一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法
阅读说明：本技术 一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法 (Method for preparing chitosan from shells of crustaceans ) 是由 范芳芳 刘北辰 刘运江 张香梅 赵继东 李兵 于 2020-12-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法,包括如下步骤：S1：脱蛋白：以1-12ml：1g(w/v)的比例添加0.5-2mol/L NaOH和虾壳粉,混匀,在60-80℃下反应10-30min,进行去蛋白作用,收集固体产物,并用蒸馏水洗涤,将固体产物真空干燥,并用分析天平进行称重；S2：脱盐：将S1干燥后的固体产物在室温下,以14ml：1g(w/v)的比例,用1-10％HCl溶液在500ml烧杯中进行脱盐处理,抽滤收集固体产物,并用蒸馏水对固体产物洗涤,然后对固体产物进行干燥；S3：脱乙酰：在室温下用比例为14ml：1g(w/v)的20-40％NaOH处理S2得到产品20-80h。本发明制备的壳聚糖止血材料具有优异的抗菌、止血、止痛功效,且能促进缺损组织修复,防粘连效果好,满足生物相容性、无抗原性,使用安全。(The invention discloses a method for preparing chitosan by using crustacean shells, which comprises the following steps: s1: deproteinization: mixing 1-12 ml: adding 0.5-2mol/L NaOH and shrimp shell powder into 1g (w/v), mixing uniformly, reacting at 60-80 ℃ for 10-30min, removing protein, collecting solid product, washing with distilled water, vacuum drying the solid product, and weighing with an analytical balance; s2: desalting: the dried solid product of S1 was mixed at room temperature with 14 ml: desalting with 1-10% HCl solution at a ratio of 1g (w/v) in 500ml beaker, collecting solid product by suction filtration, washing the solid product with distilled water, and drying the solid product; s3: deacetylation: at room temperature with a ratio of 14 ml: 1g (w/v) of 20-40% NaOH is used for treating S2 to obtain the product for 20-80 h. The chitosan hemostatic material prepared by the invention has excellent antibacterial, hemostatic and analgesic effects, can promote the repair of defective tissues, has a good anti-adhesion effect, meets biocompatibility, has no antigenicity, and is safe to use.)
技术领域
本发明涉及医疗制药技术领域，具体为一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法。
背景技术
甲壳类动物的外壳富含几丁质，几丁质脱乙酰基产生一种壳聚糖，是一种D葡萄糖-吡喃糖单元的共聚物，它可以在人体中降解，有免疫、抗菌、促进伤口愈合的作用，广泛应用于食品和医疗制药等领域。
螃蟹，虾和龙虾，以及海洋浮游植物的外骨骼，包括珊瑚和水母都包含丰富的几丁质，使用不同浓度的NaOH可以对各种来源的甲壳素进行提取，并通过不同程度的去乙酰化转化为壳聚糖，由于壳聚糖在酸性水性介质中具有良好的溶解性，因此可以在工业领域找到各种应用，它的溶解度是由于乙酰化程度，分子量以及乙酰基和氨基在链上的分布所致，同样，当氨基为阳离子形式时，壳聚糖具有抗菌活性，这意味着在低pH值下壳聚糖的抗菌活性更高，壳聚糖对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有广谱抗菌活性，本研究的目的是从虾壳废料中制备具有不同脱乙酰度的低海岸壳聚糖，并将其用作许多应用的关键材料。
创伤型出血是日常生活难以避免的，交通事故、自然灾害以及战争等造成的严重的出血更有可能危害生命，如果发生出血事件后30分钟内可以有效止血，大约可以避免40％的不必要死亡，但是传统止血材料在快速止血方面存在一定不足，因此寻找止血快、产能高、生物相容性好的止血材料越来越受到人们的重视，壳聚糖具有抑菌止血的功能，其促愈合能力和降解性也非常好，以各种生物质为来源的壳聚糖制备逐渐成为研究热点，因此，本领域技术人员提供了一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：
S1：脱蛋白：以1-12ml：1g(w/v)的比例添加0.5-2mol/L NaOH和虾壳粉，混匀，在60-80℃下反应10-30min，进行去蛋白作用，收集固体产物，并用蒸馏水洗涤，将固体产物真空干燥，并用分析天平进行称重；
S2：脱盐：将S1干燥后的固体产物在室温下，以14ml：1g(w/v)的比例，用1-10％HCl溶液在500ml烧杯中进行脱盐处理，抽滤收集固体产物，并用蒸馏水对固体产物洗涤，然后对固体产物进行干燥；
S3：脱乙酰：在室温下用比例为14ml：1g(w/v)的20-40％NaOH处理S2得到产品20-80h，过滤去乙酰化的固体，收集产物，并用蒸馏水洗涤，对产物进行真空干燥，得到壳聚糖止血材料。
优选的，所述S2中脱盐处理时间为4h，且在HCl中浸泡至虾壳完全软化。
优选的，所述S2中脱盐处理采用3％的HCl，且脱盐温度和时间分别为30℃和18h。
优选的，所述S3中壳聚糖止血材料用紫外灯照射灭菌20min后，以聚乙烯袋封装常温下保存。
优选的，所述S1脱蛋白时采用5％的NaOH溶液浸洗脱去蛋白质，且浸洗温度和浸洗时间分别为85℃和4h。
优选的，所述蒸馏水洗涤的温度为80℃，且洗涤时间为2h，浴比为1:40。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明制备的壳聚糖止血材料具有优异的抗菌、止血、止痛功效，且能促进缺损组织修复，防粘连效果好，满足生物相容性、无抗原性，使用安全，制备方法简单。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：S1：脱蛋白：以5ml：1g(w/v)的比例添加0.5mol/L NaOH和虾壳粉，混匀，在60℃下反应10min，进行去蛋白作用，收集固体产物，并用蒸馏水洗涤，将固体产物真空干燥，并用分析天平进行称重；S2：脱盐：将S1干燥后的固体产物在室温下，以14ml：1g(w/v)的比例，用3％HCl溶液在500ml烧杯中进行脱盐处理，抽滤收集固体产物，并用蒸馏水对固体产物洗涤，然后对固体产物进行干燥；S3：脱乙酰：在室温下用比例为14ml：1g(w/v)的20％NaOH处理S2得到产品20h，过滤去乙酰化的固体，收集产物，并用蒸馏水洗涤，对产物进行真空干燥，得到壳聚糖止血材料。
实施例2
一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：S1脱盐：在室温下，将2％HCl和虾壳粉以14ml：1g(w/v)的比例进行脱盐处理12h，在自来水下将产物洗涤至中性，收集固体并用蒸馏水洗涤，然后真空干燥；S2脱蛋白：在90℃下，将5％NaOH按照12ml：1g(w/v)的比例和S1收集的固体混合后进行脱蛋白处理12h，收集去蛋白产物并用蒸馏水洗涤；S3脱乙酰：产物在室温下用将60％NaOH和步骤2收集的产物按照14ml：1g(w/v)的比例混合进行脱乙酰50h，收集固体，并用蒸馏水洗涤，然后将脱乙酰基的产物在真空中干燥。
实施例3
一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：S1：脱蛋白：以5ml：1g(w/v)的比例添加2mol/L NaOH和虾壳粉，混匀，在80℃下反应30min，进行去蛋白作用，收集固体产物，并用蒸馏水洗涤，将固体产物真空干燥，并用分析天平进行称重；S2：脱盐：将S1干燥后的固体产物在室温下，以14ml：1g(w/v)的比例，用5％HCl溶液在500ml烧杯中进行脱盐处理，抽滤收集固体产物，并用蒸馏水对固体产物洗涤，然后对固体产物进行干燥；S3：脱乙酰：在室温下用比例为14ml：1g(w/v)的30％NaOH处理S2得到产品50h，过滤去乙酰化的固体，收集产物，并用蒸馏水洗涤，对产物进行真空干燥，得到壳聚糖止血材料。
实施例4
一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：S1脱盐：在室温下，将10％HCl和虾壳粉以14ml：1g(w/v)的比例进行脱盐处理16h，在自来水下将产物洗涤至中性，收集固体并用蒸馏水洗涤，然后真空干燥；S2脱蛋白：在90℃下，将9％NaOH按照12ml：1g(w/v)的比例和步骤一收集的固体混合后进行脱蛋白处理18h，收集去蛋白产物并用蒸馏水洗涤；S3脱乙酰：产物在室温下用将70％NaOH和步骤2收集的产物按照14ml：1g(w/v)的比例混合进行脱乙酰80h，收集固体，并用蒸馏水洗涤，然后将脱乙酰基的产物在真空中干燥。
实施例5
一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：S1：脱蛋白：以8ml：1g(w/v)的比例添加1mol/L NaOH和虾壳粉，混匀，在60℃下反应10min，进行去蛋白作用，收集固体产物，并用蒸馏水洗涤，将固体产物真空干燥，并用分析天平进行称重；S2：脱盐：将S1干燥后的固体产物在室温下，以14ml：1g(w/v)的比例，用8％HCl溶液在500ml烧杯中进行脱盐处理，抽滤收集固体产物，并用蒸馏水对固体产物洗涤，然后对固体产物进行干燥；S3：脱乙酰：在室温下用比例为14ml：1g(w/v)的35％NaOH处理S2得到产品40h，过滤去乙酰化的固体，收集产物，并用蒸馏水洗涤，对产物进行真空干燥，得到壳聚糖止血材料。
实施例6
一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：S1脱盐：在室温下，将2％HCl和虾壳粉以14ml：1g(w/v)的比例进行脱盐处理15h，在自来水下将产物洗涤至中性，收集固体并用蒸馏水洗涤，然后真空干燥；S2脱蛋白：在90℃下，将3％NaOH按照12ml：1g(w/v)的比例和步骤一收集的固体混合后进行脱蛋白处理18h，收集去蛋白产物并用蒸馏水洗涤；S3脱乙酰：产物在室温下用将75％NaOH和步骤2收集的产物按照14ml：1g(w/v)的比例混合进行脱乙酰80h，收集固体，并用蒸馏水洗涤，然后将脱乙酰基的产物在真空中干燥。
实施例7
一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：S1：脱蛋白：以10ml：1g(w/v)的比例添加02mol/L NaOH和虾壳粉，混匀，在65℃下反应15min，进行去蛋白作用，收集固体产物，并用蒸馏水洗涤，将固体产物真空干燥，并用分析天平进行称重；S2：脱盐：将S1干燥后的固体产物在室温下，以14ml：1g(w/v)的比例，用4％HCl溶液在500ml烧杯中进行脱盐处理，抽滤收集固体产物，并用蒸馏水对固体产物洗涤，然后对固体产物进行干燥；S3：脱乙酰：在室温下用比例为14ml：1g(w/v)的30％NaOH处理S2得到产品70h，过滤去乙酰化的固体，收集产物，并用蒸馏水洗涤，对产物进行真空干燥，得到壳聚糖止血材料。
实施例8
一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：S1脱盐：在室温下，将6％HCl和虾壳粉以14ml：1g(w/v)的比例进行脱盐处理20h，在自来水下将产物洗涤至中性，收集固体并用蒸馏水洗涤，然后真空干燥；S2脱蛋白：在90℃下，将7％NaOH按照12ml：1g(w/v)的比例和步骤一收集的固体混合后进行脱蛋白处理23h，收集去蛋白产物并用蒸馏水洗涤；S3脱乙酰：产物在室温下用将60％NaOH和步骤2收集的产物按照14ml：1g(w/v)的比例混合进行脱乙酰50h，收集固体，并用蒸馏水洗涤，然后将脱乙酰基的产物在真空中干燥。
实施例9
一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：脱蛋白：以1-12ml：1g(w/v)的比例添加0.5-2mol/L NaOH和虾壳粉，混匀，在60-80℃下反应10-30min，进行去蛋白作用，收集固体产物，并用蒸馏水洗涤，将固体产物真空干燥，并用分析天平进行称重；S2：脱盐：将S1干燥后的固体产物在室温下，以14ml：1g(w/v)的比例，用1-10％HCl溶液在500ml烧杯中进行脱盐处理，抽滤收集固体产物，并用蒸馏水对固体产物洗涤，然后对固体产物进行干燥；S3：脱乙酰：在室温下用比例为14ml：1g(w/v)的20-40％NaOH处理S2得到产品20-80h，过滤去乙酰化的固体，收集产物，并用蒸馏水洗涤，对产物进行真空干燥，得到壳聚糖止血材料。
实施例10
一种用甲壳类动物外壳制备壳聚糖的方法，包括如下步骤：S1脱盐：在室温下，将2％HCl和虾壳粉以14ml：1g(w/v)的比例进行脱盐处理16h，在自来水下将产物洗涤至中性，收集固体并用蒸馏水洗涤，然后真空干燥；S2脱蛋白：在90℃下，将9％NaOH按照12ml：1g(w/v)的比例和步骤一收集的固体混合后进行脱蛋白处理12h，收集去蛋白产物并用蒸馏水洗涤；S3脱乙酰：产物在室温下用将65％NaOH和步骤2收集的产物按照14ml：1g(w/v)的比例混合进行脱乙酰50h，收集固体，并用蒸馏水洗涤，然后将脱乙酰基的产物在真空中干燥。
Cpd.No
％C
％H
％N
％DD
％NaoH
Cs1
40.66
5.75
6.65
6.917
35
Cs1
28.90
3.70
5.51
90.4
50
表1壳聚糖的元素分析、脱乙酰度和脱乙酰基度(DD)
壳聚糖止血材料的伤口愈合试验
实验原料如下：壳聚糖止血材料、医用纱布以及小鼠。
实验步骤如下：
(1)选用成年健康雌性小鼠6只，试验前24h将小鼠背部脊椎两侧脱毛，完全露出皮肤，注意在剃毛过程中不要弄伤皮肤，在去毛区脊柱的左右两侧各选2个面积为3cm*3cm的试验区，分别作为壳聚糖止血材料组及明胶海绵对照组试验区，用70％乙醇进行消毒，将样品剪成相应大小备用：壳聚糖复合止血材料2cm*2cm；医用纱布3cm*3cm；
(2)烫伤前采用开放式吸入法对受试小鼠进行麻醉，将5层医用纱布覆盖在小鼠的口鼻上，缓慢的逐滴加少量乙醚在纱布上，直至小鼠不再挣扎且呼吸平稳，将底面积大小一定的平底试管放入99℃恒温水浴锅中进行加热，l0min后取出，立即贴合于小鼠脊柱两侧的试验区进行烫伤，注意避开骼骨和肩脚骨，以试管底部接触小鼠皮肤开始计时，烫伤时间为30s，每只小鼠一侧制备两个烫伤创面；
(3)将小鼠各侧随机分为壳聚糖止血材料试验组和空白对照组，在试验组烫伤创面上敷加以壳聚糖止血材料，再在壳聚糖止血材料外覆盖医用纱布加以固定，在空白对照组烫伤创面上直接覆盖医用纱布后加以固定，隔天换置一次敷加的样品纱布。
实验结果与分析：
表2不同时间的伤口面积及伤口愈合率
从表2可以看到敷加了壳聚糖止血材料及未敷加样品的两组烫伤创面在3d，7d，14d及21d时的创面面积及愈合率的变化情况，原始创面面积为烫伤试验中试管底部的面积，愈合率为0.21d后，敷加了壳聚糖止血材料的创面面积缩小到了19平方毫米左右，愈合率达到了96.07％；未敷加样品的空白组创面面积仅减小为163平方毫米左右，愈合率仅为67.34％，可见壳聚糖止血材料对小鼠烫伤模型的伤口促愈合作用是十分明显的。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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