66(s,3H),2.62(s,3H),1.46(t,1H,J＝11Hz),1.38(t,1H,J＝11Hz),

B.A-单体

用于活化的A单体的分析型HPLC条件：

用于活化的A单体的制备型HPLC条件：

Chiralpak IC，21x 250mm，5u；使用100％乙酸乙酯以15ml/分钟洗脱，室温，uv260nm检测。

[A₁的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.01(br,1H),8.79(s,1H),8.00(m,3H),7.58(m,1H),7.4-7.6(m,8H),7.2-7.4(m,10H),6.42(d,1H,J＝8.4Hz),4.51(m,1H),4.12(m,3H),3.54(d,1H,J＝12Hz),3.25(d,1H,J＝12Hz),2.62(s,3H),2.59(s,3H),1.81(t,1H,J＝11Hz),1.62(t,1H,J＝11Hz)

[A₂的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.04(br,1H),8.79(s,1H),8.00(m,3H),7.56(m,1H),7.4-7.6(m,8H),7.2-7.4(m,10H),6.41(d,1H,J＝8.4Hz),4.51(m,1H),4.12(m,3H),3.54(d,1H,J＝12Hz),3.25(d,1H,J＝12Hz),2.64(s,3H),2.61(s,3H),1.82(t,1H,J＝11Hz),1.63(t,1H,J＝11Hz)

C.C-单体

用于活化的C单体的分析型HPLC条件：

用于活化的C单体的制备型HPLC条件：

使用75％乙酸乙酯和25％正庚烷以15ml/分钟洗脱Chiralpak IC。室温和uv260nm检测。

[C₁的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.66(d,1H,J＝7.8Hz),7.43(m,6H),7.33(d,1H,J＝7.4Hz),7.15-7.32(m,9H),6.18(dd,1H,J＝2.2&9.2Hz),4.42(m,1H),4.08-4.16(m,2H),3.54(d,1H,J＝11Hz),3.14(d,1H,J＝12Hz),2.64(s,3H),2.60(s,3H),2.23(s,3H),1.51(t,1H,J＝11Hz),1.25(m,1H).

[C₂的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.64(d,1H,J＝7.8Hz),7.43(m,6H),7.32(d,1H,J＝7.4Hz),7.15-7.32(m,9H),6.19(dd,1H,J＝2.1&9.2Hz),4.41(m,1H),4.06-4.15(m,2H),3.54(d,1H,J＝11Hz),3.15(d,1H,J＝12Hz),2.64(s,3H),2.61(s,3H),2.22(s,3H),1.49(t,1H,J＝11Hz),1.25(m,1H)

D.G-单体(单保护的鸟嘌呤)

用于活化的G单体的分析型HPLC条件：

用于活化的G单体的制备型HPLC条件：

使用100％乙酸乙酯以15ml/分钟洗脱Chiralpak IC。室温和uv 260nm检测。

E.T-单体

用于活化的T单体的分析型HPLC条件：

用于活化的T单体的制备型HPLC条件：

Chiralpak IC，50x 500mm，20u。使用乙酸乙酯以60ml/分钟洗脱柱，室温，260nm检测。保留时间为25和40分钟。

[T1的1H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.4-7.5(m,5H),7.26-7.33(m,6H),7.16-7.22(m,3H),7.04(d,1H,J＝1Hz),6.12(dd,1H,J＝2&10Hz),4.39(m,1H),4.12(m,2H),3.37(d,1H,J＝12Hz),3.15(d,1H,J＝12Hz),2.66(s,3H),2.63(s,3H),1.83(d,1H,J＝1Hz),1.49(t,1H,J＝11Hz),1.41(t,1H,J＝11Hz))

[T2的1H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.4-7.5(m,6H),7.24-7.35(m,6H),7.14-7.22(m,3H),7.03(s,1H),6.12(dd,1H,J＝2&10Hz),4.39(m,1H),4.09(m,2H),3.37(d,1H,J＝11Hz),3.15(d,1H,J＝11Hz),2.66(s,3H),2.62(s,3H),1.82(s,3H),1.48(t,1H,J＝11Hz),1.40(t,1H,J＝11Hz)

F.C-单体(NBz)

用于活化的C单体(NBz)的分析型HPLC条件：

用于活化的C单体(NBz)的制备型HPLC条件：

Chiralpak IB，20x 250mm，5u，使用100％乙腈以9ml/分钟洗脱。室温和uv 260nm检测。保留时间为13分钟和16分钟。

G.G-单体(双保护的鸟嘌呤)

用于活化的G单体(双保护的鸟嘌呤)的分析型HPLC条件：

用于活化的G单体(双保护的鸟嘌呤)的制备型HPLC条件：

Chiralpak IA，50x 500mm，使用100％乙酸乙酯以60ml/分钟洗脱。室温和uv260nm检测。保留时间为20分钟和24分钟。

[G₁(双保护的鸟嘌呤)的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.76(s,2H),7.50(d,2H,J＝9Hz),7.4-7.5(m,6H),7.26-7.32(m,6H),7.16-7.22(m,3H),7.02(d,2H,J＝9Hz),6.24(dd,1H,J＝2&10Hz),5.61(d,1H,J＝12Hz),5.56(d,1H,J＝12Hz),4.48(m,1H),4.1(m,2H),3.47(d,1H,J＝11Hz),3.23(d,1H,J＝12Hz),3.2(m,1H),2.62(s,3H),2.59(s,3H),1.75(t,1H,J＝11Hz),1.57(t,1H,J＝12Hz),1.33(s,9H),1.33(t,6H,J＝7Hz)

[G₂(双保护的鸟嘌呤)的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.78(s,1H),7.77(s,1H),7.50(d,2H,J＝9Hz),7.4-7.5(m,6H),7.26-7.33(m,6H),7.15-7.22(m,3H),7.02(d,2H,J＝9Hz),6.23(dd,1H,J＝2&10Hz),5.61(d,1H,J＝12Hz),5.56(d,1H,J＝12Hz),4.47(m,1H),4.1(m,2H),3.47(d,1H,J＝11Hz),3.22(d,1H,J＝12Hz),3.2(m,1H),2.64(s,3H),2.60(s,3H),1.75(t,1H,J＝11Hz),1.58(t,1H,J＝11Hz),1.33(s,9H),1.33(t,6H,J＝7Hz)

IV.使用非对映体纯的活化单体的立体选择性PMO偶联的实施例

下列实施例报道了使用立体选择性偶联制备立体化学均一的产物。A.活化的U-单体(U₁&U₂)+U-吗啉-NH(1)

将U₁(11mg，0.018mmol，1eq，99.0％de)溶于乙腈(0.11ml)并与二异丙基乙胺(8μL，0.05mmol，2.5eq)混合。加入U-吗啉-NH(1；14mg，0.030mmol，1.6eq)并应用超声处理以帮助溶解。在0.5h搅拌之后，使用CDCl₃稀释一小等份的反应混合物并通过¹H NMR分析。使用乙腈(8ml)稀释所有剩余的反应混合物以用于HPLC分析并在冰箱中保存。通过HPLC分析验证了2的立体选择性形成(99.4％de)。亦将上述方案用于U₂(95.6％de)的偶联以立体选择性地产生3(96.0％de)。

用于U/U-偶联的分析型HPLC条件：

[2的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.6(m,4H),7.2-7.5(m,20H),7.1-7.2(m,3H),6.15(d,1H,J＝8.0Hz),5.73(d,1H,J＝8.0Hz),5.66(d,1H,J＝8.0Hz),5.54(d,1H,J＝8.0Hz),4.40(m,1H),3.93(m,2H),3.81(m,1H),3.70(m,2H),3.41(m,2H),3.40(m,3H),3.11(d,1H,J＝12Hz),2.78(m,1H),2.56(s,3H；NMe),2.54(s,3H；NMe),2.48(m,1H),1.47(t,1H,J＝11Hz),1.35(t,1H,J＝11Hz),1.04(s,9H)

[3的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.6(m,4H),7.3-7.5(m,11H),7.2-7.3(m,9H),7.1(m,3H),6.12(dd,1H,J＝2.0&9.6Hz),5.71(d,1H,J＝8.4Hz),5.70(d,1H,J＝8.0Hz),5.47(dd,1H,J＝2.0&10.4Hz),4.31(m,1H),3.97(m,1H),3.85(m,1H),3.73(m,2H),3.65(m,1H),3.31(m,2H),3.24(m,1H),3.07(d,1H,J＝12Hz),2.68(m,1H),2.65(s,3H；NMe),2.62(s,3H；NMe),2.26(m,1H),1.45(t,1H,J＝12Hz),1.29(t,1H,J＝11Hz),1.04(s,9H)

B.活化的C-单体(C₁&C₂)+C-吗啉-NH(4)

将C₁(20mg，0.031mmol，1eq，93.5％de)溶于/悬浮在THF(0.40ml)中并与二异丙基乙胺(12μL，0.069mmol，2.3eq)混合。加入溶于THF(0.20mL)的吗啉代-胞嘧啶(4；16mg，0.035mmol，1.1eq)。在1.0-2.0h搅拌之后，使用乙腈稀释一小等份反应混合物并通过LC/MS分析。使用二氯甲烷(0.6ml)稀释一等份(30-50μL)的反应混合物以用于HPLC分析。通过HPLC分析验证了6的立体选择性形成(94.3％de)。将所述反应混合物直接上样至硅胶柱并使用含0-15％甲醇的乙酸乙酯的梯度流动相洗脱。亦将上述方案用于C₂(90.2％de)的C/C偶联以立体选择性地产生5(90.0％de)。

用于C/C-偶联的分析型HPLC条件：

[5的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.9(br,1H),7.69(d,1H,J＝7.4Hz),7.62(m,5H),7.35-7.44(m,13H),7.21-7.35(m,6H),7.15(m,4H),6.14(br d,1H,J＝7.8Hz),5.58(dd,1H,J＝2.4&9.4Hz),5.53(br,1H),4.51(dd,1H,J＝8.6&10Hz),4.09(m,1H),3.70-3.80(m,4H),3.60(dd,1H,J＝6.3&10Hz),3.56(d,1H,J＝11Hz),3.28(m,1H),2.96(d,1H,J＝11Hz),2.69(s,3H；NMe),2.67(s,3H；NMe),2.65(m,1H),2.25(m,1H),2.07(s,3H),1.31(t,1H,J＝11Hz),1.13(t,1H,J＝11Hz),1.04(s,9H).

[6的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.57(br,1H),7.62-7.70(m,7H),7.35-7.50(m,14H),7.23-7.35(m,4H),7.12(m,4H),6.31(m,1H),5.79(m,1H),5.70(m,1H),4.61(m,1H),4.03(m,1H),3.80-3.90(m,2H),3.72(m,2H),3.58(m,1H),3.48(m,1H),3.09(m,1H),2.75(m,1H),2.58(s,3H；NMe),2.55(s,3H；NMe),2.53(m,1H),2.38(m,1H),2.21(s,3H),1.47(t,1H,J＝10Hz),1.22(t,1H,J＝10Hz),1.06(s,9H).

C.活化的A-单体(A₁&A₂)+U-吗啉-NH(1)

将A₁(5.9mg，0.008mmol)悬浮在乙腈(118μL)中。加入二异丙基乙胺(5μL，0.03mmol)，接着加入吗啉代-尿嘧啶(1；4.6mg，0.01mmol)。应用超声处理1min并在环境温度搅拌所得的均一混合物。过夜搅拌之后，使用乙腈(5.0ml)和甲醇(0.30ml)的混合物稀释所述混合物(浓稠的白色膏状物)，得到均一的澄清溶液。在无进一步稀释的情况下直接通过HPLC分析一小等份。

将A₂(F2；5.0mg，0.007mmol)悬浮在乙腈(100μL)中。加入二异丙基乙胺(4μL，0.02mmol)，接着加入吗啉代-尿嘧啶(4.1mg，0.009mmol)。应用超声处理1min并在环境温度搅拌所得的浓稠混悬液。过夜搅拌之后，加入乙腈(5.0ml)并应用超声处理，得到均一的澄清溶液。在无进一步稀释的情况下直接通过HPLC分析一小等份。

用于U/A-偶联的分析型HPLC条件：

D.活化的G-单体(G₁&G₂)+U-吗啉-NH(1)

将G₁(6.5mg，0.009mmol，1eq，99.9％de)溶于/悬浮在THF(0.13ml)中并与二异丙基乙胺(3.6μL，0.02mmol，2.2eq)混合。加入溶于THF(0.07mL)的吗啉代-尿嘧啶(1；4.7mg，0.010mmol，1.1eq)。在1.0-2.0h搅拌之后，使用乙腈稀释一小等份的反应混合物并通过LC/MS分析。使用二氯甲烷(0.4ml)稀释一等份(100μL)的反应混合物以用于HPLC分析。通过HPLC分析验证了9的立体选择性形成(99.9％de)。

用于U/G-偶联的分析型HPLC条件：

可将如上所报道的基本上非对映体纯的化合物用于制备立体化学纯的寡核苷酸和其他化合物。可能的寡核苷酸的实例显示于例如Summerton，J(1999).“MorpholinoAntisense Oligomers:The Case for an RNase-H Independent Structural Type(吗啉代反义低聚物：不依赖于RNA酶-H的结构类型的实例)”.Biochimica et Biophysica Acta1489(1)：141-58；和Summerton，J；Weller D.(1997).“Morpholino Antisense Oligomers:Design,Preparation and Properties(吗啉代反义低聚物：设计、制备和特性)”.Antisense&Nucleic Acid Drug Development 7(3)：187-95。这两篇文献均通过引用结合到本文中。

V.16-mer PMO的立体选择性合成及通过生物物理学测定法区分立体异构体的实施例

本实施例报道了通过使用活化单体的立体选择性偶联、目标为一对立体纯的16-mer PMO的合成。这些PMO就其磷键合而言具有相反的立体化学排列。

目标序列：

立体纯的活性单体(结构单元)：

用于16-mer PMO的立体选择性合成并通过生物物理学测定法区分立体异构体的方案在图6中显示。以50mg规模(起始树脂重量)，通过在二硫化氨甲基聚苯乙烯树脂上的固相合成来手动制备所述16-mer PMO立体异构体1和立体异构体2(上样约300μmol/g，参见美国专利申请公布号20090131624A1，其通过引用结合到本文中)。

用于固相合成的贮存液：

每个PMO偶联的操作循环：

*40℃，3小时或者室温，12小时。

从树脂释放和脱保护：

向所述树脂结合的16-mer(脱三苯甲基之后)加入1:3(v/v)的28％氨/乙醇水溶液(约5ml)。将所述混合物密封并于45℃加热20小时。在冷却至室温之后，将所述混合物过滤并用甲醇洗涤。将滤液浓缩并用15mM三乙铵(TEAA)缓冲液pH 7.0渗滤。使用的装置为带有Ultracel 1kDa UF膜的Amicon Stirred Cell(50mL)。通过稀释/浓缩将所述样品渗滤直至原溶剂减少至1％原浓度(约5个循环)，以及随后进行反相制备型HPLC纯化。

用于PMO纯化的反相制备型HPLC法：

用于PMO的质量评价的LC/MS法：

用于解链温度(Tm)测定的材料和条件

对在立体化学上不同的PMO与互补RNA的复合物的热解链表征的概述：

立体异构体1和2的解链温度在图7中显示。基于所述不同的解链温度，可推断的是，已制备了分离的大量的基本上纯的立体异构体。

VI.立体纯的PMO二核苷酸化合物100(5’-TA₂-3’)的立体选择性合成和绝对立体化学配置的实施例

将洗脱较晚的活性A单体(A₂；200mg，0.277mmol，1eq)溶于乙腈(2.0ml)和DIPEA(0.12ml，0.69mmol，2.5eq)的混合物。然后加入T-吗啉-NH(1；146mg，0.305mmol，1.1eq)并将所得混悬液超声处理数分钟直至获得澄清溶液。于室温将所述反应混合物搅拌过夜。在通过LC/MS监测到完全反应之后，将所述混合物浓缩并进行柱色谱(含3％甲醇的DCM，Biotage SnapUltra 10g SiO₂)。将澄清的产物级分合并并在真空下浓缩，得到作为白色固体的全保护的立体纯的5’-TA-3’二核苷酸2(240mg，0.206mmol，74％产率)。

于室温向25ml烧瓶中的所述全保护的二核苷酸2(500mg，0.429mmol)中加入2,2,2-三氟乙醇(TFE；4.0ml)和醋酸(1.0ml)。于室温搅拌所得混合物并通过LC/MS监测。30分钟之后，用饱和NaHCO₃水溶液和DCM淬灭反应。将两个层分离并对水层进行回提。将所有有机层合并，用半饱和盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩，得到作为白色泡沫的粗产物。通过柱色谱(含20％MeOH的丙酮，Biotage Snap Ultra 25g SiO₂柱)纯化所述粗产物，得到作为玻璃状固体的部分保护的二核苷酸3(300mg，0.325mmol，76％产率)。

将所述部分保护的二核苷酸3(250mg，0.271mmol)溶于甲醇(12.5ml)和THF(12.5mL)的混合物并于室温用1M NaOH(10.8ml)处理。在室温搅拌22h之后(通过LC/MS监测过程)，用1M HCl(10.8mL)中和所述混合物以调节pH为8，并随后在真空下浓缩至干燥。将残留物溶于水(5mL)并用EtOAc(5mL)洗涤。在真空下将水层浓缩至干燥，得到作为白色固体的粗产物(480mg)。通过大小排阻层析法纯化所述粗产物(LH-20，MeOH/水4:1)，得到作为白色固体的全保护的二核苷酸化合物100(137mg，0.236mmol，87％产率)。

用纯水将一滴化合物100水溶液(200mg/ml)密封在孔中达一天，以生长单晶。所述单晶的X-射线结构将所述磷键合的绝对构型确认为S。该X-射线结构以ORTEP图显示于图8。独立片段的ORTEP图显示于图9A和图9B。如下所报道收集X-射线数据。

数据收集

将化合物100(C₂₂H₃₃N₁₀O₇P)的单晶安装在玻璃纤维上。使用石墨单色化的Cu-Kα辐射用衍射仪进行所有测定。

用于数据收集的晶胞常数和取向矩阵，使用36473个小心集中在范围为7.75<2θ<147.10°的衍射数据(reflection)的设定角获自最小二乘法修正，其对应于具有以下尺寸的C心单斜晶胞：

β＝96.8075(6)°

对于Z＝4且F.W.＝580.54，计算密度为0.594g/cm³。基于衍射条件：

hkl：h+k＝2n

堆积考虑、强度分布的统计分析以及结构的成功解析和修正，将空间群确定为：

C2(#5)

使用ω-2θ扫描技术至最大2θ值147.7°，在温度23±1℃收集数据。在数据收集之前进行的数个强衍射点的ω扫描，具有0.00°的平均半高峰宽，出射角为6.0°。以0.0°/min的速度进行(0.00+0.00tanθ)°的扫描(以ω方式)。

数据简化

收集50795个衍射数据，其中12008个为独特的(Rint＝0.0453)。使用CrysAlisPro(Rigaku Oxford Diffraction)收集并处理数据。(CrysAlisPro：数据收集和处理软件，Rigaku Corporation(2015).Tokyo 196-8666，日本)。不使用衰变校正。

用于Cu-Kα辐射的线性吸收系数μ为6.011cm^-1。应用经验吸收校正，得到范围从0.341至1.00 0的透射因数。针对Lorentz和偏振效应校正所述数据。

结构解析和修正

通过直接法解析所述结构(SHELXT Version 2014/5：Sheldrick，G.M.(2014).Acta Cryst.A70，C1437)并使用Fourier技术扩展。按各向异性修正非氢原子。使用跨式模型修正氢原子。最终循环的基于F²的全矩阵最小二乘法修正(使用最小二乘法最小化函数：(SHELXL Version 2014/7)；Σw(Fo²-Fc²)²，其中w＝最小二乘法权重)，是基于12008个可观察的衍射数据和849个可变参数，且使用以下未加权的和加权的偏离因子进行收敛(最大参数偏移为0.00乘以其esd)：

R1＝Σ||Fo|-|Fc||/Σ|Fo|＝0.0522

wR2＝[Σ(w(Fo²-Fc²)²)/Σw(Fo²)²]^1/2＝0.1632

拟合优度为1.45。拟合优度定义为：[Σw(Fo2-Fc2)2/(No-Nv)]^1/2，其中：No＝观察结果数量和Nv＝变量数量。

使用了单位权。最终的差值傅里叶图上的最大峰和最小峰分别对应于和最终的Flack参数为0.029(7)，表明所述结构为倒反孪晶。(Parsons，S.和Flack，H.(2004)，Acta Cryst.A60，s61；Flack，H.D.和Bernardinelli(2000)，J.Appl.Cryst.33，114-1148)。

中性原子散射因子取自国际晶体学表(IT)，C卷，表6.1.1.4。(InternationalTables for Crystallography(国际晶体学表)，C卷(1992).A.J.C.Wilson编辑，KluwerAcademic Publishers，Dordrecht，荷兰，表6.1.1.4，第572页)。反常色散效应包含于Fcalc(Ibers，J.A.&Hamilton，W.C.；Acta Crystallogr.，17，781(1964))；△f'和△f"的值为Creagh和McAuley的值。(Creagh，D.C.&McAuley，W.J.；“International Tables forCrystallography(国际晶体学表)”，C卷，(A.J.C.Wilson编辑)，Kluwer AcademicPublishers，Boston，表4.2.6.8，第219-222页(1992))。质量衰减系数的值为Creagh和Hubbell的值。(Creagh，D.C.&Hubbell，J.H..；“International Tables forCrystallography(国际晶体学表)”，C卷，(A.J.C.Wilson编辑)，Kluwer AcademicPublishers，Boston，表4.2.4.3，第200-206页(1992))。除修正之外，所有计算均使用CrystalStructure晶体学软件包进行，所述修正使用SHELXL Version 2014/7进行。(CrystalStructure 4.2：晶体结构分析包，Rigaku Corporation(2000-2015).Tokyo 196-8666，日本；SHELXL Version 2014/7：Sheldrick，G.M.(2008).Acta Cryst.A64，112-122)。

晶体数据、强度测定以及结构解析和修正如下所示：

A.晶体数据

B.强度测定

C.结构解析和修正

[化合物100的¹H-NMR数据]

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ8.25(s,1H),8.15(s,1H),7.40(s,1H),5.85(d,1H),5.45(d,1H),4.25(m,2H),4.05(m,1H),3.85(m,1H),3.6(m,2H),3.4(m,4H),2.90(m,4H),2.60(d,6H),1.8(s,3H).

在本申请中提及的所有文献，均通过引用结合到本文中。如果所结合的文献与本文件有任何不一致之处，以本文件为准。

序列表

<110> 卫材R&D管理有限公司.

H·W·蔡

远藤笃史

F·方

M·山

罗伯特·T·禹

<120> 用于制备均一低聚物的手性试剂

<130> 0080171-000258

<150> US 62/201,510

<151> 2015-08-05

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 制备用于解链温度分析的互补RNA序列

<400> 1

uuccuugaug uuggag 16

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于合成的测试序列，包含非天然键合和非标准吗啉环

<400> 2

ctccaacatc aaggaa 16