一种基于苯并噁嗪可视有机分子比率型荧光探针及其制备方法和细胞成像应用
阅读说明:本技术 一种基于苯并噁嗪可视有机分子比率型荧光探针及其制备方法和细胞成像应用 (Benzoxazine-based visible organic molecule ratio type fluorescent probe, preparation method thereof and cell imaging application ) 是由 王素华 彭俊翔 陈宏霞 余龙 孙明泰 余欢 于 2020-12-11 设计创作,主要内容包括:本发明公开了一种基于苯并噁嗪可视有机分子比率型荧光探针及其制备方法和应用,本发明提供的荧光探针能够用来检测溶液pH值的变化,在pH变化范围为1.8-5.8内,加入本发明的荧光探针的溶液在自然光下或紫外灯下都能看出明显的比率颜色变化;本发明通过建立荧光强度和溶液pH值的拟合曲线关系,可以快速实现对溶液pH值的实时检测;本发明的荧光探针选择性好,灵敏度高,斯托克斯位移大且细胞毒性低,检测方法简便且效果明显。(The invention discloses a benzoxazine-based visible organic molecule ratio type fluorescent probe and a preparation method and application thereof, the fluorescent probe provided by the invention can be used for detecting the change of the pH value of a solution, and the solution added with the fluorescent probe can show obvious ratio color change under natural light or an ultraviolet lamp within the pH change range of 1.8-5.8; according to the invention, the real-time detection of the pH value of the solution can be rapidly realized by establishing the fitting curve relationship between the fluorescence intensity and the pH value of the solution; the fluorescent probe has the advantages of good selectivity, high sensitivity, large Stokes shift, low cytotoxicity, simple and convenient detection method and obvious effect.)
技术领域
本发明属于荧光光谱检测分析
技术领域
,特别涉及一种基于苯并噁嗪可视有机分子比率型荧光探针、其制备方法及其细胞成像应用。背景技术
细胞内的pH稳态在各种生物过程中起关键作用,比如离子转运,细胞吞噬,细胞增殖和凋亡以及耐药性等。细胞的细胞器具有不同的pH分布,例如,溶酶体和内体的细胞环境呈酸性,pH值为4.5-6.8,而胞质和线粒体则呈弱碱性,pH值为6.8-8.0。也就是说,异常的细胞pH也反映了生理功能发生不正常的变化。因此,对细胞内pH值波动的实时检测对研究各种细胞pH变化在生物学和病理学中的作用和理解具有至关重要的作用。
荧光探针技术凭借其易于可视化,灵敏度高和选择性好而被用来作为生物成像的一种重要手段。近年来,越来越多基于有机分子的荧光探针被设计出来,它们以优异的选择性和生物相容性被用于细胞内外环境的检测并且均表现出了独特的优势。然而,单纯的打开型和猝灭型荧光探针在对pH进行定性检测时通常很容易受到环境因素的影响,例如光程长度和温度变化,激发强度的改变等因素。因此,设计一种选择性好,灵敏度高的荧光探针实时检测pH变化是代替单一型荧光探针的一种好方法。
文献Nikolai I.Georgiev,Vladimir B.Bojinov,Peter S.Nikolov.The design,synthesis and photophysical properties of two novel 1,8-naphthalimidefluorescent pH sensors based on PET and ICT.Dyes and Pigments 2011,88,350-357.提出了用1,8-萘二甲酰亚胺染料及其缩合的杂环衍生物设计了两种pH荧光探针,对溶液中的pH波动进行实时检测。但是,这两种比率探针的斯托克斯位移较小,且其中一种探针属于单一型荧光探针,很容易受到环境因素的干扰。
鉴于上述原因,亟需研究一种选择性好,灵敏度高和生物相容性好的荧光探针用于实时检测pH变化。
发明内容
为了克服上述问题,本发明人进行了锐意研究,研究出一种基于苯并噁嗪可视有机分子比率型荧光探针及其制备方法和应用,本发明提供的荧光探针能够用来检测溶液pH值的变化,在pH变化范围为1.8-5.8内,加入本发明的荧光探针的溶液在自然光下或紫外灯下都能看出明显的比率颜色变化;本发明通过建立荧光强度和溶液pH值的拟合曲线关系,可以快速实现对溶液pH值的实时检测;本发明的荧光探针选择性好,灵敏度高,斯托克斯位移大且细胞毒性低,检测方法简便且效果明显,从而完成了本发明。
具体来说,本发明的目的在于提供以下方面:
第一方面,提供了一种基于苯并噁嗪可视有机分子比率型荧光探针,所述荧光探针包括6-甲氧基-2-萘甲醛荧光基团和苯并噁嗪基团。
其中,所述荧光探针包括具有如下式II所示结构的化合物:
第二方面,提供了一种基于苯并噁嗪可视有机分子比率型荧光探针的制备方法,优选如第一方面所述的荧光探针的制备方法,所述方法包括:
步骤1,制备如下式Ⅰ所示结构的化合物:
步骤2,制备基于苯并噁嗪可视有机分子比率型荧光探针。
其中,步骤1包括以下步骤:
步骤1-1,在反应器中投料,进行反应;
步骤1-2,对步骤1-1所得反应液进行处理。
其中,在步骤1-1中,投入的料包括吲哚类化合物、酚类化合物、腈类化合物。
其中,
所述吲哚类化合物包括2-甲基吲哚、3-甲基吲哚、2,3,3-三甲基吲哚、1-丁基-2-甲基吲哚中的任意一种或几种,优选为2,3,3-三甲基吲哚;
所述酚类化合物包括4-丙基苯酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2-羟基-5-硝基苄溴、2-甲基-5-异丙基苯酚中的任意一种或几种,优选为2-羟基-5-硝基苄溴;
所述腈类化合物包括甲基丙烯腈、己二腈、乙腈、丙二腈中的任意一种或几种,优选为乙腈。
其中,步骤2包括以下步骤:
步骤2-1,将步骤1所得化合物Ⅰ与醛类化合物溶于有机溶剂,并加入酸;
步骤2-2,对步骤2-1反应进行后处理。
其中,所述醛类化合物包括中己醛丙二缩醛、甲基乙二醛、6-甲氧基-2-萘甲醛的任意一种或几种,优选为6-甲氧基-2-萘甲醛。
第三方面,提供了一种根据第一方面所述的荧光探针或第二方面所述的方法得到的荧光探针在可视化实时检测溶液pH方面的应用。
第四方面,提供了一种根据第一方面所述的荧光探针或第二方面所述的方法得到的荧光探针在在细胞成像方面的应用。
本发明所具有的有益效果包括:
(1)本发明提供的有机分子比率型荧光探针实时检测溶液pH的变化,加入探针后的溶液在紫外光下就可以看到荧光颜色的明显变化,实现溶液pH的定性检测;通过建立荧光强度比率值和溶液pH的拟合曲线关系,定量检测溶液实时pH。
(2)本发明提供的有机分子比率型荧光探针在检测活细胞中pH时,生物相容性好,操作快捷,不需要复杂仪器,成本低廉。
(3)本发明提供的有机分子比率型荧光探针能够避免选择性好,抗干扰性强,可以有效避免细胞内外环境中诸多影响因素的干扰;检测步骤简便,响应速率快,检测效果好。
附图说明
图1示出实验例2荧光探针在不同pH缓冲液中的荧光光谱图以及可视化照片;
图2示出实验例2荧光探针在不同pH缓冲液中荧光强度比率值(F575/F430)和pH之间的曲线关系图;
图3示出实验例3荧光探针加入不同浓度H+后的荧光光谱图;
图4示出实验例4荧光探针加入不同浓度OH-后的荧光光谱图;
图5示出实验例5荧光探针在HeLa细胞内处于不同pH环境下的细胞成像照片。
具体实施方式
下面通过附图、实施例和实验例对本发明进一步详细说明。通过这些说明,本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。尽管在附图中示出了实施例的各种方面,但是除非特别指出,不必按比例绘制附图。
本发明的第一方面,目的在于提供一种基于苯并噁嗪可视有机分子比率型荧光探针,所述荧光探针包括6-甲氧基-2-萘甲醛荧光基团和苯并噁嗪基团。
在一种优选实施方式中,所述荧光探针包括具有如下式II所示结构的化合物:
本发明的第二方面,目的在于提供一种基于苯并噁嗪可视有机分子比率型荧光探针的制备方法,优选如第一方面所述的荧光探针的制备方法,所述方法包括:
步骤1,制备如下式Ⅰ所示结构的化合物:
在一种优选实施方式中,所述步骤1包括以下步骤:
步骤1-1,在反应器中投料,进行反应。
在步骤1-1中,投入的料包括吲哚类化合物、酚类化合物、腈类化合物。
在步骤1-1中,所述吲哚类化合物包括2-甲基吲哚、3-甲基吲哚、2,3,3-三甲基吲哚、1-丁基-2-甲基吲哚中的任意一种或几种,优选为2,3,3-三甲基吲哚。
根据本发明,吲哚类化合物氮上的孤对电子为开环反应提供驱动力,优选2,3,3-三甲基吲哚为吲哚类化合物,开环反应有较好的稳定性。
在步骤1-1中,所述酚类化合物包括4-丙基苯酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2-羟基-5-硝基苄溴、2-甲基-5-异丙基苯酚中的任意一种或几种,优选为2-羟基-5-硝基苄溴。
根据本发明,优选2-羟基-5-硝基苄溴为酚类化合物,可以提高光致变色响应的速度和加快热转化率的效果,溴的引入还能提高变色的抗疲劳性。
在步骤1-1中,腈类化合物包括甲基丙烯腈、己二腈、乙腈、丙二腈中的任意一种或几种,优选为乙腈。
根据本发明,腈类化合物含有腈基,是一种刚性基团,且极性较大,可以与某些反应性基团发生潜在的交联反应,提高荧光探针的稳定性,优选乙腈为腈类化合物,黏度低,易于反应,制得的荧光探针具有较高的产率。
在步骤1-1中,任选地,反应在惰性气体保护下进行,所述惰性气体包括氦气、氩气、氮气中的任意一种或几种,优选为氮气。
在步骤1-1中,吲哚类化合物和酚类化合物的摩尔比为(0.5~6):1,优选为(1~4):1,更优选为2:1。
根据本发明,吲哚类化合物和酚类化合物的摩尔比的不同,反应产物不同,即目的产物荧光探针的纯度不同,当吲哚类化合物和酚类化合物的摩尔比为(0.5~6):1,尤其是2:1时,得到荧光探针的纯度最高,副反应最少。
在步骤1-1中,反应时间为4~24小时,优选为6~18小时,更优选为12小时。
根据本发明,随着反应时间的延长,酚类化合物的转化率逐渐升高,反应时间过长,对反应毫无意义。
在进一步的优选实施方式中,步骤1-1发生的反应如式Ⅲ所示:
步骤1-2,对步骤1-1所得反应液进行处理。
在步骤1-2中,处理过程包括静置,过滤,萃取,干燥,分离提纯。
根据本发明,优选低温静置,例如将步骤1-1得到的反应液放置于冰箱。
根据本发明,优选使用超纯水过滤,不仅降低了生产成本,而且可以减少使用溶剂带来的环境污染。
根据本发明,优选萃取剂为醚类化合物,更优选为乙醚。
根据本发明,优选干燥剂为硫酸盐,更优选为无水硫酸钠。由于步骤1-1反应液为弱碱性,无水硫酸钠是吸水量很大,价格低廉、颗粒大、处理方便、性质稳定。
根据本发明,优选洗脱剂为烷烃、酯类化合物中的任意一种或组合使用,更优选为二氯甲烷与乙酸乙酯的混合物。
在一种优选实施方式中,二氯甲烷与乙酸乙酯的摩尔比为(6~15):1,优选为(8~13):1,更优选为10:1。
步骤2,制备基于苯并噁嗪可视有机分子比率型荧光探针。
在一种优选实施方式中,所述步骤2包括以下步骤:
步骤2-1,将步骤1所得化合物Ⅰ与醛类化合物溶于有机溶剂,并加入酸。
在步骤2-1中,所述醛类化合物包括中己醛丙二缩醛、甲基乙二醛、6-甲氧基-2-萘甲醛的任意一种或几种,优选为6-甲氧基-2-萘甲醛。
根据本发明,优选先将吲哚类化合物与酚类化合物反应,再加入醛类化合物,反应更为彻底;醛基对苯并噁嗪开环聚合具有催化作用,促进荧光探针的合成,优选6-甲氧基-2-萘甲醛为醛类化合物,合成的荧光探针具有优良的特性。
在步骤2-1中,所述有机溶剂优选醇类,包括甲醇、乙醇、丁二醇,更优选为乙醇,乙醇介电常数小,对反应影响小,有利于反应的进行,使得反应结束容易分相,同时可以减少副产物的形成,乙醇操作更为安全。
在步骤2-1中,所述酸优选弱酸,更优选为氢氟酸。
在步骤2-1中,任选地,反应在惰性气体保护下进行,所述惰性气体包括氦气、氩气、氮气中的任意一种或几种,优选为氮气。
在步骤2-1中,步骤1得到的化合物Ⅰ和醛类化合物的摩尔比为(0.1~3):1,优选为(0.5~2):1,更优选为1:1。
根据本发明,步骤1得到的化合物Ⅰ和醛类化合物的摩尔比不同,制得荧光探针的纯度不同,当步骤1得到的化合物Ⅰ和醛类化合物的摩尔比为(0.1~3):1,尤其是1:1时,得到荧光探针的纯度最高,副反应最少。
在步骤2-1中,反应时间为6~20小时,优选为10~14小时,更优选为12小时。
根据本发明,随着反应时间的延长,荧光探针的选择性和收率逐渐升高,反应时间过长,荧光探针的选择性和收率基本不变,甚至会导致产物荧光探针的选择性和收率下降。
在进一步的优选实施方式中,步骤2-1发生的反应如式Ⅳ所示:
步骤2-2,对步骤2-1反应进行后处理。
在步骤2-2中,所述后处理包括过滤,萃取,干燥,分离提纯。
根据本发明,优选使用超纯水过滤。
根据本发明,优选萃取剂为醚类化合物,更优选为与步骤1-2使用的萃取剂相同。
根据本发明,优选干燥剂为硫酸盐,更优选为步骤1-2使用的干燥剂相同。
根据本发明,优选洗脱剂为烷烃、醚类化合物中的任意一种或组合使用,更优选为二氯甲烷与石油醚的混合物。
在一种优选实施方式中,二氯甲烷与石油醚的摩尔比为(1~7):(3~10),优选为(2~5):(5~8),更优选为3:7。
本发明的第三方面,目的在于提供一种根据第一方面所述的荧光探针或第二方面所述的方法得到的荧光探针在可视化实时检测溶液pH方面的应用。
根据一种优选实施方式,将第一方面所述的荧光探针或根据第二方面所述的方法得到的荧光探针加入到极性溶液和不同pH值的磷酸盐混合的缓冲液中。
其中,所述极性溶剂包括甲醇、乙醇、二氧六环、二甲基亚砜等极性较大的溶剂,及三氯甲烷、甲苯、二甲苯等极性较小的溶剂,优选极性较大的溶剂,更优选为二甲基亚砜,使得荧光探针有更加的分辨率。
其中,所述极性溶液和磷酸盐的体积比为1:(5~12),优选为1:(7~10),更优选为1:9,此时荧光探针的分辨率更高,选择性更好。
根据本发明提供的荧光探针,能够用来检测溶液pH值的变化,在pH范围为1.0~6.5,优选为1.5~6.2,更优选为1.8~5.8,在自然光下或紫外灯下都能看出明显的比率颜色变化。
具体地,本发明比率型荧光探针充分利用了有机荧光团分子内电荷转移的性质。在不同的pH下,本发明荧光探针在紫外灯下显示出两种荧光发射,它们分别来自430nm和575nm处的分子内电荷转移过程。因此,可以利用两个不同发射带的荧光强度之比来反映溶液pH。当溶液中H+增多的时候,575nm处发射峰增强,溶液在紫外灯照射下呈现橙色。当溶液中OH-增多的时候,430nm处发射峰增强,溶液在紫外灯照射下呈现蓝色。通过建立荧光强度和溶液pH值的拟合曲线关系,可以快速实现对溶液pH值的实时检测本发明荧光探针的解离常数(pKa)为3.49。
本发明的第四方面,目的在于提供一种根据第一方面所述的荧光探针或第二方面所述的方法得到的荧光探针在细胞成像方面的应用。
根据一种优选实施方式,取适量第一方面所述的荧光探针或根据第二方面所述的方法得到的有机分子比率荧光探针加入到不同pH值下的赫拉(HeLa)细胞中,在共聚焦荧光显微镜下观察细胞颜色变化。
其中,所述pH范围为1.0~6.5,优选为1.5~6.2,更优选为1.8~5.8。
具体地,向培养好的HeLa细胞中加入本发明探针溶液,并置于不同pH的缓冲溶液下培养。之后,在共聚焦荧光显微镜下观察,随着pH值由大到小的变化,HeLa细胞的蓝色荧光逐渐减弱,橙色荧光逐渐增强。这种通过共聚焦荧光显微镜观察细胞荧光变化的过程可以作为定性检测细胞中pH变化的依据。
根据本发明比率型荧光探针,可以完成溶液pH的实时检测,并能完成活细胞中pH变化的生物成像。
实施例
实施例1
合成有机分子比率型荧光探针(Ox-L)
(1)将1.8mmol 2,3,3-三甲基吲哚与0.9mmol 2-羟基-5-硝基苄溴和5ml乙腈混合,在氮气氛围下常温反应12h。反应结束后将产物置于冰箱12h,之后分别用超纯水过滤、乙醚萃取、无水硫酸钠干燥;再通过配比为10:1的乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱剂通过柱层析的方式分离提纯,即可得到化合物Ⅰ;
(2)将0.5mmol化合物Ⅰ和0.5mmol 6-甲氧基-2-萘甲醛和10ml乙醇混合,并加入0.3ml氢氟酸,在氮气氛围下反应12h。反应结束后分别用超纯水过滤、乙醚萃取、无水硫酸钠干燥;再通过配比为3:7的二氯甲烷/石油醚洗脱剂通过柱层析的方式分离提纯,可得到化荧光探针Ox-L。
对荧光探针Ox-L进行质谱分析和核磁分析,得到以下数据:
质谱分析:HR-MS:m/z(%):[M+H]+478.1893,found478.1920。
核磁分析:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(m,2H),7.65-7.68(m,2H),7.53(d,J=7.2Hz,1H),7.39(d,J=7.3Hz,1H),7.01-6.91(m,5H),6.55–6.51(m,2H),6.25(s,2H),4.61(s,1H),3.73(s,3H),1.39(s,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):164.46,158.64,139.79,139.76,134.44,131.95,131.16,128.54,128.24,126.85,126.84,126.76,126.16,122.27,121.93,121.10,120.23,116.77,114.78,112.88,111.84,107.16,55.98,49.04,47.87,18.72。
实验例
实验例1对溶液pH的检测
利用实施例1制备的有机分子比率型荧光探针对溶液pH的检测:取3ul的探针溶液分别加入不同pH下的DMSO-磷酸盐缓冲溶液中,并分别进行荧光检测,pH范围设置为1.8-5.8。随着溶液pH逐渐增大,575nm处发射峰荧光强度逐渐降低,430nm处发射峰荧光强度逐渐增大,比率值F575/F430逐渐减小,直至几乎不变。据此建立荧光强度比率值和溶液pH的拟合曲线关系,实现对溶液pH的实时检测。
实验例2对溶液pH的检测
实验例2与实验例1步骤完全相同,区别仅在于pH范围设置为1.8-7,由实施例1制得的荧光探针在不同pH缓冲液中的荧光光谱图以及可视化照片如图1所示,可以看出荧光探针荧光激发波长在溶液pH=2.0和pH=6.0时最佳激发波长在360~380nm,在pH=2.0时发射波长为520~700nm,pH=6.0时为400~520nm。
根据图1得出将实施例1制得的荧光探针加入不同pH缓冲液中所得的荧光强度比率值(F575/F430)和pH之间的曲线关系图,如图2所示,可以计算出,荧光探针的解离常数(pKa)为3.49。
实验例3在不同H+浓度下的成像
将实施例1制备的有机分子比率型荧光探针加入不同浓度的H+的溶液中,H+溶液的浓度分别为1.5μmol/L,3μmol/L,4.5μmol/L,6μmol/L,7.5μmol/L,9μmol/L,10.5μmol/L,12μmol/L,所得荧光光谱图如图3所示,可以看出,随着H+浓度的增加,575nm处荧光发射峰由弱变强。
实验例4在不同OH-浓度下的成像
将实施例1制备的有机分子比率型荧光探针加入不同浓度的OH-的溶液中,OH-溶液的浓度分别为1.5μmol/L,3μmol/L,4.5μmol/L,6μmol/L,7.5μmol/L,9μmol/L,10.5μmol/L,12μmol/L,所得荧光光谱图如图4所示,可以看出,随着OH-浓度的增加,430nm处荧光发射峰由弱变强。
实验例5在不同pH下的细胞成像
利用实施例1制备的有机分子比率型荧光探针对不同pH下的HeLa细胞进行生物成像;向培养好的HeLa细胞加入10μM的荧光探针,并培养2h。培养完毕后,将细胞培养基分别换成pH=3.0,4.0和5.0的缓冲溶液,并加入10μM的尼日利亚菌素,在37℃下培养15min。随后在共聚焦荧光显微镜下观察细胞图像,其中荧光显微镜的激发波长设置为405nm,由此即可使用本发明荧光探针实现对不同pH下的细胞成像应用。
图5示出利用实施例1制备的有机分子比率型荧光探针在HeLa细胞内处于不同pH环境下的细胞成像照片,可以看出,在pH由3.0到5.0的过程中,HeLa细胞所呈现的橙光颜色逐渐变暗,而蓝光颜色逐渐变强,呈现出比率变化。
以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是,这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释,并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下,可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰,这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。
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