从玉米中分离的siz1蛋白及其编码基因和在品种改良中的应用
阅读说明：本技术 从玉米中分离的siz1蛋白及其编码基因和在品种改良中的应用 (SIZ1 protein separated from corn, coding gene thereof and application thereof in variety improvement ) 是由 王海洋 廖新阳 孙娟 赵永平 李全权 赵斌斌 王宝宝 于 2021-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了从玉米中分离的SIZ1蛋白及其编码基因和它们在品种改良中的应用。本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术敲除玉米中ZmSIZ1a和ZmSIZ1b基因筛选得到两个突变体材料,因基因ZmSIZ1a和ZmSIZ1b功能异常,导致植株体内蛋白发生SUMO化修饰的能力严重受损。与野生型植株相比,突变体植株在热胁迫条件下全局性SUMO化修饰能力严重受损；同时,突变体籽粒在实验室条件和田间条件下均表现出易感穗粒腐病的表型,表明ZmSIZ1a和ZmSIZ1b蛋白对玉米蛋白发生SUMO化修饰及玉米抗穗粒腐病起着至关重要的调控作用,能够应用于调控玉米蛋白SUMO化修饰以及培育抗穗粒腐病玉米新品种。(The invention discloses SIZ1 protein separated from corn, a coding gene thereof and application of the SIZ1 protein and the coding gene in variety improvement. According to the invention, two mutant materials are obtained by screening ZmSIZ1a and ZmSIZ1b genes in the corn knockout by using CRISPR/Cas9 transgenic technology, and the SUMO modification capability of the protein in a plant body is seriously damaged due to the abnormal functions of the genes ZmSIZ1a and ZmSIZ1 b. Compared with wild plants, the mutant plants have seriously impaired global SUMO modification ability under heat stress conditions; meanwhile, mutant grains show a phenotype of susceptibility to the kernel rot of the maize in both laboratory conditions and field conditions, and the results show that the ZmSIZ1a and ZmSIZ1b proteins play a crucial role in regulation and control of SUMO modification of maize proteins and resistance to the kernel rot of the maize, and can be applied to regulation and control of SUMO modification of maize proteins and cultivation of new maize varieties with resistance to the kernel rot of the maize.)
技术领域
本发明涉及从玉米中分离的SIZ1蛋白及其编码基因和应用，尤其涉及从玉米中分离的ZmSIZ1a和ZmSIZ1b蛋白及其编码基因和它们在玉米穗粒腐病抗性改良或调控植株体内蛋白发生SUMO化修饰能力中的应用，属于ZmSIZ1a和ZmSIZ1b蛋白及其应用领域。
背景技术
玉米是中国三大粮食作物之一，在中国粮食安全保障体系中起到举足轻重的作用。玉米穗粒腐病是一种在世界范围内广泛存在、由真菌感染引起的玉米穗部病害，也是当前中国玉米生产中危害最严重的病害之一。该病害田间发病率在5％-20％之间，部分感病品种甚至能达到50％，对玉米产量造成了巨大损失(Ren JP(1993)Preliminary study inmaize ear rot.Maize Sci 1:75-79.)。然而，由于玉米穗粒腐病致病菌多样、发病受环境因素影响较大，导致其抗性机制复杂，严重阻碍了其抗性分子机制的研究和抗性基因的挖掘，进而严重制约了玉米高抗穗粒腐病新品种的选育。因此，挖掘玉米穗粒腐病抗性基因及解析其抗性分子机制对玉米穗粒腐病分子育种具有重要意义。
由于玉米穗粒腐病发病范围广、危害巨大，国内外研究人员从上世纪50年代起就开始对玉米遗传材料进行抗病性鉴定，并筛选得到一大批抗病种质资源。国内外多个课题组利用鉴定出的抗病种质资源对玉米穗粒腐病抗性基因进行了QTL定位研究。尽管研究人员鉴定到了分布在玉米10条染色体上的数十个QTL位点，但由于定位到的QTL所解释的表型变异普遍较低，玉米穗粒腐病抗性基因的克隆还是一项艰巨的任务。
为了提高穗粒腐病相关QTL定位的精度和效率，科学家们还利用多种经典的遗传群体以及全基因组关联分析(GWAS)的方法解析控制玉米穗粒腐病的遗传基础，挖掘玉米穗粒腐病抗性候选基因，并取得了一定成果。
类泛素化修饰(SUMOylation)是一种可逆的翻译后修饰，SUMO(small ubiquitin-like modifier)通过与目的蛋白的特定赖氨酸(K)位点结合来调控该蛋白的功能。与泛素化修饰(Ubiquitination)促进靶蛋白降解不同，SUMO化修饰主要参与调控目的蛋白的定位及其功能活性(Augustine RC and Vierstra RD(2018)SUMOylation:re-wiring theplant nucleus during stress and development.Curr Opin Plant Biol45:143-154.)。截止目前，大量研究表明SUMO化修饰广泛参与了植物生长发育和对非生物/生物胁迫应答的调控，在植物生命活动过程中发挥着重要的作用(Li Z,Hu Q,Zhou M,Vandenbrink J,LiD,Menchyk N,Reighard S,Norris A,Liu H and Sun D(2013)Heterologous expressionof OsSIZ1,a rice SUMO E3 ligase,enhances broad abiotic stress tolerance intransgenic creeping bentgrass.Plant Biotechnol J 11:432-445；Saleh A,WithersJ,Mohan R,Marques J,Gu Y,Yan S,Zavaliev R,Nomoto M,Tada Y and Dong X(2015)Posttranslational modifications of the master transcriptional regulator NPR1enable dynamic but tight control of plant immune responses.Cell Host Microbe18:169-182；Rosa TGM and Abreu AI(2019)Exploring the regulatory levels ofSUMOylation to increase crop productivity.Curr Opin Plant Biol49:43-51.)。SAPAND MIZ1 DOMAINCONTAINING LIGASE1(SIZ1)是植物E3 SUMO连接酶。它是类泛素化修饰过程中的重要辅助因子，参与调控了各种目的蛋白与SUMO结合，促进目的蛋白的SUMO化修饰(Augustine and Vierstra,2018)。SIZ1蛋白主要包含Scaffold Attachment Factor-A/B/Acinus-PIAS(SAP)，SIZ/PIAS-REALLY INTERSTING NEW GENE(SP-RING)，Plant HomeoDomain(PHD)和Proline-IsoleucineIsoleucine-Threonine(PIIT)等结构域。研究表明，拟南芥、水稻和番茄等植物中的SIZ1均广泛参与调控植物生长发育、抗逆及抗病等生物学过程(Augustine RC and Vierstra RD(2018)SUMOylation:re-wiring the plant nucleusduring stress and development.Curr Opin Plant Biol45:143-154.)，但玉米中的SIZ1基因及其功能尚未见报道。
发明内容
本发明的目的之一是从玉米中分离得到SIZ1蛋白及其编码基因；
本发明的目的之二是将从玉米中分离得到SIZ1蛋白及其编码基因应用于包括玉米穗粒腐病抗性改良、调控玉米SUMO化修饰等方面。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：
本发明首先提供了从玉米中分离得到ZmSIZ1a蛋白，该蛋白的氨基酸序列为(a)或(b)所示:
(a)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
(b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有植物E3 SUMO连接酶功能或活性的蛋白变体。
本发明还提供了从玉米中分离得到ZmSIZ1b蛋白，该蛋白的氨基酸序列为(a)或(b)所示:
(a)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；或
(b)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有植物E3 SUMO连接酶功能或活性的蛋白变体。
本发明进一步提供了ZmSIZ1a蛋白的编码基因，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：
(a)SEQ ID No.2所示的多核苷酸；或
(b)编码SEQ ID No.1所示氨基酸的多核苷酸；或
(c)与SEQ ID NO.2的多核苷酸的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸；或
(d)与SEQ ID No.2所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或
(e)在SEQ ID NO.2所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有植物E3 SUMO连接酶的功能或活性。
本发明更进一步提供了ZmSIZ1b蛋白的编码基因，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：
(a)SEQ ID No.4所示的多核苷酸；或
(b)编码SEQ ID No.3所示氨基酸的多核苷酸；或
(c)与SEQ ID NO.4的多核苷酸的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸；或
(d)与SEQ ID No.4所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或
(e)在SEQ ID NO.4所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有植物E3 SUMO连接酶的功能或活性。
另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的多核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。
本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域技术人员所了解。例如，可通过DNA的突变制备该氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。
“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示氨基酸序列的多核苷酸变体或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。
本发明还提供了含有所述ZmSIZ1a蛋白或ZmSIZ1b蛋白的编码基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。
本发明利用CRISPR/Cas9转基因技术敲除玉米中ZmSIZ1a基因和ZmSIZ1b基因筛选得到的Zmsiz1s-#1突变体材料和Zmsiz1s-#2突变体材料，因基因ZmSIZ1a和ZmSIZ1b功能异常，导致植株体内蛋白发生SUMO化修饰的能力严重受损。与野生型植株相比，突变体植株在热胁迫条件下全局性SUMO化修饰能力严重受损。同时，突变体籽粒在实验室条件和田间条件下均表现出易感穗粒腐病的表型，这表明ZmSIZ1a和ZmSIZ1b蛋白对玉米蛋白发生SUMO化修饰及玉米抗病性(抗穗粒腐病)起着至关重要的调控作用。
本发明进一步提供了ZmSIZ1a蛋白以及ZmSIZ1b蛋白的突变体，ZmSIZ1a蛋白的突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.24或SEQ ID No.25所示，其编码基因的核苷酸序列分别为SEQ ID No.26或SEQ ID No.27所示；ZmSIZ1b蛋白的突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.28或SEQ ID No.29所示，其编码基因的核苷酸序列分别为SEQ ID No.30或SEQ ID No.31所示。
由此，本发明提供了一种提高玉米抗穗粒腐病抗性的方法，包括，构建含有ZmSIZ1a基因或/和ZmSIZ1b基因的植物重组表达载体；将所述植物重组表达载体转化到玉米中，将ZmSIZ1a基因或/和ZmSIZ1b基因在玉米中进行过表达。
进一步的，本发明还提供了一种培育玉米抗穗粒腐病抗性的新品种方法，包括,构建含有ZmSIZ1a基因或/和ZmSIZ1b基因的植物重组表达载体；将所述植物重组表达载体转化到玉米中，将ZmSIZ1a基因或ZmSIZ1b基因在玉米中进行过表达，将表现穗粒腐病抗性提高的超表达株系与不同玉米材料杂交并回交转育，改良杂交种，获得玉米抗穗粒腐病抗性新品种。
此外，本发明还提供了一种增强玉米SUMO化修饰能力的方法，包括构建含有ZmSIZ1a基因或/和ZmSIZ1b基因的植物重组表达载体；将所述植物重组表达载体转化到玉米中，将ZmSIZ1a基因或ZmSIZ1b基因在玉米中进行过表达。
相应的，本发明还提供了一种减弱玉米SUMO化修饰能力或降低玉米对于穗粒腐病抗性的方法，该方法包括：构建ZmSIZ1a基因或/和ZmSIZ1b基因的基因编辑载体；将所构建的基因编辑载体转化到玉米植物中，将玉米中的ZmSIZ1a基因或ZmSIZ1b基因敲除或进行突变。
其中，ZmSIZ1a基因或ZmSIZ1b基因的基因编辑载体可以按照本领域的常规构建方法得到。
作为一种优选的实施方案，本发明提供了一种ZmSIZ1a基因或ZmSIZ1b基因的基因编辑载体的构建方法，包括：
(1)sgRNA表达盒的制备
以SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列为靶点序列设计上下游引物，以SEQ ID No.14所述的sgRNA序列为模板为进行PCR扩增获得3段靶点序列和sgRNA的融合片段；将3段融合片段分别与U6-1启动子片段连接得到三个sgRNA表达盒
(2)将三个sgRNA表达盒依次连接到pCPB-ZmUbi:hspCas9的HindIII酶切位点间构建得到CRISPR/Cas9基因编辑载体。
其中，步骤(1)中所述的上游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10和SEQ ID No.11所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.15所示。
作为参考，本发明提供了一种包括含有ZmSIZ1a基因或ZmSIZ1b基因基因的植物重组表达载体的方法，包括，将所述ZmSIZ1a基因或ZmSIZ1b基因可操作的与表达调控元件相连接得到植物重组表达载体；该植物重组植物表达载体可以由5′端非编码区，ZmSIZ1a基因或ZmSIZ1b基因和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。
所述重组重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。
本发明所述的转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick et al.PlantCell Reports.1986.5:81-84)。
所述的目标植物包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物是玉米。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。
本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。
术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
术语“植物重组表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。
术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。
本发明整体技术方案的详述
本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对玉米ZmSIZ1a和ZmSIZ1b基因进行突变，获得了影响玉米SUMO化修饰及穗粒腐病抗性的两个关键突变蛋白。
在Zmsiz1s-#1突变体材料中，ZmSIZ1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和4bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。ZmSIZ1b基因分别在靶点1上游2bp处和靶点2下游4bp处发生切割，共删除188bp。
在Zmsiz1s-#2突变体材料中，ZmSIZ1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和1bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。ZmSIZ1b基因分别在靶点1上游5bp处和靶点2下游8bp处发生切割，共删除195bp，删除后导致移码突变，提前出现终止子。
筛选得到的Zmsiz1s-#1突变体材料和Zmsiz1s-#2突变体材料因基因ZmSIZ1a和ZmSIZ1b功能异常，导致植株体内蛋白发生SUMO化修饰的能力严重受损。具体来讲，与野生型植株相比，突变体植株在热胁迫条件下全局性SUMO化修饰能力严重受损。同时，突变体籽粒在实验室条件和田间条件下均表现出易感穗粒腐病的表型，这表明ZmSIZ1a和ZmSIZ1b蛋白对玉米蛋白发生SUMO化修饰及玉米抗病性(抗穗粒腐病)起着至关重要的调控作用。
本发明首次通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对玉米SUMO E3连接酶基因ZmSIZ1a和ZmSIZ1b进行定点突变，获得了严重影响玉米SUMO化修饰能力和穗粒腐病抗性的缺陷突变蛋白，这对于构建相关遗传调控网络并应用于育种研究有重要的理论和实践意义。
附图说明
图1两个ZmSIZ1a和ZmSIZ1b同时被编辑的突变体材料Zmsiz1s-#1突变体材料和Zmsiz1s-#2突变体材料；A在Zmsiz1s-#1突变体材料中，ZmSIZ1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和4bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。ZmSIZ1b基因分别在靶点1上游2bp处和靶点2下游4bp处发生切割，共删除188bp；B在Zmsiz1s-#2突变体材料中，ZmSIZ1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和1bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。ZmSIZ1b基因分别在靶点1上游5bp处和靶点2下游8bp处发生切割，共删除195bp，删除后导致移码突变，提前出现终止子。
图2突变体材料Zmsiz1s-#1和Zmsiz1s-#2突变体植株叶片在热胁迫条件下全局性SUMO化修饰能力鉴定结果。
图3突变体材料Zmsiz1s-#1和Zmsiz1s-#2籽粒在实验室条件下抗穗粒腐病抗性鉴定结果。
图4突变体材料Zmsiz1s-#1和Zmsiz1s-#2籽粒在田间条件下抗穗粒腐病抗性鉴定结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 ZmSIZ1a和ZmSIZ1b基因的CRISPR/Cas9敲除载体的构建
1.ZmSIZ1a和ZmSIZ1b基因靶位点设计
首先从玉米Gramene数据库中得到ZmSIZ1a(GRMZM2G155123_T001)和ZmSIZ1b(GRMZM2G455664_T057)的基因组序列，然后利用SnapGene Viewer软件及同源序列比对设计和筛选ZmSIZ1a和ZmSIZ1b基因特异的靶标序列(设计sgRNA)，为了保证基因编辑效率，每个基因选取两个最优的靶标序列：
ZmSIZ1a的CRISPR/Cas9靶标序列为：
GAAAAATGCTCTTACAAGGG(SEQ ID No.5)
GACTTCTACCATGTGGATAC(SEQ ID No.6)；
ZmSIZ1b的CRISPR/Cas9靶标序列为：
GAAAAATGCTCTTACAAGGG(SEQ ID No.7)
TCTAGGAGTCACAGTGGGTC(SEQ ID No.8)。
根据以上靶点序列设计带有接头的引物用于构建载体。其中两个基因的第一个靶标序列相同，所以对这一靶点序列只设计一条引物(ZmSIZ1ab-1F)。引物序列如下：
ZmSIZ1ab-1F：
GAGCCGCAAGCACCGAATTGAAAAATGCTCTTACAAGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT(SEQID No.9)
ZmSIZ1a-2F：
GAGCCGCAAGCACCGAATTGTATCCACATGGTAGAAGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT(SEQID No.10)
ZmSIZ1b-2F：
GAGCCGCAAGCACCGAATTGACCCACTGTGACTCCTAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT(SEQID No.11)
其中，黑色字体部分为连接U6-1启动子片段的接头引物序列，斜体字部分为设计的靶点序列，下划线部分为连接sgR骨架片段的接头引物序列。
2.制备玉米U6-1启动子片段
以B73基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得U6-1启动子片段，扩增引物序列为MU6-1F：AAGCTGTTTTTGTTAGCCCCATCG(SEQ ID No.12)，MU6-1R:AATTCGGTGCTTGCGGCTC(SEQ IDNo.13)。
3.制备sgRNA表达盒
以sgRNA序列为模板，其序列为：
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQ ID No.14))；
分别以ZmSIZ1ab-1F，ZmSIZ1a-2F和ZmSIZ1b-2F为上游引物，以MUsgR-R：GGCCAGTGCCAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCG(SEQ ID No.15)为下游引物，通过PCR扩增获得3段靶点序列和sgRNA的融合片段分别命名为1ab-sgR片段，1a2-sgR片段和1b2-sgR片段。
以1ab-sgR片段和U6-1启动子片段为模板，以MU6-2F(序列：TGCACTGCACAAGCTGTTTTTGTTAGCCCCATCG(SEQ ID No.16))为上游引物，MUsgR-R为下游引物，通过重叠PCR获得sgRNA表达盒1；
分别以1a2-sgR片段和U6-1启动子片段，1b2-sgR片段和U6-1启动子片段为模板，以MU6-3F为上游引物，其序列为：TGCTTTTTTTAAGCTGTTTTTGTTAGCCCCATCG(SEQ IDNo.17))，
以MUsgR-R为下游引物，通过重叠PCR获得sgRNA表达盒2和sgRNA表达盒3。
4.sgRNA表达盒连接CPB-Ubi-hspcas9载体
将三个sgRNA表达盒通过HD Cloning Kit试剂盒依次连接到pCPB-ZmUbi:hspCas9的HindIII酶切位点间，获得CRISPR/Cas9基因编辑载体，最终构建成的载体经过PCR测序验证无误后用于后续的遗传转化。
实施例2 玉米遗传转化及Zmsiz1s双突变体株系鉴定
1.玉米遗传转化
本实施例选取背景材料为ZC01，通过对实施例1所构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体进行EHA105农杆菌介导，以玉米幼胚为受体进行遗传转化，获得转化植株。
取T0代转基因材料叶片提取DNA，用Bar基因引物：
5’-CCATCGTCAACCACTACATCGAGACA-3’(SEQ ID No.18)；
5’-CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGT-3’(SEQ ID No.19)进行PCR扩增检测阳性植株；阳性植株用引物5’-GACAAGCCTCAATTCATCAGTGTT-3’(SEQ ID No.20),
5’-CAGTTCATTCGCAACATCTTAGC-3’(SEQ ID No.21)对ZmSIZ1a目的片段进行扩增，用引物5’-CAAGCCAGTAGGTTTTGTTATGC-3’(SEQ ID No.22)，5’-ATGTTTCATGTCCTATGTCCCTTTC-3’(SEQ ID No.23)对ZmSIZ1b目的片段进行扩增，扩增产物进行测序鉴定。
利用SnapGene Viewer软件将测序结果与目的基因序列进行比对，筛选得到两个ZmSIZ1a和ZmSIZ1b同时被编辑的突变体材料Zmsiz1s-#1和Zmsiz1s-#2：
在Zmsiz1s-#1突变体材料中，ZmSIZ1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和4bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。ZmSIZ1b基因分别在靶点1上游2bp处和靶点2下游4bp处发生切割，共删除188bp(图1A)。
在Zmsiz1s-#2突变体材料中，ZmSIZ1a基因分别在靶点1上游4bp处和靶点2下游3bp处发生切割，分别形成了1bp和1bp的碱基缺失，删除后导致移码突变，提前出现终止子。ZmSIZ1b基因分别在靶点1上游5bp处和靶点2下游8bp处发生切割，共删除195bp，删除后导致移码突变，提前出现终止子(图1b)。
上述在Zmsiz1s突变体中发生的碱基缺失突变，都导致ZmSIZ1a和ZmSIZ1b蛋白被成功敲除。
2.对所获得的玉米转基因植株进行SUMO化修饰能力鉴定
将野生型和Zmsiz1s纯合突变体(#1、#2)种植在人工气候培养箱中，温度为28℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。10天后对幼苗进行42℃高温处理1小时，以未处理的幼苗为对照。取叶片样品提取蛋白，通过蛋白质免疫印迹法检测各样品中蛋白的全局性SUMO化修饰水平。
实验结果表明，与野生型相比，突变体植株叶片在热胁迫条件下全局性SUMO化修饰能力严重受损(图2)
3.对所获得的玉米转基因植株进行抗病性鉴定
在实验室对野生型与Zmsiz1s纯合突变体(#1、#2)的籽粒进行抗病性鉴定。首先利用10％次氯酸钠溶液对玉米籽粒进行消毒；然后用刀片在籽粒表面划出约0.5cm长、0.5mm深的伤口；然后在籽粒表面滴加150μl含有0.01％吐温20的拟轮枝镰孢菌孢子悬浮液，其中孢子浓度为1×106个/ml。将接菌后的籽粒放入28℃培养箱中培养，期间保持湿润环境，3天后进行表型观察并统计孢子数。
同时，将野生型与Zmsiz1s纯合突变体(#1、#2)分别种植于海南省三亚市乐东黎族自治县尖峰镇翁毛村万钟公司产学研示范园基地。在玉米雌穗吐丝后20天，利用注射器向果穗中下部进行接菌，接菌菌液为浓度为5×106个/ml的拟轮枝镰孢菌孢子悬浮液，每穗接种2ml菌液。待玉米果穗成熟后对发病表型进行观察。
上述抗病性鉴定结果均显示，突变体籽粒在实验室条件(图3)和田间条件下(图4)均表现出易感穗粒腐病的表型，这表明ZmSIZ1a和ZmSIZ1b蛋白对玉米蛋白发生SUMO化修饰及玉米抗病性(抗穗粒腐病)起着至关重要的调控作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 从玉米中分离的SIZ1蛋白及其编码基因和在品种改良中的应用
<130> GD-2001-210406A
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
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<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 18
ccatcgtcaa ccactacatc gagaca 26
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 19
cttcagcagg tgggtgtaga gcgt 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 20
gacaagcctc aattcatcag tgtt 24
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 21
cagttcattc gcaacatctt agc 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 22
caagccagta ggttttgtta tgc 23
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 23
atgtttcatg tcctatgtcc ctttc 25
<210> 24
<211> 111
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 24
Met Ser Asp Leu Ala Ser Ser Cys Lys Asp Lys Leu Ala Tyr Phe Arg
1 5 10 15
Ile Lys Glu Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gln Leu Gly Leu Pro Lys Gln
20 25 30
Gly Lys Lys Gln Asp Leu Val Asp Arg Val Leu Ala Ile Leu Ser Asp
35 40 45
Glu Gln Gly Gln His His His Gly Trp Gly Arg Lys Asn Ala Leu Thr
50 55 60
Gly Arg Arg Trp Gln Lys Leu Leu Met Thr His Thr Gly Lys Cys Lys
65 70 75 80
Tyr Val Leu Leu Thr Phe Pro Leu Glu Ala Thr Val Asp Gln Ile Ser
85 90 95
Val Ile Ser Gly Pro Lys Arg Lys Arg Leu Thr Pro Cys Gly Tyr
100 105 110
<210> 25
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<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 25
Met Ser Asp Leu Ala Ser Ser Cys Lys Asp Lys Leu Ala Tyr Phe Arg
1 5 10 15
Ile Lys Glu Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gln Leu Gly Leu Pro Lys Gln
20 25 30
Gly Lys Lys Gln Asp Leu Val Asp Arg Val Leu Ala Ile Leu Ser Asp
35 40 45
Glu Gln Gly Gln His His His Gly Trp Gly Arg Lys Asn Ala Leu Thr
50 55 60
Gly Arg Arg Trp Gln Lys Leu Leu Met Thr His Thr Gly Lys Cys Lys
65 70 75 80
Tyr Val Leu Leu Thr Phe Pro Leu Glu Ala Thr Val Asp Gln Ile Ser
85 90 95
Val Ile Ser Gly Pro Lys Arg Lys Arg Leu Thr Leu Pro Cys Gly Tyr
100 105 110
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
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atgtcggacc tcgcttccag ctgcaaggat aaacttgcgt attttagaat aaaggagctc 60
aaagatatct taaatcagct ggggttaccg aagcaaggaa agaagcagga ccttgttgac 120
agggtattgg ctattttatc agatgagcaa ggtcaacatc atcatggatg gggaaggaaa 180
aatgctctta cagggaggcg gtggcaaaag ttgttgatga cacatacagg aaaatgcaag 240
tatgtgctcc tgaccttccc tctagaagcc acagtggatc agatttcagt catttcaggc 300
ccaaagagga agcgcctgac accatgtgga tactaa 336
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<212> DNA
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atgtcggacc tcgcttccag ctgcaaggat aaacttgcgt attttagaat aaaggagctc 60
aaagatatct taaatcagct ggggttaccg aagcaaggaa agaagcagga ccttgttgac 120
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Met Ser Asp Leu Ala Ser Thr Ser Lys Asp Lys Leu Ala Tyr Phe Arg
1 5 10 15
Ile Lys Glu Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gln Leu Gly Leu Pro Lys His
20 25 30
Gly Lys Lys Gln Asp Leu Val Asp Arg Val Leu Ala Glu Leu Ser Asp
35 40 45
Glu Gln Gly Gln Arg His His Gly Trp Gly Arg Lys Asn Ala Leu Thr
50 55 60
Arg Ser His Ser Gly Ser Asp Phe Asn His Phe Arg Pro Lys Glu Glu
65 70 75 80
Ala Thr Asp Phe Tyr Tyr Val Glu Thr Lys Val Arg Cys Leu Cys Asn
85 90 95
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100 105 110
Gln Leu Trp Gln His Phe Thr Cys Val Leu Ile Pro Asp Thr Pro Thr
115 120 125
Glu Gly Ala Gly Pro Asp Ile Pro Pro His Phe Tyr Cys Glu Leu Cys
130 135 140
Arg Leu Asn Arg Ala Asp Pro Phe Trp Val Thr Thr Ala Asn Pro Leu
145 150 155 160
Leu Pro Val Lys Phe Ile Ser Ser Gly Val Gly Asn Asp Gly Ala Ser
165 170 175
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180 185 190
Glu Thr Val Gln Arg Pro Glu Tyr Asp Leu Gln Val Trp Cys Ile Leu
195 200 205
Val Asn Asp Lys Val Gln Phe Arg Met Gln Trp Pro Gln Tyr Ala Glu
210 215 220
Leu Gln Val Asn Gly Ile Pro Val Arg Val Met Thr Arg Pro Gly Ser
225 230 235 240
Gln Leu Leu Gly Ile Asn Gly Arg Asp Asp Gly Pro Leu Val Thr Thr
245 250 255
Cys Ser Arg Glu Gly Ile Asn Lys Ile Ser Leu Ser Arg Val Asp Ala
260 265 270
Arg Thr Phe Cys Phe Gly Val Arg Ile Val Arg Arg Arg Thr Val Pro
275 280 285
Gln Val Leu Ser Leu Ile Pro Lys Glu Gly Glu Gly Glu Ser Phe Glu
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Asp Ala Leu Ala Arg Val Arg Arg Cys Leu Gly Gly Gly Gly Ala Thr
305 310 315 320
Asp Asn Ala Asp Ser Asp Ser Asp Leu Glu Val Val Thr Glu Ser Val
325 330 335
Thr Val Asn Leu Arg Cys Pro Asn Ser Gly Ser Arg Met Arg Ile Ala
340 345 350
Gly Arg Phe Lys Pro Cys Val His Met Gly Cys Phe Asp Leu Glu Thr
355 360 365
Phe Val Glu Leu Asn Gln Arg Ser Arg Lys Trp Gln Cys Pro Ile Cys
370 375 380
Leu Asn Asn Tyr Ser Leu Glu Asn Leu Met Ile Asp Pro Tyr Phe Asn
385 390 395 400
Arg Ile Thr Ser Leu Leu His Asn Cys Ser Glu Asp Val Asn Glu Leu
405 410 415
Asp Val Lys Pro Asp Gly Ser Trp Arg Val Met Gly Asp Ala Ala Thr
420 425 430
Arg Asp Leu Ser Gln Trp His Met Pro Asp Gly Thr Leu Cys Asp Ser
435 440 445
Lys Glu Asp Thr Asn Pro Gly Val Ala Ser Val Asn Glu Phe Lys Arg
450 455 460
Glu Gly Ala Ser Asp Glu His Arg Thr Leu Lys Leu Gly Ile Lys Lys
465 470 475 480
Asn Pro Ile Gly Leu Trp Gln Val Ser Ser Lys Ala Asp Asp Met Lys
485 490 495
Pro Val Val Arg Asn His Ile Gln Asn Asn Thr Gly Phe Ser Thr Pro
500 505 510
Asn Ile Val Pro Met Ile Ser Ser Pro Thr Gly Ser Tyr Arg Asp Gly
515 520 525
Glu Asp Val Ser Val Asn Gln Glu Gly Gly Gly Ile Gln Phe Asp Ile
530 535 540
Ser Leu Asn Gln Glu Phe Asp Ser Phe Ala His Asn Phe Gly Gln Thr
545 550 555 560
Tyr Asn Thr Glu Asp Arg Pro Gln His Pro His His Asn Ala Ala Asp
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Val Ile Val Leu Ser Asp Ser Asp Glu Glu Asn Asp Pro Thr Val Gln
580 585 590
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Ser Ile Cys Arg Asn Ser Asn Asp Val His Gly Ser Leu Val Asp Asn
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Pro Leu Ala Leu Thr Gly Asp Asp Pro Ser Leu Gln Ile Phe Leu Pro
725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
Leu Ala Ala Gly Gly Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Ser Val Gly Gly
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Gly Lys Lys Gln Asp Leu Val Asp Arg Val Leu Ala Glu Leu Ser Asp
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Glu Gln Gly Gln Arg His His Gly Trp Gly Arg Lys Asn Ala Leu Thr
50 55 60
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Cys
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aaagatatct taaatcagct ggggttgccg aagcatggaa agaagcagga ccttgttgac 120
agggtattgg cagaattatc agatgagcaa ggtcaacgcc atcatggatg gggaaggaaa 180
aatgctctta caaggagtca cagtgggtca gatttcaatc attttaggcc caaagaggaa 240
gccactgact tctactatgt ggagactaag gtccgctgcc tttgcaatag cacaatgcta 300
aatgacaaga ttatcaagtg tgaagatggc aaatgccagc tgtggcagca ttttacctgc 360
gtactcattc cagatacacc cacggagggt gctggccctg atattccacc tcatttttat 420
tgtgaactgt gccgactgaa ccgggcagat ccgttttggg tgactacagc aaatccacta 480
ctacctgtga aatttatctc atctggtgtt ggaaatgatg gagcaagcgc acctcaaatt 540
gtggagaaga ccttccaact ttcccgagca gaaagagaaa cagtccagag gccagaatac 600
gatctccagg tttggtgcat tcttgtaaat gacaaagtcc agttcaggat gcaatggcct 660
caatatgcag aattgcaagt gaacggtatt cctgtacgag taatgaccag gcctggttct 720
cagttactag ggataaatgg acgtgatgat gggccactgg taaccacatg cagtagagaa 780
gggattaata aaattagctt atcaagagtt gatgctcgaa ccttttgctt tggagttcga 840
attgttagga ggaggactgt tcctcaggta ttaagcttga tcccaaagga aggtgaaggg 900
gagtcttttg aggatgctct tgctcgtgtt cgtcgttgtc ttggaggtgg aggtgctaca 960
gacaatgctg atagtgatag cgatctggaa gtggttactg aatctgttac agtcaacctt 1020
cgttgcccta atagtggatc cagaatgagg attgctggaa ggttcaagcc ttgtgttcac 1080
atgggctgtt ttgatcttga aacttttgtg gaattgaatc aacgctcacg caagtggcaa 1140
tgcccaatat gtttaaataa ttactctctc gagaacttga tgattgatcc ttatttcaat 1200
cggattactt ctttgttgca caattgcagt gaagatgtta atgaacttga tgttaaacct 1260
gatgggtcat ggcgtgtgat gggtgatgcc gctaccagag atttatctca gtggcatatg 1320
cctgatggta ctctttgtga ctcaaaggaa gatacaaacc ctggtgtcgc aagtgttaat 1380
gagttcaaga gagagggtgc ttctgatgaa catagaactt tgaaacttgg aattaaaaaa 1440
aaccctattg gattatggca ggttagcagt aaagcagatg atatgaaacc tgtggttaga 1500
aatcacatcc aaaataacac tgggttttca acaccaaaca ttgtgcctat gatcagtagc 1560
cccactggga gttacagaga tggcgaagat gtaagtgtga accaagaagg gggtggtatt 1620
caatttgata tatcattgaa ccaagagttt gacagttttg cccacaactt tggtcagaca 1680
tacaatacag aggatagacc acaacatcca caccataatg ctgcagatgt cattgttctt 1740
agtgattctg atgaagaaaa tgacccgact gttcagccgc cagctgtcta tgaaaatact 1800
cctacaaatg atgacagttt tcctttcgtc actgatgctg ccggatctgg atatcctgaa 1860
aggtaccagg aggatgctag tgttggtaca agtggtcttg gtttattgag gcagaacact 1920
ggtgaatttg aaataaataa ctggcaaatg ctttcttacc cacaaccaga gcaagggttt 1980
cagttttttg tgactgatac tgatgttggc aatccttttg ttgctccaca taattccttt 2040
actattgcac cagaagacta ctctcttggc tgtaatgttg gaatagagga cccctctgca 2100
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ccactggcat taacaggtga cgatccatct ttgcaaattt ttcttccaag tcaaccttcc 2220
actgttcccc ttcagcaaga attgagtgag cgttctgata ctccaaatgg agtccaccct 2280
aacgattgga ggatatcgct tacgcttgcc gctggtggag ggggcaatga agagtctaca 2340
agtgttggcg gtctaaaatc acaaccaaaa gtttcatcga aagaggcagg agttgaacct 2400
ttacttgatg ctgtgcagct tctgctcttg gaagcatga 2439
<210> 31
<211> 294
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 31
atgtcggacc tcgcttccac cagcaaggat aaacttgcgt attttagaat aaaggagctc 60
aaagatatct taaatcagct ggggttgccg aagcatggaa agaagcagga ccttgttgac 120
agggtattgg cagaattatc agatgagcaa ggtcaacgcc atcatggatg gggaaggaaa 180
aatgctctta ccacagtggg tcagatttca atcattttag gcccaaagag gaagccactg 240
acttctacta tgtggagact aaggtccgct gcctttgcaa tagcacaatg ctaa 294
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