表达禽传染性支气管炎病毒s蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用

文档序号：62665 发布日期：2021-10-01 浏览：37次 >En<

阅读说明：本技术 表达禽传染性支气管炎病毒s蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用 (Recombinant Newcastle disease vector vaccine for expressing avian infectious bronchitis virus S protein, preparation method and application ) 是由潘兹书许路来温国元于 2021-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,尤其涉及表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用。本发明采用反向遗传操作技术将编码IBV S蛋白基因以不同形式插入热稳定新城疫疫苗毒株(rTS09-C)基因组,构建筛选获得表达IBV三种形式S蛋白的重组热稳定新城疫载体疫苗毒株,及表达一种优化形式S蛋白与N蛋白T细胞表位保守肽段的重组新城疫载体疫苗毒株。所构建的四株表达IBV抗原蛋白重组热稳定新城疫载体疫苗毒株均具有耐热、低毒和遗传特性稳定特征；重组新城疫载体疫苗免疫接种能诱导鸡体产生特异性免疫应答和抗NDV和IBV强毒株致死攻毒感染的免疫保护。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly relates to a recombinant Newcastle disease vector vaccine for expressing avian infectious bronchitis virus S protein, a preparation method and application. The invention adopts reverse genetic operation technology to insert the coding IBV S protein gene into the genome of the heat-stable Newcastle disease vaccine strain (rTS09-C) in different forms, and constructs and screens the recombinant heat-stable Newcastle disease vector vaccine strain expressing the IBV S proteins in three forms and the recombinant Newcastle disease vector vaccine strain expressing an optimized S protein and N protein T cell epitope conserved peptide segment. The four constructed recombinant heat-stable Newcastle disease vector vaccine strains expressing the IBV antigen protein have the characteristics of heat resistance, low toxicity and stable genetic characteristics; the recombinant Newcastle disease vector vaccine immunization can induce chickens to generate specific immune response and immune protection against lethal challenge infection of NDV and IBV virulent strains.)

表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物

技术领域

，尤其涉及表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用。

背景技术

目前，对禽类养殖业危害最为严重的两类疫病是新城疫(Newcastle disease,ND)与高致病性禽流感(high pathogenic avian influenza,HPAI)。此外，由于鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)的影响范围也逐渐扩大，近年来引起人们对该禽类病毒的高度关注。新城疫、高致病性禽流感和鸡传染性支气管炎分别是由新城疫病毒(Newcatledisease virus,NDV)、高致病性禽流感病毒(high pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)感染禽类引起的烈性传染性疫病。

新城疫(ND)是一种多禽类发生的、急性的、高接触性且高死亡率的疫病。ND的爆发往往对家禽养殖业造成巨大的经济损失。目前，ND的防控主要为免疫预防。新城疫病毒(NDV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)。该病毒具有囊膜结构，且囊膜表面有纤突；NDV的基因组为单股负链RNA，长约为15kb。由于NDV能够有效地诱导机体产生强烈的免疫应答，可通过反向遗传学的方法对其改造，并将其设计构建为疫苗载体。作为一种新型疫苗，新城疫病毒载体疫苗与传统疫苗相比，具有诸多优势及良好的应用前景，是当今和未来疫苗研究开发的重要研究方案之一。

传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)感染导致禽类的急性高度接触传染性疾病，通常会引起家禽的肾脏及呼吸道损伤，给家禽养殖业造成巨大损失。纤突蛋白(Spike protein,S)是传染性支气管炎病毒的最重要的结构蛋白，构成病毒纤突。S蛋白包含S1和S2两个亚基，均属于糖蛋白，其中，S1蛋白对病毒毒力、组织嗜性和血清型起到决定性作用，并能够诱导宿主产生体液及细胞免疫应答，在载体疫苗和亚单位疫苗的研究中具有重要意义。

传染性支气管炎病毒包含多种血清型，不同血清型间不具有交叉保护效果，因此，设计一种能够诱导对多种血清型IBV毒株产生保护作用的疫苗在IBV疫苗研发中具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用，目的在于解决现有技术中的问题或至少解决现有技术中的一部分问题。

本申请采用反向遗传操作技术策略将传染性支气管炎病毒S蛋白以不同形式插入热稳定新城疫疫苗株基因组，构建筛选获得四株重组新城疫载体疫苗毒株。重组载体疫苗病毒特性研究证实，所构建的四株均具有耐热、低毒、遗传稳定和高效表达外源抗原蛋白；SPF鸡免疫与感染实验证实，四株重组新城疫载体疫苗免疫均能诱导产生特异性免疫应答和抗NDV和IBV强毒株感染的免疫保护。重要的是，将IBV的tS1与N蛋白包含T细胞表位的肽段融合表达能显著增强rTS-tS1/Nd毒株诱导的IBV特异性细胞免疫应答水平和提供免疫鸡针对IBV强毒株攻毒感染的免疫保护。本申请的研究技术为发展基于热稳定新城疫疫苗株为载体的重组新城疫载体双价或多价疫苗提供了新思路和有益借鉴。

本发明是这样实现的，表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗的制备方法，其特征在于：以新城疫热稳定疫苗rTS09-C株为材料，通过反向遗传操作将传染性支气管炎病毒S蛋白插入rTS09-C基因组的P和M基因之间，拯救获得重组新城疫载体疫苗；

所述传染性支气管炎病毒S蛋白为如SEQ ID NO.1所示的完整的S蛋白，或如SEQID NO.2所示的S1蛋白，或如SEQ ID NO.3所示的tS1蛋白，或如SEQ ID NO.4所示的tS1/Nd蛋白。

进一步地，利用引物对载体质粒pTS09-C进行扩增，得到线性化后的目的载体片段；

利用引物序列分别扩增SEQ ID NO.1-3和SEQ ID NO.5所示的序列得到S、S1、tS1和Nd片段；将tS1片段和Nd片段通过重叠延伸的方式连接，组成tS1/Nd片段；

分别连接目的片段和载体，得到质粒pTS-S、pTS-S1、pTS-tS1和pTS-tS1/Nd；

经过病毒拯救，分别得到重组新城疫载体疫苗rTS-S、rTS-S1、rTS-tS1和rTS-tS1/Nd。

进一步地，利用如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示的引物序列对载体质粒pTS09-C进行扩增。

进一步地，利用如SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.13所示的引物序列分别扩增得到S、S1、tS1和Nd片段。

进一步地，使用同源重组酶In-fusion酶连接目的片段和载体。

本发明还提供了利用上述的表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗的制备方法制备的重组新城疫载体疫苗。

本发明还提供了如上述的重组新城疫载体疫苗在制备诱导机体产生针对新城疫病毒和/或传染性支气管炎病毒的特异性免疫应答功能的试剂中的应用。

进一步地，所述特异性免疫应答包括诱导机体产生相应抗体。

进一步地，所述特异性免疫应答包括调控机体IFN-γ的含量。

本发明对IBV的S蛋白进行了一定的修饰，修饰方式包括截断选用S1蛋白、将信号肽替换为tPA信号肽、添加Nd肽段。利用反向遗传操作技术将修饰后的S基因及S1基因等插入了之前设计好的新城疫疫苗rTS09-C株骨架中，通过RT-PCR及透视电镜等技术证明，本申请成功拯救了重组病毒，且重组病毒能够稳定表达插入的外源片段，相关病毒特性实验验证表明，重组病毒具有与亲本株相似的低毒、热稳定的病毒特性。

根据免疫及攻毒实验的结果来看，重组新城疫载体疫苗能够对两种病毒的强毒株攻毒产生100％的保护效果，此外，四种重组新城疫载体疫苗均能够减少两种病毒的排毒，并降低传染性支气管炎病毒对鸡气管的损伤。

本申请中将Nd片段接入S1蛋白中。分离到免疫后的鸡脾脏，使用IBV灭活病毒特异性刺激，检测不同分组中接受刺激后的脾淋巴细胞培养物上清中INF-γ，结果显示，rTS-tS1/Nd组能够产生最高水平的INF-γ，由此可见，在插入的外源片段中增加Nd肽段后，能够引起更高水平的细胞免疫应答，从而提高保护效率，甚至能够在异源传染性支气管炎病毒攻毒中提供保护。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本申请成功构建了表达IBV S蛋白、S1蛋白、替换tPA信号肽的S1蛋白(tS1)和tS与N蛋白抗原区(Nd)融合的四株重组新城疫载体疫苗毒株(rTS-S、rTS-S1、rTS-tS1和rTS-tS1/Nd)。四株重组载体疫苗毒株在BHK-21细胞和DF-1细胞中均能表达IBV的S、S1、tS1蛋白和tS1/Nd融合蛋白；这些重组载体疫苗病毒均能在鸡胚上有效扩增，血凝效价均大于2^8.5，MDT均大于168h，ICPI均为0，表明重组病毒鸡胚增殖能力和毒力无明显变化。56℃处理30min后，均能保持血凝活性和感染能力，具有较好的热稳定性。本申请通过基因工程构建热稳定疫苗，热稳定疫苗不需要冷链运输，能室温保存。本申请构建的重组载体疫苗病毒连续传代30代后，插入的外源片段的序列没有突变和缺失，表明重组病毒基因组遗传特性稳定。

使用SPF级白羽鸡评价了四株重组新城疫载体疫苗接种诱导的免疫应答和抗感染免疫效力。结果显示，四株重组新城疫载体疫苗接种均能有效诱导机体产生针对新城疫病毒及传染性支气管炎病毒的特异性免疫应答。新城疫病毒血凝抑制抗体效价为2⁶，传染性支气管炎病毒中和抗体效价均大于2⁶。细胞因子检测结果显示，接种rTS-S、rTS-S1、rTS-tS1及rTS-tS1/Nd的鸡脾细胞经IBV刺激后，细胞培养上清中均存在IFN-γ。其中，rTS-tS1/Nd免疫组IFN-γ浓度显著高于rTS-S、rTS-S1和rTS-tS1免疫组，表明将IBV的tS1与Nd融合能诱导显著增强的IBV特异性细胞免疫应答。四株重组新城疫载体疫苗免疫均能提供免疫鸡抵抗NDV和IBV致死攻毒感染的免疫保护，缩短攻毒感染鸡的排毒时间并降低排毒量。

附图说明

图1是S蛋白信号肽序列预测结果；

图2是四种重组新城疫载体疫苗构建策略；

图3是重组载体疫苗感染性cDNA克隆质粒菌落PCR鉴定；A，pTS-S菌落PCR产物；B，pTS-S1菌落PCR产物；C，pTS-tS1菌落PCR产物；D，pTS-tS1/Nd菌落PCR产物；

图4是重组载体疫苗感染性cDNA克隆质粒的酶切鉴定；1，pTS-S质粒使用BamH I酶切处理后；2，pTS-S1质粒使用BamH I酶切处理后；3，pTS-tS1质粒使用BamH I酶切处理后4，pTS-tS1/Nd质粒使用BamH I酶切处理后；

图5是拯救重组载体疫苗毒株的RT-PCR检测；1，未感染的尿囊液；2，rTS-S病毒感染尿囊液；3，rTS-S1病毒感染尿囊液；4，rTS-tS1病毒感染尿囊液；5，rTS-tS1/Nd病毒感染尿囊液；

图6是重组载体疫苗病毒的生长曲线及热稳定实验；A，重组新城疫载体疫苗DF-1细胞生长曲线结果；B,C，四株重组病毒及LaSota株、rTS09-C株热稳定实验；

图7是第30代载体疫苗病毒RT-PCR检测；1，DF-1细胞空白对照；2，30代rTS-S插入外源片段；3，30代rTS-S1插入外源片段；4，30代rTS-tS1插入外源片段；5，30代rTS-tS1/Nd插入外源片段；6，阳性对照；

图8是纯化后重组载体疫苗病毒的电镜观察；A，rTS09-C株病毒粒子；B，rTS-S株病毒粒子；C，rTS-S1株病毒粒子；D，rTS-tS1株病毒粒子；E，rTS-tS1/Nd株病毒粒子；箭头位置即为重组病毒颗粒；

图9是重组新城疫载体疫苗中S1蛋白及HN蛋白表达的Western blot检测鉴定；

图10是重组新城疫载体疫苗感染DF-1细胞后细胞间接免疫荧光染色检测鉴定；

图11是重组新城疫载体疫苗免疫鸡后引起的体液免疫应答；通过滴鼻、点眼途径，将10⁶TCID₅₀的三种新城疫病毒接种到两周龄的白羽鸡中，间隔两周后以相同剂量和途径加强免疫一次，加强免疫两周后检测鸡血清抗体效价。A，为免疫后鸡新城疫病毒血清血凝抑制抗体效价；B，为免疫后传染性支气管炎病毒中和抗体效价；C，为使用新城疫病毒HN蛋白包被检测的鸡血清新城疫病毒IgG抗体效价；D，为使用传染性支气管炎病毒S1蛋白包被检测的鸡血清传染性支气管炎病毒IgG抗体效价；

图12是新城疫载体疫苗接种鸡体针对IBV特异性细胞免疫应答产生IFN-γ的浓度；

图13是新城疫载体疫苗接种鸡抵抗新城疫病毒强毒株F48E9及传染性支气管炎病毒强毒株QX-like株致死攻毒感染的保护效力。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫载体疫苗、制备方法及应用。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S基因的修饰与表达不同形式S蛋白及融合Nd肽段重组NDV感染性cDNA克隆的构建策略

传染性支气管炎病毒IBV QX-like株S基因全长共计3,471bp，其中编码区编码了1156个氨基酸。成熟后的S蛋白由其前体裂解产生的S1亚基和S2亚基组成，其中，S1蛋白包含554个氨基酸，大小约为60.7ku，S2蛋白包含606个氨基酸，大小约为66.6ku。

在本申请中，通过对S蛋白进行信号肽分析，结果如图1中显示，S蛋白N端20个氨基酸为S蛋白的信号肽序列，设计并合成引物，分别扩增S蛋白序列，分别为S蛋白全长，S1蛋白全长和去掉S蛋白原本信号肽的S1蛋白，通过PCR，我们在去掉S蛋白原本信号肽的基础上，添加了组织纤溶酶原激活物(Tissue plasminogen activator，tPA)信号肽序列，该信号肽能够促进蛋白的分泌表达，使用tPA信号肽替换掉原先S蛋白信号肽有可能增强其免疫原性，从而提高疫苗保护效率。

除S蛋白外，IBV的N蛋白也能激活宿主的细胞免疫应答，产生特异性的CTL反应。N蛋白中能够引起细胞免疫应答的主要抗原区位于羧基端的120个氨基酸。与S蛋白相比，N蛋白保守程度更高，尤其是其羧基端功能区，据此，我们将N蛋白羧基端120个氨基酸与S1蛋白相连，并保留S蛋白裂解位点，确保S1蛋白与N蛋白能正常裂解，以此来增强重组病毒的免疫原性，并提供对IBV不同血清型的光谱免疫效果。

基于上述分析，我们分别设计了四株重组新城疫载体疫苗，具体设计方案如图2中所示，分别命名为rTS-S、rTS-S1、rTS-tS1和rTS-tS1/Nd，其中rTS-S和rTS-S1分别插入了完整的S蛋白和S1蛋白；rTS-tS1在rTS-S1病毒的基础上，将S1蛋白信号肽替换为tPA信号肽，来提高S1蛋白的分泌性表达；rTS-tS1/Nd病毒则在rTS-tS1的基础上，补充一段Nd肽段。

实施例2四株重组新城疫载体疫苗感染性cDNA克隆质粒构建

根据pTS09-C的基因序列设计引物，将整个质粒从NDV的M基因开始反向扩增全长，并分别在其上游引物5’端及下游引物5’端添加插入基因的15-25bp的同源臂，同样将外源插入片段S、S1、tS1和tS1/Nd使用含有同源臂的引物扩增，分别构建质粒pTS-S、pTS-S1、pTS-tS1和pTS-tS1/Nd，具体序列见表1。

表1构建质粒pTS-S、pTS-S1、pTS-tS1和pTS-tS1/Nd所使用的引物

使用pTS09-C质粒，利用高保真酶和对应的引物进行PCR扩增，得到线性化后的目的载体片段，大小为17,000bp左右，符合预期。同时，使用实验保存IBV疫苗株(Infectiousbronchitis virus isolate YX10 D90 vaccine)提取RNA，RT-PCR扩增S基因和Nd基因，并使用相应引物将目的片段扩增备用，得到S、S1、tS1和Nd片段，大小分别为3525bp、1721bp、1670bp和366bp。

RT-PCR反应体系如下：

2.配制好逆转录体系后，将其充分混匀，42℃延伸60min，95℃处理5至10min，灭活逆转录酶，将cDNA置于4℃冰箱保存，RNA置于-80℃保存。

将tS1片段和Nd片段通过重叠延伸的方式连接，组成tS1/Nd片段，分别将载体、S、S1、tS1和tS1/Nd片端回收，利用Dpn I酶切处理，去除回收产物中的质粒。

使用同源重组酶(In-fusion酶)参照TaKaRa公司的In-Fusion HD Cloning Kits克隆试剂盒操作，连接目的片段和载体，构建重组病毒感染性克隆质粒，并分别命名为pTS-S、pTS-S1、pTS-tS1和pTS-tS1/Nd。转化后进行菌落PCR鉴定，结果如图3。

将挑选出的阳性克隆使用限制性内切酶BamH I酶切，进行新城疫病毒基因组的骨架鉴定，酶切结果如图4中所示。

其中，pTS-S中包含S基因片段部分为约6,500bp，而在pTS-S1和pTS-tS1中该部分长度约为4,500bp；pTS-tS1/Nd中该片段略大于pTS-tS1，约为4,800bp。电泳结果与预期相符，表明病毒基因组骨架鉴定正确。为进一步验证插入外源片段是否正确，我们对插入的外源片段部分进行测序，结果表明，pTS-S、pTS-S1、pTS-tS1和pTS-tS1/Nd质粒均构建正确，外源片段均无突变。

将鉴定无误的pTS-S、pTS-S1、pTS-tS1和pTS-tS1/Nd质粒进行转化并保菌，用于后续实验。

实施例3四株重组新城疫载体疫苗病毒的拯救及鉴定

将转染所需的辅助质粒和重组pTS-S、pTS-S1、pTS-tS1和pTS-tS1/Nd质粒分别转化E.Coli DH5α后捈布含抗性的LB琼脂平板，37℃培养过夜，挑选阳性菌落接种LB液体培养基摇菌后，使用去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，用于后续转染实验。

将BHK-21细胞接入6孔板中，培养12h后，使用表达T7 RNA聚合酶的痘病毒感染2h后进行转染；使用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine 3000试剂，将重组pTS-S、pTS-S1、pTS-tS1和pTS-tS1/Nd质粒分别与辅助质粒混匀，确保DNA总量为2μg，然后将其加入Opti-MEM培养基中，并添加P3000^TM试剂，充分混匀；将DNA与Lipofectamine 3000混匀，室温静置10分钟后，将其滴加到BHK-21细胞单层中，于37℃CO₂培养箱孵育4-6h，吸去转染混合液，加含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液继续培养2-4天后，将细胞反复冻融，离心后吸取培养物上清。将上清接种到9至11日龄的鸡胚中，感染3至4天后收取尿囊液，并分别检测血凝效价，结果表明，rTS-S、rTS-S1、rTS-tS1和rTS-tS1/Nd病毒的HA效价分别为2¹、2³、2²和2²。吸取200μl病毒尿囊液用于抽提病毒RNA，扩增目的片段后，进行测序鉴定。测序结果显示，外源插入片段均正确无误。重组病毒的RT-PCR检测结果如图5所示。

将鉴定正确的重组病毒尿囊液分别进行梯度稀释后，连续接种与9至11日龄的鸡胚中，进行病毒扩增，连续传代2-3次后，收集尿囊液检测病毒血凝效价，并将其分装保存。

实施例4四株重组新城疫载体疫苗毒株的病毒特性研究

病毒拯救成功后，我们从生长曲线、热稳定特性及病毒毒力等方面对重组病毒的生物学特性进行了相关研究。

首先将4种病毒分别接种至鸡成纤维细胞系(DF-1)，连续传代，传至第10代后，分别以MOI＝0.1的剂量接种至单层DF-1细胞中，选择接种24h，48h和72h后，分别收取四种病毒感染上清，检测其TCID50，并重复3次后，根据结果绘制病毒生长曲线，结果表明，与亲本株相比四株重组病毒滴度均略有下降。

将重组病毒在鸡胚上连续传代5次后，分别检测其热稳定特性，并添加亲本株rTS09-C及不热稳定株LaSota株作为对照组，56℃热处理不同时间点后，分别检测病毒感染能力及血凝效价。实验结果显示，不热稳定株LaSota株在56℃处理10分钟后，基本失去血凝和感染能力，rTS09-C株及四株重组新城疫载体疫苗仍能较好的保持血凝活性和感染能力，结果显示，重组病毒能够良好的继承亲本株的热稳定特性。重组病毒生长曲线及热稳定实验结果如图6所示。

将四株重组病毒通过MDT和ICPI的检测确定其病毒毒力变化，结果显示：四株重组病毒的MDT均大于168h，且ICPI指数均为0。

将四株重组病毒分别接种至9日龄鸡胚中，感染60h后收集病毒病检测其EID₅₀。结果显示，鸡胚中病毒含量分别如下：rTS-S为10^8.5EID₅₀/ml、rTS-S1为10^9.0EID₅₀/ml、rTS-tS1为10^9.0EID₅₀/ml和rTS-tS1/Nd为10^8.5EID₅₀/ml，亲本株rTS09-C株为10^9.5EID₅₀/ml，具体结果如下表所示。

表2重组新城疫载体疫苗的致病性及鸡胚病毒含量

*MDT(鸡胚致死时间检测)使用10日龄鸡胚

**ICPI(颅内致死指数)使用1日龄实验鸡

分别将四株重组病毒连续在DF-1细胞上传代30代后，抽提病毒基因组RNA，逆转录后扩增病毒插入的外源片段，结果呈阳性，表明四株病毒具有良好的遗传稳定性，插入的外源片段不易丢失。30代病毒RT-PCR检测如图7所示。

经蔗糖梯度超速离心后收集样品负染后进行电镜观察，将样品放大10,000倍后，能够清晰的观察到病毒颗粒，该病毒形态为不规则的近似圆形，大小不完全一致，能够观察到位于病毒表层的囊膜，重组病毒与新城疫病毒形态特性相符，可以从形态学角度证明，重组病毒拯救成功。纯化后重组病毒的电镜观察结果如图8所示。

实施例5四株重组新城疫载体疫苗毒株的S蛋白的表达分析

将重组病毒分别以MOI＝1接入单层DF-1细胞中，感染2h后换液，换为添加了TPCK胰酶的含2％血清的HDMEM培养，感染48h后，将细胞置于-80℃中，反复冻融3次以上，收集样品，制样后，利用Western Blot分析，分别使用S1蛋白、HN蛋白和Nd肽段抗体孵育，检测样品中各种蛋白的表达。

从图9中可以看出，四株重组病毒均能检测到S1蛋白及HN蛋白，但是仅在rTS-tS1/Nd中能够检测到Nd肽段的表达，四株重组病毒均能正常表达插入的外源蛋白。四株重组病毒中，HN蛋白的表达量差异不大，表明重组病毒感染48h后，四株病毒扩增效率比较接近；从S1蛋白的表达水平来看，rTS-S1株及rTS-S株病毒S1蛋白表达量相对较低，rTS-tS1/Nd及rTS-S1株S1蛋白表达量相对较大；根据Nd肽段的表达来看，仅在rTS-tS1/Nd组中存在条带，大小约为13Ku，表达量相对较低。

细胞免疫荧光的结果也验证外源蛋白的表达，将四种重组病毒及亲本株rTS09-C株以MOI＝1感染DF-1细胞，2h后换液，使用添加了TPCK胰酶的含2％血清的HDMEM培养基，48h后除去细胞上清培养基，使用固定液固定，封闭后，分别使用S1蛋白兔多抗和HN蛋白鸡多抗孵育1h，再分别使用Alexa 594标记的羊抗兔IgG抗体和FITC标记的羊抗鸡IgG抗体孵育，最后使用DPAI染色细胞核，结果图10。该结果表明，四株重组病毒，均能在DF-1细胞中表达外源蛋白S1，且表达后的S1蛋白主要存在于细胞质中。

实施例6四株重组新城疫载体疫苗毒株的毒力、诱导鸡体的免疫应答和抗两种致死感染的保护效力

将四株重组病毒分别免疫两周龄SPF白羽鸡，检测其免疫后鸡体病毒应答水平，并进行攻毒实验，检测其保护效率。免疫途径为滴鼻点眼，使用相同剂量(10⁶EID₅₀/只)的重组病毒，免疫出壳两周后的白羽鸡，免疫两次，间隔时间为两周，使用PBS免疫组作为阴性对照，加强免疫两周后，使用致死剂量的新城疫病毒强毒株F48E9和传染性支气管炎病毒强毒株QX-like株攻毒，检测保护效率。

为评估重组新城疫载体疫苗在鸡体中诱导的体液免疫反应，我们在加强免疫结束后，对各组实验鸡进行取血，通过ELISA和中和抗体方式，检测其ELISA抗体和中和抗体水平，结果如图11中所示，其中，新城疫病毒中和抗体采用血凝抑制抗体效价表示，传染性支气管炎病毒使用中和抗体效价表示。

在加强免疫结束后，每组选5只实验鸡，分别解剖并取出脾脏，按照鸡脾淋巴细胞分离试剂盒说明书介绍步骤，分离鸡脾淋巴细胞，制备细胞悬液加入6孔板中，在热灭活的IBV全病毒的刺激下进行体外培养，通过ELISA方法检测脾淋巴细胞培养液上清中IFN-γ的含量。

鸡体针对IBV特异性细胞免疫应答结果如图12所示。结果表明，接种rTS-S、rTS-S1、rTS-tS1及rTS-tS1/Nd疫苗的鸡脾细胞经IBV刺激后，培养上清液中IFN-γ的水平显著高于PBS组及接种rTS09-C株，且rTS-tS1/Nd组显著高于其他三组，表明表达Nd肽段能够引起鸡体更高水平的细胞免疫应答。

新城疫病毒强毒株F48E9及传染性支气管炎病毒强毒株QX-like株攻毒实验结果如图13所示。免疫后的实验鸡分别接种10MLD 50的新城疫病毒强毒株F48E9和传染性支气管炎病毒QX-like株强毒株，进行攻毒实验，结果显示，重组新城疫载体疫苗均能够对两种病毒致死剂量攻毒提供完全保护。

表3鸡攻毒后病毒排毒情况

其中，新城疫病毒强毒株攻毒后，接种rTS09-C及rTS-S、rTS-S1、rTS-tS1和rTS-tS1/Nd疫苗组均无发病症状，PBS组实验鸡在攻毒后3天内均出现感染症状，包括精神萎靡、厌食、羽毛杂乱等，且均在5日内死亡。使用传染性支气管炎病毒强毒株攻毒后，rTS-S、rTS-S1、rTS-tS1、rTS-tS1/Nd组存活率均为100％，其中rTS-S组及rTS-tS1/Nd部分使用鸡出现轻微症状，其余组实验鸡均无明显感染症状。而PBS组及rTS09-C组实验鸡均于10日内死亡，且在3日后，均有明显感染症状出现，如喷嚏、鼻涕、羽毛杂乱、饮水减少等。此外，根据攻毒后3日、5日及7日的肛拭子检测，结果显示，新城疫病毒及传染性支气管炎病毒攻毒后7日内，重组载体疫苗rTS-S、rTS-S1、rTS-tS1、rTS-tS1/Nd接种组实验鸡均能显著降低病毒排毒。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 表达禽传染性支气管炎病毒S蛋白重组新城疫疫苗、制备方法及应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3524

<212> DNA

<213> 传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus)

<400> 1

aagcttgcca ccatgctggg caaaagcctg ttcctggtga ccattctgtg cgcgctgtgt 60

tctgcaaacc tgttcgatag cgccaacaac tacgtttact actaccagtc tgcgtttcgt 120

ccgccgaacg gctggcacct gcagggtggt gcgtacgccg tagttaactc tacgaactac 180

actaacaacg cgggttccgc gtctggttgt accatcggcg tgattaaaga tgtctataac 240

caatccgcag ccagcatcgc catgaccgct ccgccgcagg gcatggcttg gtctaaaagc 300

cagttctgca gcgcgcattg taatttttcc gaaatcaccg ttttcgtgac tcactgctac 360

agcagcggcg ctggctcctg cccgatcacc gggatgatcg ctcgtgacca catccgcatc 420

agtgcgatga aaaacggttc tctgttctat aacctgaccg tttctgtatc taaatacccg 480

acctttaaat ccttccagtg cgtgaacaac agcacctctg tttatctgaa cggtgacctg 540

gtttttactt ccaacaaaac cgctgacgtt acttctgctg gtgtttacta caaagcgggc 600

ggtccggtaa actattctgt gatgaaagag tttaaagttc tggcttattt cgttaacggc 660

accgcgcagg atgtgattct gtgcgataac tccccgaaag gcctgctggc ctgccaatat 720

aacacgggta atttctctga cggtttctac ccattcacga acagcaccct ggttcgcgat 780

aaattcatcg tttaccgtga atccagcgtt aacaccaccc tgaccctgac caacttcacc 840

tttaccaacg tgtctaccgc tcagccgaac tctggtggtg tgtctacttt ccacctgtac 900

cagacccaga ccgcacagtc tggttactat aacttcaatc tgtccttctt gtctcagttc 960

gtgtataaag catctgattt catgtatggt tcctaccacc cgcgttgctc gttccgtccg 1020

gaaaccatca actctggtct gtggttcaat agcctgagcg tgagtctgac ctatggcccg 1080

ctgcagggcg gttgcaaaca gtccgtcttt aacggtaaag caacctgttg ctatgcatat 1140

agctacaacg gtccgcgtgc gtgcaaaggc gtgtacagcg gcgaactgag caaaaccttc 1200

gaatgtggtc tgctggttta tgttaccaaa tccgacggct cccgtatcca gacgcgtacc 1260

gaaccgctcg ttctgatgca gcataattac aacaacatca ccttagataa atgcgtcgat 1320

tataatatct atggccgcgt tggtcaaggt ttcattacca acgtgactga cagcgcagct 1380

aacttctctt atctggcaga tggcggcctg gcaattctgg acacctctgg tgcgatcgac 1440

gtgttcgtgg ttcagggctc ttacggtttc aactactata aggtgaaccc atgtgaagat 1500

gtaaaccaac agtttgttgt gtctggtggc aacattgttg gtatcctgac ctctcgtaac 1560

gaaaccggtt ccgaacaggt ggaaaaccag ttttatgtga aactgaccaa ctcctcccac 1620

cgccgccgtc gtagcatcgg tcagaacgtg acgagctgct cgtatgtttc ttatggccgc 1680

ttctgtattg aaccggatgg ttctctgaaa atgattgttc cggaagaact gaaacagttc 1740

gttgcaccgc tgctgaacat taccgaaagc gtactcatcc cgaacagctt taacctgacc 1800

gtaacggatg aatatatcca gacccgcatg gataaagtgc agattaactg cctgcagtac 1860

gtttgcggta actctctgga atgtcgcaaa ctgttccagc agtatggccc tgtttgcgac 1920

aacatcctga gcgttgttaa ctccgtaggt cagaaagaag acatggaact gttgtctttt 1980

tacagcagca ccaaaccggc tggctataac gctccggtgt ttagcaacat ttcaaccggt 2040

gacttcaaca tctctctgct gctgacccct ccttcttccc cgcgtggccg ttccttcatt 2100

gaggatctgc tgttcacctc tgtggaaact gttggtctgc cgactgacgc ggaatacaaa 2160

aaatgcaccg caggcccgct gggcaccctg aaagacctga tttgcgcgcg tgaatataac 2220

ggcctgctgg ttctgccgcc gatcattact gcagatatgc agactatgta cactgctagc 2280

ctggtgggcg cgatggcgtt cggtggtatc actgcagcgg gcgcgatccc gttcgctacc 2340

cagatccaag cgcgcattaa ccatctgggt attacccagt ctctgcttct gaaaaaccag 2400

gagaaaatcg ctgctagctt taataaagct atcggccata tgcaggaagg ttttcgtagc 2460

acgtcattgg cgctgcagca ggtgcaggac gttgttaata aacagtccgc catcctgact 2520

gaaacgatga actccctgaa caaaaacttt ggcgccattt cttcggttat tcaggatatc 2580

tatgcgcagt tagacgccat ccaggcggat gcacaggttg atcgtctgat caccggtcgc 2640

ctgtctagcc tgagtgtact ggcgttcgct aaacagtccg aatacatccg tgtaagccag 2700

cagcgcgaac tcgcgaccca gaaaatcaac gaatgtgtga aatcccagtc gaaccgttac 2760

ggcttctgtg gtagcggtcg ccacgtgctg agcattccgc agaacgcgcc gaacggcatc 2820

gtgtttatcc actttagtta tacgccggaa agctttgtga acgtgactgc gatcgtgggt 2880

ttctgtgtac agccggcgaa cgccagccag tacgcgattg tgccggtaaa cggtcgcggt 2940

attttcatcc aggttaacgg cagctactac atcactgccc gtgacatgta catgccgcgt 3000

gatatcactg cgggcgacat tgtgaccctg acctcttgcc aggcaaacta cgttaacgtt 3060

aacaaaactg tgatcaccac cttcgtggaa gatgatgatt ttgattttga ttacgaatta 3120

tctaaatggt ggaacgatac caaacatgaa ctgccggatt tcgatgattt taattacacc 3180

gttccgatcc tgaacatttc tggtgaaatt gaccacatcc agggtgtgat ccagggcctg 3240

aacgatagcc tgatcaatct ggaagagctg tctatcctga aaacctacat taaatggccg 3300

tggtacgttt ggctggcgat tggtttcgcg attatcatct tcatcctgat tctgggctgg 3360

gtgttcttca tgaccggctg ctgtggctgc tgttgcggct gctttggcat catcccgctg 3420

atgagcaaat gcggcaaaaa atctagctac tacaccacct ttgataacga tgttgttacc 3480

taataataat taagaaaaaa tacgggtaga atcggagtgc cccg 3524

<210> 2

<211> 1720

<212> DNA

<213> 传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus)

<400> 2