具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

1.1实验方法

1.1.1 LCR反应

参照Gen Bank登录号(QHD43416)对SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列进行分析，其RBD氨基酸为Asn331-Glu583，利用DNAssist 2.2软件分析，优化RBD段密码子并且对该基因进行合成。在LCR中，体系为0.5ul各oligo-dT[一共35个，其中P1-P7；CP1-CP9；CMV1-CMV10；RBD1-RBD8，共34个见表2；CMV-R(表1)]、1ul Taq DNA连接酶、2.5ul 10×Taq DNA连接酶反应缓冲液(生工，中国)和4ul ddH₂O加入PCR管中。该反应在Mastercycler X50 PCR仪(Eppendorf，德国)上进行：95℃持续5min，45个循环：51℃持续20s，45℃持续4min，最后45℃过夜高温连接。

1.1.2 LCR产物的PCR扩增

反应混合物由1ul LCR产物、引物CMV-F、CMV-R各1ul(表1)、12.5ul 2×Pfu PCRMix(市售)和9.5ul ddH₂O。反应程序为：94℃持续3min，94℃持续30s，55℃持续30s，72℃持续2min，一共进行30个循环，最后72℃扩增5min。

表1 PCR扩增的引物

表2 LCR反应中各oligo-dT

1.2琼脂糖凝胶电泳

将PCR扩增后反应产物点样于溴化乙锭(EB)染色的浓度为1.0％的琼脂糖凝胶，电泳速度为15v/cm(6cm凝胶为90v)，在ChemiDoc XRS+凝胶成像系统(Bio-rad，美国)中对DNA条带进行观察拍照(图2)，找出目的条带切胶并回收。

1.3胶回收DNA转染293FT细胞

6孔板中铺设3孔293FT细胞[比昂生物，中国(含复孔和对照)]，每孔1×10⁶/ml，置于含5％CO₂的37℃培养箱中孵育备用；将电转杯中加入2μg胶回收DNA和100ul EBELBuffer混匀于X-Porator H1电转仪(壹达，中国)中电击，电转后往电击杯中缓慢加入100μlOpti-MEM培养基，继续培养于含5％CO₂的37℃培养箱。

1.4 RNA提取、反转录cDNA及RBD目的片段扩增

提取3管细胞液(3管分别命名为C1、C2、CON)中的RNA(Takara，中国)，进行cDNA反转录(Takara，中国)，反转录条件为42℃反应50min、95℃反应5min，冰上冷却2min。PCR反应体系为1ul的模板cDNA、1ul的RBD-F与RBD-R引物(表1)、12.5ul的2×Pfu PCR Mix和9.5ul的ddH₂O(TIANGEN，中国)，进行目的片段的扩增。反应程序同1.1.2。

1.5批量PCR产物的纯化及检测

DNA样品先后进行DNA片段分选磁珠法纯化和乙醇沉淀，用紫外分光光度计分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值，血平板和沙氏琼脂平板分别检测细菌及真菌，支原体PCR检测试剂盒(缔一生物，中国)、2％琼脂糖凝胶电泳检测支原体。

1.6克隆、限制性内切酶切和DNA测序

将1ul DNA样品、5ul 2×连接酶反应缓冲液、1ul T4 DNA连接酶和1ul ddH₂O的反应体系进行p-GEM-T载体的克隆。将混合物轻轻混合并在4℃下孵育过夜，2ul连接产物用于转化JM109活性细胞，然后将其铺于氨苄青霉素抗性的LB平板上，采用蓝/白斑选择法筛选重组质粒，从白色菌落中挑取重组质粒抽提酶切测序分析。

1.7血清中和试验

用10⁶CCID₅₀/ml的SARS-CoV-2载量进行血清中和试验，每组随机选取10只BALB/c小鼠并按不同免疫剂量一共分成5组，依次为低剂量组(12.5ug)、偏低剂量组(25ug)、中剂量组(50ug)、偏高剂量组(75ug)和高剂量组组(100ug)。利用基因枪注射法分别给各组注射相应剂量，分别在第0周、第3周和第6周免疫，一共免疫3次。

1.8免疫保护性试验

每组随机选取10只BALB/c小鼠并按不同免疫剂量一共分成5组(同样为低剂量组、偏低剂量组、中剂量组、偏高剂量组和高剂量组)。免疫剂量30ug/只，间隔21日同剂量再加强免疫1次，2免后14日后通过鼻腔途径进行攻毒，观察各组小鼠的发病与死亡情况。

2结果与分析

2.1 LCR PCR产物鉴定

经LCR反应体外合成启动子CMV+目标抗原RBD+ployA60完整表达框序列大小为1503bp(SEQ ID No.1)，电泳片段与预期大小相符，成功合成该表达框序列。

2.2RBD基因的合成及验证

参考Gene Bank公布的SARS-CoV-2S蛋白氨基酸序列，选择Asn331-Glu583序列，对RBD段对应的核酸进行基因合成，回收PCR产物转染293FT细胞培养48h后，提取RNA浓度为1.3ug/ul。以反转录的cDNA为模板经PCR扩增，获得与RBD目的基因片段大小相辅的电泳条带(图3)，合成RBD片段大小为639bp，其序列(下划线标注分别为起始密码子和终止密码子)为：

ATGCGCGTACAACCGACGGAGAGTATCGTACGATTCCCTAACATAACGAATCTCTGTCCGTTTGGAGAGGTATTCAACGCAACCAGATTCGCGTCAGTCTATGCGTGGAATCGGAAGAGAATATCTAATTGTGTTGCTGACTATTCTGTGCTGTATAACTCAGCCTCCTTTAGTACCTTTAAGTGTTATGGGGTGAGCCCGACAAAACTTAACGACCTTTGCTTTACCAACGTGTACGCCGACAGTTTTGTAATCAGGGGGGATGAAGTTAGGCAAATTGCACCGGGCCAAACAGGTAAGATTGCAGACTATAACTACAAATTGCCAGATGACTTCACTGGTTGTGTTATCGCGTGGAATTCTAACAATCTTGATAGCAAAGTCGGGGGTAACTATAACTATCTTTACCGCCTGTTTAGAAAAAGTAACCTTAAACCGTTCGAGCGAGACATAAGTACCGAAATATACCAGGCTGGTAGCACACCTTGCAATGGGGTGGAGGGGTTCAACTGTTACTTCCCCCTCCAAAGTTATGGATTTCAACCTACAAACGGCGTTGGTTACCAGCCTTACAGGGTCGTTGTACTCAGTTTCGAGTTGCTTCATGCTCCTGCTACGGTTTGTGGGCCCAAGAAGTAA(SEQ ID No.40)。

2.3 PCR产物的纯化与检测

纯化后样品紫外分光光光度计测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值，OD260/OD280＝1.80，OD260/OD230＝1.99，经纯化后最终得到5.2mg DNA溶液。通过连续培养72h的血琼脂板和沙氏琼脂板分别检测细菌和真菌，结果均未有生长(表2)。通过PCR检测试剂盒扩增，浓度2％的琼脂糖凝胶电泳检测支原体，结果为阴性(表3)。

表3细菌、真菌和支原体检测

2.4目的片段的克隆与转化

纯化PCR产物与p-GEM-T载体连接，转化JM109活性细胞，最终筛选得到5个克隆，测序结果分析表明1个(CPD-5：自命名)正确。

2.5中和抗体水平

通过比较线性DNA疫苗在不同组别和免疫次数下的血清中和抗体效价，显示中和抗体效价随着不同组免疫剂量及免疫次数的增加而升高，在第一次免疫时5组(低剂量组、偏低剂量组、中剂量组、偏高剂量组、高剂量组)中没有检测到抗体的存在，而在进行到第三次免疫反应后高剂量组的抗体效价最高为1:300(表4)。经过3次免疫反应，我们能可以得到结论：小鼠可以通过DNA疫苗的刺激在自身体内产生免疫反应并且具备一定的免疫原性。

表4不同剂量免疫小鼠血清抗SARS-CoV-2中和抗体效价

2.6小鼠免疫保护性

低剂量、偏低剂量组的小鼠都有肺部病理改变，免疫保护率均为0，无法起到疫苗保护性，给予高剂量组的小鼠有约40％的保护效果(表5)。证明该技术生产的线性DNA疫苗免疫小鼠后，在小鼠体内产生的抗体可以中和一定的SARS-CoV-2，有一定的保护作用。。

表5线性DNA疫苗的免疫保护性

3讨论与结论

SARS-CoV-2的传染性强、潜伏期长、传播途径广和变异速度快。同时，对于真正的传染源及中间宿主也未明确，加之发现的备受全世界关注的3株SARS-CoV-2突变株-英国B.1.1.7突变株、南非B.1.351突变株和巴西P.1突变株，这些都对SARS-CoV-2的疫情防控和疫苗研发产生极大影响。截止2020年底，全世界处于临床试验阶段的COVID-19疫苗有64款，其中有18款疫苗已进入Ⅲ期临床试验阶段，包括5种国产疫苗。其中以S蛋白为靶点的DNA疫苗INO-4800是全球第一个DNA候选疫苗。通过基因工程构建的INO-4800在体外诱导了S蛋白的大量表达，并在小鼠和豚鼠中单次免疫后产生抗体和T细胞反应，并且在I期临床试验中具有免疫原性和良好的耐受性，这一数据初步确定S蛋白的DNA疫苗INO-4800可作为COVID-19的一种潜在候选疫苗。

本发明在体外没有病毒基因模板的条件下快速合成启动子CMV+目标抗原RBD+ployA60完整表达框序列，再通过大规模PCR技术达到产业化级别。在整个疫苗生产过程中不需要质粒，没有细菌发酵的过程，该技术优势是生产步骤简单，大大缩短疫苗研发周期，使DNA疫苗的制备更加迅速，便于进行规模化、工业化生产；整个生产过程体外可控，经纯化后产物没有细菌、真菌、支原体等杂质，能够保证具有更高的生物安全性。

在动物实验中，以不同免疫剂量和次数对小鼠免疫进行了研究，免疫后小鼠的中和抗体效价在第一次免疫后未测出抗体效价，在第三次免疫后高剂量组的抗体效价达到1:300，说明本发明所制备的线性DNA疫苗具有免疫原性，可诱导小鼠体内产生抗体，且随着免疫剂量的增加抗体效价也随之升高。通过不同效价组的小鼠攻毒后显示对其保护率也随着抗体效价的升高而加强，当抗体效价达到一定高度后对小鼠的保护率达到40％，结果表明该线性DNA疫苗具有一定程度的免疫原性和免疫保护性。

综上所述，我们利用一步法快速合成含RBD基因的线性DNA疫苗，与其他疫苗相比，具有快速、高效、经济等特点，该方法在技术上和商业上都是可行的，可以在全球大规模供应的情况下进行生产，为进一步开发该候选疫苗提供了良好的前景。动物免疫实验结果强调了RBD片段在SARS-CoV-2线性DNA疫苗设计中的有效性，并为通过诱导针对RBD的抗体开发保护性疫苗提供了理论基础。

DNA疫苗构建的目的基因是来自于病毒原核生物基因组，而构建成功的疫苗则主要应用于小鼠、猕猴乃至人类等高级哺乳动物，在其体内转录、翻译成蛋白质，以激活其免疫系统。本发明对DNA疫苗的密码子进行特定优化(图4)，该优化是按照哺乳动物密码子使用偏好，在不改变基因编码蛋白质氨基酸序列的基础上，对DNA疫苗的目的基因进行优化，使其符合哺乳动物密码子使用偏好，以提高目的基因在宿主细胞中的蛋白表达量。将DNA疫苗的目的基因按照哺乳动物密码子使用偏好进行优化后，可以显著提高目的基因在哺乳动物细胞中的蛋白表达量。与野生型基因相比，密码子优化后的基因的蛋白表达量大约可以增加5-20倍左右。显著增加的蛋白表达量可以更加有效的刺激宿主的免疫系统，进而明显增强DNA疫苗的免疫原性。

优化后RBD基因片段长度为639bp，与GeneBank上RBD基因相比，核苷酸同源性为74.8％，氨基酸同源性为100％,G+C含量从35.3％提高到44.9％。增加了G+C含量并消除了稀有密码子，使其更适合于在真核细胞中表达。表达量比原序列高出38％左右。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

序列表

<110> 杨光华

<120> SARS-CoV-2 线性DNA疫苗

<130> 2021.05.07

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

aaaggtgtgg gtttggatcc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 60

tgagcttggc ccattgcata cgttgtatcc atatcataat atgtacattt atattggctc 120

atgtccaaca ttaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 180

tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 240

tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 300

tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 360

aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 420

caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 480

tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 540

gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 600

tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660

caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720

cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780

ccatagaaga caccgactct agagatgcgc gtacaaccga cggagagtat cgtacgattc 840

cctaacataa cgaatctctg tccgtttgga gaggtattca acgcaaccag attcgcgtca 900

gtctatgcgt ggaatcggaa gagaatatct aattgtgttg ctgactattc tgtgctgtat 960

aactcagcct cctttagtac ctttaagtgt tatggggtga gcccgacaaa acttaacgac 1020

ctttgcttta ccaacgtgta cgccgacagt tttgtaatca ggggggatga agttaggcaa 1080

attgcaccgg gccaaacagg taagattgca gactataact acaaattgcc agatgacttc 1140

actggttgtg ttatcgcgtg gaattctaac aatcttgata gcaaagtcgg gggtaactat 1200

aactatcttt accgcctgtt tagaaaaagt aaccttaaac cgttcgagcg agacataagt 1260

accgaaatat accaggctgg tagcacacct tgcaatgggg tggaggggtt caactgttac 1320

ttccccctcc aaagttatgg atttcaacct acaaacggcg ttggttacca gccttacagg 1380

gtcgttgtac tcagtttcga gttgcttcat gctcctgcta cggtttgtgg gcccaagaag 1440

taagatcctc tagaaataaa agatcttaag tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt 1500

gtg 1503

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

aaaggtgtgg gtttggatcc ggcctcggcc tc 32

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ctctccgtcg gttgtacgcg catctctaga gtcggtgtct tctatggagg 50

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

atgcgcgtac aaccgacgga gagtatcgta cgattccc 38

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cacacaaaaa accaacacac 20

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

tagactgacg cgaatctggt tgcgttgaat 30

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ggctcacccc ataacactta aagg 24

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

caatcttacc tgtttggccc ggtgcaattt 30

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

tagttacccc cgactttgct atcaagatt 29

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

gtgctaccag cctggtatat ttcggta 27

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

tggtaaccaa cgccgtttgt aggttgaaat 30

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

tctagaggat cttacttctt gggcccacaa acc 33

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

atacaacgta tgcaatgggc caagctcatg 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

taataactag tcaataatca atgtcaacat 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

atttaccgta agttatgtaa cgcggaactc 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

aagtccctat tggcgttact atgggaacat 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

ggggcgtact tggcatatga tacacttgat 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

atgtactgcc aagtaggaaa gtcccataag 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

caaaccgcta tccacgccca ttgatgtact 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

gaaagtcccg ttgattttgg tgccaaaaca 30

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

taaacgagct ctgcttatat agacctccca 30

<210> 22

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

aaaggtgtgg gtttggatcc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca 60

tgagcttggc ccattgc 77

<210> 23

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

atacgttgta tccatatcat aatatgtaca tttatattgg ctcatgtcca acattaccgc 60

catgttgaca ttgattattg ac 82

<210> 24

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60

cgttacataa c 71

<210> 25

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 60

tgacgtatgt tcccatagta acgcc 85

<210> 26

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc 60

agtacatcaa gtgtatcata tgc 83

<210> 27

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 60

acatgacctt atgggacttt ccta 84

<210> 28

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 60

acatcaatgg gcgtg 75

<210> 29

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 60

tgttttggca ccaaaatc 78

<210> 30

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc 60

gtgtacggtg ggaggtctat ataagcaga 89

<210> 31

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat 60

agaagacacc gactctagag 80

<210> 32

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

atgcgcgtac aaccgacgga gagtatcgta cgattcccta acataacgaa tctctgtccg 60

tttggagagg tattcaacgc aaccagattc gc 92

<210> 33

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

gtcagtctat gcgtggaatc ggaagagaat atctaattgt gttgctgact attctgtgct 60

gtataactca gcctccttta gtacctttaa gtgttatg 98

<210> 34

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

gggtgagccc gacaaaactt aacgaccttt gctttaccaa cgtgtacgcc gacagttttg 60

taatcagggg ggatgaagtt aggcaaattg caccgggcc 99

<210> 35

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

aaacaggtaa gattgcagac tataactaca aattgccaga tgacttcact ggttgtgtta 60

tcgcgtggaa ttctaacaat cttgatagca aagtcgg 97

<210> 36

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

gggtaactat aactatcttt accgcctgtt tagaaaaagt aaccttaaac cgttcgagcg 60

agacataagt accgaaatat accag 85

<210> 37

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 37

gctggtagca caccttgcaa tggggtggag gggttcaact gttacttccc cctccaaagt 60

tatggatttc aacctacaaa cgg 83

<210> 38

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 38

cgttggttac cagccttaca gggtcgttgt actcagtttc gagttgcttc atgctcctgc 60

tacggtttgt gggcccaa 78

<210> 39

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 39

gaagtaagat cctctagaaa taaaagatct taagtttcat tagatctgtg tgttggtttt 60

ttgtgtg 67

<210> 40

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 40

atgcgcgtac aaccgacgga gagtatcgta cgattcccta acataacgaa tctctgtccg 60

tttggagagg tattcaacgc aaccagattc gcgtcagtct atgcgtggaa tcggaagaga 120

atatctaatt gtgttgctga ctattctgtg ctgtataact cagcctcctt tagtaccttt 180

aagtgttatg gggtgagccc gacaaaactt aacgaccttt gctttaccaa cgtgtacgcc 240

gacagttttg taatcagggg ggatgaagtt aggcaaattg caccgggcca aacaggtaag 300

attgcagact ataactacaa attgccagat gacttcactg gttgtgttat cgcgtggaat 360

tctaacaatc ttgatagcaa agtcgggggt aactataact atctttaccg cctgtttaga 420

aaaagtaacc ttaaaccgtt cgagcgagac ataagtaccg aaatatacca ggctggtagc 480

acaccttgca atggggtgga ggggttcaac tgttacttcc ccctccaaag ttatggattt 540

caacctacaa acggcgttgg ttaccagcct tacagggtcg ttgtactcag tttcgagttg 600

cttcatgctc ctgctacggt ttgtgggccc aagaagtaa 639

<210> 41

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 41

gatcctctag aaataaaaga tcttaagttt cattagatct gtgtgttggt tttttgtgtg 60