火炭母胶囊治疗和／或预防急性肝损伤的应用

文档序号：753723 发布日期：2021-04-06 浏览：13次 >En<

阅读说明：本技术 火炭母胶囊治疗和／或预防急性肝损伤的应用 (Application of fire charcoal mother capsule in treatment and/or prevention of acute liver injury ) 是由朱华许立拔谢凤凤董雪静苏健王颖韦安达于 2021-02-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物应用领域,特别是火炭母胶囊治疗和/或预防急性肝损伤的应用。本发明所述火炭母胶囊对CCl4所致大鼠急性肝损伤有良好的治疗作用,可明显改善肝功能、氧化应激指标和细胞炎症因子水平,可明显减轻CCl4所致肝组织病理性损伤,有明显的护肝作用。(The invention relates to the field of medicine application, in particular to application of a fire charcoal mother capsule in treating and/or preventing acute liver injury. The Chinese knotweed capsule provided by the invention has a good treatment effect on acute liver injury of a rat caused by CCl4, can obviously improve liver function, oxidative stress indexes and levels of cell inflammatory factors, can obviously alleviate pathological liver tissue injury caused by CCl4, and has an obvious liver protection effect.)

火炭母胶囊治疗和/或预防急性肝损伤的应用

技术领域

本发明涉及药物应用领域，特别是火炭母胶囊治疗和/或预防急性肝损伤的应用。

背景技术

火炭母来源为蓼科蓼属植物火炭母(Polygonum chinense L.)的干燥全草，其性酸、甘、寒，归肝、脾经，具有清热除湿、凉血解毒、利肝明目、舒经活血的功效，主治泄泻，痢疾，肺热咳嗽，咽喉肿痛，肝炎、湿疹、中耳炎等，主要分布于福建、广西、广东等地。在广西民间火炭母及硬毛火炭母(Polygonum chinense L.var.hispidum Hook.f.)均作为壮药和瑶药使用，被《广西壮族自治区瑶药材质量标准第一卷》及《广西壮族自治区壮药质量标准第一卷》收载，可见火炭母在广西医药领域发挥了重要的作用。火炭母主要含有黄酮类及黄酮苷类、酚酸类、甾体类等化学成分，具有抗乙肝病毒、保肝、抗炎止痛、抗氧化、抗菌等药理作用。

广东省江门市新会区中医院用火炭母22kg，布渣叶22kg，锡叶藤22kg，青皮3.4kg，枇杷叶90kg，甘草5.0kg组方制成保和汤。张辰林等取火炭母100kg、扭肚藤100kg、车前草100kg、救必应67kg、石榴皮33kg等五味药材进行提取、沉罐、浓缩制成干膏，粉碎过100目筛，制成干膏粉，加入蔗糖粉，快速混合制粒，干燥，整粒，压片，包糖衣，分装，即得腹可安片。张嵩等还以火炭母、扭肚藤、救必应、车前草、石榴皮组方制成分散片。广州中医药大学第一附属医院用火炭母210g，党参105g等13味药材组方，经过磨粉、萃取、水煎等方法，制得稠膏，加入80g糊精，喷雾干燥，得干浸膏粉，混匀，制成颗粒，填充，即得肠激胺胶囊。临床上对火炭母药材的使用多为复方制剂，尚未见火炭母单方胶囊剂的使用，特别是火炭母胶囊治疗和/或预防急性肝损伤的应用的报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明提供一种火炭母胶囊对CCl₄所致大鼠急性肝损伤的治疗方法，可明显改善肝功能、氧化应激指标和细胞炎症因子水平，可明显减轻CCl4所致肝组织病理性损伤，有明显的护肝作用。

本发明所述火炭母来源为蓼科蓼属植物火炭母(Polygonum chinense L.)及硬毛火炭母(Polygonum chinense L.var.hispidum Hook.f.)的干燥全草。

本发明通过以下技术方案实现：

(1)动物模式建立：按体重给予等体积的0.5％CMC-Na，按10mL/kg灌胃，每天1次，连续灌胃14d。记录给药前、Day3、Day6、Day9、Day12、Day13和Day14，称重1次。给药Day13，正常组大鼠按5mL/kg腹腔注射给予橄榄油，其余大鼠按5mL/kg腹腔注射给予12％CCl4橄榄油药液。

(2)肝功能指标检测：造模后，禁食不禁水22h～24h，末次药后1h，采用眼眶后静脉丛采血约3mL，静置1h～2h后，3000rpm，离心10min，收集上清液，检测血清ALT、AST、GGT、ALB、TP和TBIL水平，用于肝功能指标检测；

(3)氧化应激指标检测：按3mL/kg剂量腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)麻醉，腹主动脉采血，3000rpm，离心10min，收集上清液，使用ELISA法检测IL-1β，IL-6，IL-10，TNF-α和TGF-β水平。

(4)炎症因子指标检测：取血清样品或肝组织匀浆上清液，检测其SOD、MDA、GSH、GSH-PX、CAT和NO水平。

(5)试验大鼠脏器重量和脏器系数检测：采血结束，剪断腹主动脉急性失血法处死大鼠，迅速分离肝脏、脾脏和胸腺，称重，计算脏器系数(g/100g)。脏器系数＝100×(脏器重量/体重)。

(6)试验大鼠病理学检查：观察肝组织颜色、质地、大小等变化，记录并拍照。分离肝脏左上叶，置于10％福尔马林溶液中固定，6h后更换新鲜10％福尔马林溶液1次，固定24h以后，制备病理片，经苏木素-伊红染色(HE染色)，光镜下观察组织病理学改变。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明提供的火炭母胶囊对CCl₄所致急性肝损伤，在检测的肝功能指标中，火炭母胶囊低剂量组AST、GLOB，中高剂量ALT、AST、TBIL、GLOB和GGT水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，而低中高剂量ALB、A/G和中剂量组TP水平均显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，可见火炭母胶囊对大鼠肝功能指标具有明显的改善作用。

2.本发明提供的火炭母胶囊能提高大鼠血清、肝组织SOD及肝组织CAT水平，降低血清、肝组织MDA及血清NO水平，对大鼠血清及肝组织氧化应激指标具有明显的改善作用。

3.本发明提供的火炭母胶囊能降低大鼠血清、肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平，对大鼠血清及肝组织炎症因子指标具有明显的改善作用。

4.本发明提供的火炭母胶囊能降低大鼠肝脏肿胀度，减少肝组织黄白色颗粒，可不同程度的改善CCl4所致的肝脏病理学改变，其中以高剂量作用最佳。

附图说明

图1为火炭母胶囊对CCl₄所致急性肝损伤大鼠肝脏病理改变肉眼检查。

图2为HE染色观察火炭母胶囊对CCl₄所致急性肝损伤大鼠肝脏病理改变。

具体实施方式

实施例1 CCl₄所致急性肝损伤模型建立

1.实验动物

由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004，实验动物质量合格证号：1107272011003888。

2.试剂

火炭母胶囊，广西壮瑶药重点实验室，1次4粒，1天3次，1粒胶囊含0.28g浸膏和0.1g辅料，1g浸膏＝8.88g生药，内容物为棕褐色粉末；羧甲基纤维素钠，国药集团化学试剂有限公司，批号：20151215；大鼠白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)和谷胱甘肽(GSH)ELISA试剂盒，江苏酶免实业有限公司，批号均为202006；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号分别为20200923、20200715和20200814；BCA蛋白法含量试剂盒，上海北沪生物科技有限公司，批号：20200619；谷丙转氨酶(ALT)试剂盒，上海科华生物工程股份有限公司，批号：20200422；谷氨酰转移酶(GGT)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号：92638110；总胆红素(TBIL)试剂盒，北京利德曼生化股份有限公司，批号：19112708；白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)和谷草转氨酶(AST)试剂盒，浙江伊利康生物技术有限公司，批号分别为200301、200401和200401；水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司，批号：20160225；四氯化碳(CCl₄)，上海麦克林生化科技有限公司，批号：C11136534；橄榄油，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：E202108等。

3.仪器

MH-693型电子天平，东莞市明衡电子科技有限公司；ES 2220M型电子天平，瑞士普利赛斯公司；0104型生物安全型独立通风笼具(IVC笼)，深圳市泓腾生物科技有限公司；5810R型高速冷冻离心机，德国艾本德公司；Epoch2型酶标仪，美国Bio-Tek Instruments公司；TENLIN-C型匀浆仪，江苏天翎仪器有限公司；MDF-U74V型-80℃冰箱，日本Panasonic公司；Direct-Q 5 UV-R型超纯水仪，美国默克密理博公司；DHG-9240A型鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；7180型全自动生化分析仪，日本HITACHI公司等。

4.饲养环境

饲养于广西中医药大学实验动物中心屏障环境，符合SPF级要求，实验动物使用许可证号为SYXK(桂)2019-0001。使用中央空调，室温控制在19.0℃～25.0℃，相对湿度控制在40.0％～70.0％，照明明暗控制为12h/12h；大鼠饲养在无毒、耐高压、耐高温、耐腐蚀的IVC塑料笼盒中，不超过6只/笼，饲喂SPF级大鼠维持饲料，自由摄食、饮用纯净水。

5.方法

选取健康SD大鼠60只，按体重使用Excel软件区组分层随机分组法随机分为6组^[1]，每组10只，分别为正常组、模型组、水飞蓟素组(120mg/kg)^[2]、火炭母胶囊低、中、高剂量组(240、479和958mg/kg)。火炭母胶囊剂量组按体重给予相应浓度的火炭母醇提物药液；水飞蓟素组按体重给予相应浓度的水飞蓟素药液；模型组、正常组按体重给予等体积的0.5％CMC-Na，按10mL/kg灌胃，每天1次，连续灌胃14d。记录给药前、Day₃、Day₆、Day₉、Day₁₂、Day₁₃和Day₁₄，称重1次，给药Day₁₃，正常组大鼠按5mL/kg腹腔注射给予橄榄油，其余大鼠按5mL/kg腹腔注射给予12％CCl₄橄榄油药液^[2]。

5.1采血

造模后，禁食不禁水22h～24h，，末次药后1h，采用眼眶后静脉丛采血约3mL，静置1h～2h后，3000rpm，离心10min，收集上清液，用于肝功能指标检测；按3mL/kg剂量腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)麻醉，腹主动脉采血，3000rpm，离心10min，收集上清液，用于氧化应激指标和炎症因子指标检测。

5.2取材及病理检查

采血结束，剪断腹主动脉急性失血法处死大鼠，迅速分离肝脏、脾脏和胸腺，称重，计算脏器系数(g/100g)。脏器系数＝100×(脏器重量/体重)。

观察肝组织颜色、质地、大小等变化，记录并拍照。分离肝脏左上叶，置于10％福尔马林溶液中固定，6h后更换新鲜10％福尔马林溶液1次，固定24h以后，制备病理片，经苏木素-伊红染色(HE染色)，光镜下观察组织病理学改变。

分离肝脏左下叶，同一部位取材肝组织约300mg，按肝重量∶体积＝1∶9加入冰生理盐水，剪碎，使用均质仪制成10％肝组织匀浆，3000rpm，离心10min，收集上清液。采用BCA法检测肝组织匀浆上清液蛋白水平(ug/mL)，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

5.3肝功能指标使用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、GGT、ALB、TP和TBIL水平。

5.4细胞炎症因子指标取血清样品或肝组织匀浆上清液，使用ELISA法检测IL-1β，IL-6，IL-10，TNF-α和TGF-β水平。

5.5氧化应激指标取血清样品或肝组织匀浆上清液，检测其SOD、MDA、GSH、GSH-PX、CAT和NO水平。

6.数据统计使用SPSS17.0统计，以形式表示，当P＜0.05则认为数据差异有统计学意义；计量数据，符合正态分布和方差齐性，采用单因素方差检验分析，使用LSDTest进行两两比较分析；若数据非正态或方差不齐，采用Kruskal-Wallis H Test分析，使用Mann-Whitney U test进行两两比较分析。

实施例2火炭母胶囊抗急性肝损伤的药效试验

1.体重

与正常组比较，模型组大鼠体重、体重增长及体重总增长未见明显差异(P＞0.05)；与模型组比较，试验期间，火炭母胶囊各剂量组体重和体重增长差异不具显著性(P＞0.05)；D₆，水飞蓟素组、火炭母各剂量组体重增长显著增加(P＜0.05或P＜0.01)，其它时间点体重增长及体重总增长均差异不具显著性(P＞0.05)，故认为火炭母胶囊对大鼠体重无明显影响，详见表1～表4。

表1火炭母胶囊对CCl₄致急性肝损伤大鼠体重的影响

Table.1 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight ofacute liver injury rats induced by CCl₄

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01，低剂量组D3、D6动物数n＝9。

表2火炭母胶囊对CCl₄致急性肝损伤大鼠体重的影响

Table.2 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight ofacute liver injury rats induced by CCl₄

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表3火炭母胶囊对CCl₄致急性肝损伤大鼠体重增长的影响

Table.3 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight gain ofacute liver injury rats induced by CCl₄

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表4火炭母胶囊对CCl₄致急性肝损伤大鼠体重增长的影响

Table.4 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight gain ofacute liver injury rats induced by CCl₄

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

2.脏器重量和脏器系数

各组间脾、胸腺重及系数差异均不具显著性(P＞0.05)；与正常组比较，模型组大鼠肝重及系数均显著增加(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠肝重及系数均减少，其中肝系数差异具有显著性(P＜0.05)；火炭母各剂量组大鼠肝重及系数均显著减少(P＜0.05或P＜0.01)，故认为CCl₄对大鼠脾、胸腺重及系数无明显影响，但可导致大鼠肝重量及系数增加，而火炭母胶囊对大鼠肝重量及系数有明显改善作用，详见表5、表6。

表5火炭母胶囊对CCl₄致急性肝损伤大鼠脏器重量的影响

Table.5 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson organ weight ofacute liver injury rats induced by CCl₄

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

表6火炭母胶囊对CCl₄致急性肝损伤大鼠脏器系数的影响

Table.6 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson organ indexes ofacute liver injury rats induced by CCl₄

注：与模型组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

3.肝功能指标

与正常组比较，模型组大鼠肝功能指标ALT、AST、TBIL、GLOB和GGT水平均显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，而ALB、TP和A/G水平均显著降低(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠肝功能指标ALT、AST、TBIL、GLOB和GGT水平均降低，其中ALT、AST和GGT水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，而ALB、TP和A/G水平显著升高(P＜0.05或P＜0.01)；火炭母各剂量组大鼠肝功能指标ALT、AST、TBIL、GLOB和GGT水平均降低，而ALB、TP和A/G水平均升高。其中低剂量组AST、GLOB，中高剂量ALT、AST、TBIL、GLOB和GGT水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，而低中高剂量ALB、A/G和中剂量组TP水平均显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，故认为CCl₄可导致大鼠肝功能指标异常改变，而火炭母胶囊对大鼠肝功能指标具有明显的改善作用，详见表7、表8。

表7火炭母胶囊对CCl₄致急性肝损伤大鼠肝功能指标的影响

Table.7 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver functionindexes of acute liver injury rats induced by CCl₄