一种植物来源的苦木素及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种植物来源的苦木素及其制备方法和应用 (Plant-derived quassin and preparation method and application thereof ) 是由 陈建军 高坤 岳建民 于 2021-01-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一个植物来源的苦木素及其制备方法和应用。该苦木素的制备方法如下：将常绿苦树叶子用乙醇浸泡提取,减压浓缩得粗浸膏；该提取物用大孔树脂、硅胶、凝胶及半制备的高效液相色谱柱分离,即得该化合物。该化合物对水稻纹枯病菌、西瓜尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、柑桔青霉、黄瓜疫霉菌等具有明显的抑制活性。因此,该化合物可作为一种新型的植物源抗菌候选药物。(The invention discloses a plant source quassin and a preparation method and application thereof. The preparation method of the quassin comprises the following steps: soaking and extracting evergreen bitter tree leaves with ethanol, and concentrating under reduced pressure to obtain crude extract; separating the extract with macroporous resin, silica gel, gel and semi-prepared high performance liquid chromatography column to obtain the compound. The compound has obvious inhibition activity on rhizoctonia solani, fusarium oxysporum, fusarium graminearum, penicillium citrinum, phytophthora cucumis and the like. Therefore, the compound can be used as a novel botanical antibacterial candidate drug.)
技术领域
本发明属于生物化工技术领域,具体涉及植物来源的苦木素及其制备方法和应用。
背景技术
农药是农业生产和农业经济发展中不可或缺的生产资料，是关系到全球粮食安全、食品安全、生态安全的重大战略物质。在防治农作物病虫草害的发生、保障农产品产量和质量、保障食品安全等方面具有不可忽视的作用。据统计，农药的使用每年可挽回世界农作物总产30％-40％的损失。我国生态条件复杂，耕作制度多样，属于有害生物多发、频发、重发的国家。每年我国受到病虫草害的作物种植总面积高达12190万公顷。因此，在过去几十年中，化学农药在防治农作物病虫草害、保障和提高粮食产量和质量、保障食品安全方面发挥着重要的作用。
然而，化学农药的长期不合理使用引起了一系列严重的环境和社会问题，如土壤板结酸化严重、抗药性增强、农残严重超标，生态平衡破坏、环境污染等一系列影响人们健康的隐患。特别是农药残留所致的“绿色技术壁垒”已成为当前限制我国农产品出口贸易的突出问题。因此，开发高生物活性、高选择性、低残留、易降解、无公害的绿色农药迫在眉睫。植物源农药因其有效成分为天然物质，且易分解为无毒物质、对环境无污染、难产生抗药性对有益生物安全等优点，使其成为绿色农药的一个重要的研究方向。
植物源农药按防治对象可以分为：植物源杀虫剂、植物源杀菌剂、植物源抗病毒剂、植物源除草剂等等。目前植物源杀虫剂是研究相对较成功的一类植物源农药，而且已有一些成熟的商品上市并应用与农业生产中。比如印楝素、皂素烟碱可溶性乳剂、鱼藤酮乳油、双素碱水剂、茴蒿素水剂、油酸烟碱等。但是，统计表明约85％的植物病害是由真菌引起的，如菌核病、镰刀菌、伪孢菌、布氏杆菌、疫霉、腐霉菌等。相对于植物源杀虫剂而言，植物源杀菌剂的研究要少得多，而且多数研究仅限于植物的提取物的抗菌活性，并没有一款真正用于农业生产中的植物源抗菌剂。因此研究开发新型植物源抗菌剂迫在眉睫。
常绿苦树(Picrasmajavanica)为苦木科苦木属常绿乔木，主要分布在亚洲热带地区，如印度尼西亚、印度和缅甸。在我国西双版纳、景东等地有大量分布。在民间其树皮的煎煮液可以作为奎宁的替代品治疗疟疾。在爪哇等地人们还概数的树叶榨汁治疗伤口。文献报道该植物的次级代谢产物主要是苦木素类化合物，且有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、神经保护等活性。但是关于苦木素类化合物抗植物病原真菌的活性未见报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供结构新颖的植物来源苦木素化合物Pj-1其结构式如下式所示：
本发明的目的之二是提供制备新颖苦木素化合物Pj-1的方法，其特征在于，该化合物是从常绿苦树的叶子中获得的，具体在于将常绿苦树的叶子粉碎，用乙醇(95％)浸泡得到浸出液，将浸出液减压蒸馏除去溶剂获得粗浸膏，将粗浸膏溶于50℃的热水中，然后用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取物，进而使用大孔树脂、硅胶、凝胶、及半制备的高效液相色谱柱分离，即得该化合物。包括以下步骤：
S1、将常绿苦树的叶子粉碎，用乙醇(95％)浸泡3次，每次7天，得到浸出液。
S2、将浸出液减压蒸馏除去溶剂，从而获得粗浸膏。
S3、将粗浸膏溶于50℃的热水中，然后用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取物。
S4、使用大孔树脂对乙酸乙酯萃取物进行分离，分别用30％、50％、80％、 95％乙醇作为流动相梯度洗脱，通过TLC分析最终得到4个组分Fre-1–Fre-4。
S5、将Fre-2使用正相硅胶柱色谱进行分离，用石油醚/丙酮的混合溶剂作为流动相进行梯度洗脱，体积比依次为50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，通过TLC 检测，将相似样品合并，得到7个组分Fre-2.1–Fre-2.7。
S6、将Fre-2.4使用Sephadex LH-20进行分离，用甲醇/氯仿＝1:1作为流动相进行等度洗脱，然后再用正相硅胶柱色谱进行分离，用氯仿/甲醇的混合溶剂作为流动相进行梯度洗脱，体积比依次为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，通过TLC检测，将相似样品合并，得到4个组分Fre-2.4.1–Fre-2.4.4。
S7、将Fre-2.4.4使用Sephadex LH-20进行分离，用甲醇/氯仿＝1:1作为流动相进行等度洗脱，然后再用高效液相色谱纯化，用甲醇/水＝43:57作为流动相进行等度洗脱，流速为2.0mL/分钟，得到目标化合物Pj-1,tR＝35.4min。
所述S7中半制备液相色谱的液相色谱仪为Waters 1525，流动相为甲醇-水，流速为2mL/min，检测器为Waters 2998光电二极管阵列检测器，检测波长为 200-400nm，色谱柱为Waters Sunfire C18半制备柱，规格为10×250mm。
本发明的目的之三是提供式化合物Pj-1具有好的抑制植物病原真菌作用以及在制备抗菌药物中的应用。
本发明的有益效果为：从常绿苦树(Picrasmajavanica)的叶子中分离得到一个苦木素类化合物。该化合物对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、西瓜尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumf.sp.Niveum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、柑桔青霉(Penicillium citrinum)、黄瓜疫霉菌(Phytophthora melonis)等具有显著的抑制活性。因此，该化合物可作为一种新型的植物源抗菌候选药物，并为常绿苦树资源的合理开发利用提供科学依据。
附图说明
图1为化合物Pj-1的1HNMR谱；
图2为化合物Pj-1的13CNMR谱；
图3为化合物Pj-1的HMBC谱；
图4为化合物Pj-1的IR谱；
图5为化合物Pj-1的HRESIMS谱；
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：
本发明所述的化合物Pj-1系从常绿苦树(Picrasmajavanica)的叶子中分离提取的，其提取过程如下：
将从西双版纳采集的常绿苦树叶子10kg粉碎后，用95％乙醇室温下浸泡提取3次，每次7天，减压浓缩得到总浸膏380g，将其溶于500C的热水中，然后用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取物。使用大孔树脂对乙酸乙酯萃取物进行分离，分别用30％、50％、80％、95％乙醇作为流动相梯度洗脱，通过TLC 分析最终得到4个组分Fre-1–Fre-4。将Fre-2使用正相硅胶柱色谱进行分离，用石油醚/丙酮的混合溶剂作为流动相进行梯度洗脱，体积比依次为50:1、20:1、10:1、 5:1、2:1、1:1，通过TLC检测，将相似样品合并，得到7个组分Fre-2.1–Fre-2.7。将Fre-2.4使用Sephadex LH-20进行分离，用甲醇/氯仿＝1:1作为流动相进行等度洗脱，然后再用正相硅胶柱色谱进行分离，用氯仿/甲醇的混合溶剂作为流动相进行梯度洗脱，体积比依次为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，通过TLC检测，将相似样品合并，得到4个组分Fre-2.4.1–Fre-2.4.4。将Fre-2.4.4使用Sephadex LH-20 进行分离，用甲醇/氯仿＝1:1作为流动相进行等度洗脱，然后再用高效液相色谱纯化，用甲醇/水＝43:57作为流动相进行等度洗脱，流速为2.0mL/分钟，得到目标化合物,tR＝35.4min。经过综合的波谱分析，确定该化合物为Pj-1。
实施例2
植物来源的苦木素化合物还可以是从常绿苦树的叶子、茎、树皮、树根等部位中得到。同时，还可以提出其它具有抗菌作用的苦木素分子，化合物Pj-2— Pj-5，但是经过试验比对Pj-1为最优化合物，化合物Pj-2—Pj-5结构式如下：
其它化合物制备方法为：
将从西双版纳采集的常绿苦树茎(或树皮、树根但是树叶为最优)10kg粉碎后，用95％乙醇室温下浸泡提取3次，每次7天，减压浓缩得到总浸膏380g，将其溶于50℃的热水中，然后用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取物。使用大孔树脂对乙酸乙酯萃取物进行分离，分别用30％、50％、80％、95％乙醇作为流动相梯度洗脱，通过TLC分析最终得到4个组分Fre-1–Fre-4。将Fre-2使用正相硅胶柱色谱进行分离，用石油醚/丙酮的混合溶剂作为流动相进行梯度洗脱，体积比依次为50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，通过TLC检测，将相似样品合并，得到7个组分Fre-2.1–Fre-2.7。将Fre-2.4使用Sephadex LH-20进行分离，用甲醇/氯仿＝1:1作为流动相进行等度洗脱，然后再用正相硅胶柱色谱进行分离，用氯仿/甲醇的混合溶剂作为流动相进行梯度洗脱，体积比依次为20:1、10:1、5:1、 2:1、1:1，通过TLC检测，将相似样品合并，得到4个组分Fre-2.4.1–Fre-2.4.4。将Fre-2.4.4使用Sephadex LH-20进行分离，用甲醇/氯仿＝1:1作为流动相进行等度洗脱，然后再用高效液相色谱纯化，用甲醇/水＝43:57作为流动相进行等度洗脱，流速为2.0mL/分钟，得到目标化合物Pj-1,tR＝35.4min。将Fre-2.4.2使用用高效液相色谱纯化，用甲醇/水＝35:65作为流动相进行等度洗脱，流速为2.0mL/ 分钟，得到目标化合物Pj-3(tR＝42.1min)和Pj-4(tR＝41.2min)。将Fre-2.4.3使用用高效液相色谱纯化，用甲醇/水＝40:60作为流动相进行等度洗脱，流速为2.0 mL/分钟，得到目标化合物Pj-2(tR＝35.4min)和Pj-5(tR＝37.32min)。经过综合的波谱分析，确定上述化合物的结构。
实施例3—活性测试
采用菌丝体生长抑制法对目标化合物进行体外抗真菌活性检测。具体方法如下：将用于测试的5株植物病原真菌接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上中，在培养箱中28℃下培养4天，得到生长旺盛的菌丝。分别将化合物Pj-1—Pj-5、多菌灵(阳性对照)溶解于DMSO-H2O(v:v＝1:1)中，再将其与马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基混合，最终得到50μg/mL的混合液。将上述混合液倒入6cm的无菌培养皿中，每个培养皿倒入6mL，制备成含测试化合物Pj-1—Pj-5或多菌灵的 PDA平板。将培养好的各病原菌的菌丝切成直径为5mm的小块，并将其放置在每一个含有测试化合物Pj-1—Pj-5或多菌灵的PDA平板中央，同时也将5mm的不同菌丝小块放在不含任何药物的PDA平板中央作为空白对照，每个实验设三次重复。将所有放置菌丝的PDA平板放置在培养箱中28℃恒温培养48小时。在加测试化合物Pj-1—Pj-5或多菌灵处理的(T)和空白对照的(C)培养皿中，分别用十字交叉法测量各个菌落的直径(mm)，并使用以下公式计算了抑制率(I)：I(％) ＝[(C-T)/C]×100。
表1.化合物Pj-1—Pj-5在50μg/mL时对5种植物病原真菌的抑制活性
表2.化合物Pj-1的NMR数据(600M,CDCl3)
化合物Pj-1的其它理化数据：无色油状物。IR(KBr)νmax3376, 2924,1721,1602,1383,1095,1044,792cm-1；HRESIMS m/z 417.1878[M+Na]+(calcdfor C21H30O7Na,417.1884)。
实验结果表明化合物Pj-1—Pj-5对5种被测植物病原真菌均具有一定的抑制作用。其中，化合物Pj-1对5种被测植物病原真菌的抑制作用最为显著，其抑制率范围为70.6％—82.9％。特别是Pj-1对西瓜尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumf. sp.Niveum)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的抑制活性比阳性对照药物多菌灵的活性要高。同时Pj-1对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、柑桔青霉 (Penicillium citrinum)以及黄瓜疫霉菌(Phytophthora melonis)的抑制活性与阳性对照药物多菌灵的抑制活性相当。这些结果表明Pj-1具有深入开发成植物源抗菌药物的潜力。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的内容和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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