一种微生物法制备复合抑藻剂的方法
阅读说明：本技术 一种微生物法制备复合抑藻剂的方法 (Method for preparing composite algistat by microbiological method ) 是由 赵亚灿 于 2020-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种微生物法制备复合抑藻剂的方法,包括以下步骤：(1)将大麦秸秆、芦苇和艾草粉碎成60mm-100mm的颗粒,然后加水,温度30-40℃,浸泡3-5天；(2)然后加入黄连粉,浸泡1-2天；(3)过滤,得第一滤液和滤渣,所述的滤渣加水浸泡,然后添加纤维素酶,温度40-50℃,酶解1-2h；(4)过滤,得第二滤液和滤渣,将第二滤液在90-100℃处理8-10min,然后冷却,过滤,得第三滤液；(5)合并混匀第一滤液和第三滤液,过滤,得复合抑藻剂。本发明的抑藻剂相对于单独采用大麦秸秆作为抑藻剂,抑藻效果更好,对多种藻类都具有良好的抑制效果,而且保存期长,保存6个月,抑藻效果几乎没有变化。(The invention relates to a method for preparing a composite algicide by a microbiological method, which comprises the following steps: (1) pulverizing barley straw, reed and folium Artemisiae Argyi into 60-100 mm granules, adding water, soaking at 30-40 deg.C for 3-5 days; (2) then adding the coptis powder, and soaking for 1-2 days; (3) filtering to obtain a first filtrate and filter residue, soaking the filter residue in water, adding cellulase, and performing enzymolysis at 40-50 deg.C for 1-2 hr; (4) filtering to obtain a second filtrate and filter residue, treating the second filtrate at 90-100 deg.C for 8-10min, cooling, and filtering to obtain a third filtrate; (5) and combining and uniformly mixing the first filtrate and the third filtrate, and filtering to obtain the composite algistat. Compared with the method of singly adopting barley straws as the algae inhibitor, the algae inhibitor has better algae inhibiting effect, has good inhibiting effect on various algae, and has long storage period of 6 months, and almost no change in the algae inhibiting effect.)
技术领域
本发明涉及一种微生物法制备复合抑藻剂的方法，属于生态控藻领域。
背景技术
近年来，有害藻类水华在湖泊和水库中频发，尤其在夏季，带来了生态危害，影响了饮水安全。藻类水华的暴发与水体富营养化是密不可分的，藻类大量繁殖使得饮用水发臭，改变了湖泊群落结构，降低生物多样性。如何有效控制富营养化水体中的藻类，防止水华暴发成为当前环境保护领域的研究热点和前沿问题。传统除藻技术大体可分为物理技术、化学技术和生物技术三类。其中较常用的是化学技术，通过投加如琉酸铜、两稀酸、高猛酸钾等的杀藻剂可暂时缓和藻类的生长，但其成本高，对其他水生生物也有毒害作用，不可避免地将破坏生态平衡并造成二次环境污染。而物理技术则存在着操作时间长、难度大、费用高等缺点。例如各地政府普遍接受的人工捕捞法，不但除藻效率较低，而且会人为改变水生生态系统的结构，对打榜上来的藻渣进行安全处置的成本也颇高。传统的生物控制方法则主要是通过人为增加某些能直接以藻类为食或间接抑制藻类生长的生物，针对性地阻止水华的发生，但是具体应用过程也比较复杂，劳动量较大，费用也较高，相对化学和物理方法的治理周期也更长。近年来，植物对藻类化感抑制作用的发现，使化感作用开始被应用于富营养化水体治理和藻类控制领域，相关研究已受到国内外的广泛关注。这些化感物质是植物生长过程中产生的次级代谢物质，它们对藻类的化感作用专一性较好，并且一般都能在自然条件下降解。因此，植物化感作用控藻方法是一种生态安全性好，有良好的应用前景的方法。利用大麦插杆投入水体抑制藻类是目前为止最为成功的利用化感作用控制蓬类的应用实例。但是存在以下问题：(1) 化感物质对藻类的抑制作用具有明显的选择性，对特定的藻类具有显著的抑制作用，但是自然水体中藻类群落是由多种藻组成的，导致其效果不好；(2)现有利用秸秆提取物来制备抑藻剂，但是存在保存期短的问题，一般3-6个月密封保存，抑藻效果降低50％以上，导致其无法长期存储使用。(3)现在一些药用植物也发现了抑藻作用，并且效果很好，但是成本高，无法大规模使用。
发明内容
本发明提供了一种微生物法制备复合抑藻剂的方法，本发明制备的抑藻剂以大麦秸秆为主要原料，采用生物法制备，具有成本低、抑藻全面、效果好、保存期长的优点，有效的解决了现有植物抑藻剂存在问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种微生物法制备复合抑藻剂的方法，包括以下步骤：
(1)将大麦秸秆、芦苇和艾草粉碎成60mm-100mm的颗粒，然后加水，温度30-40℃，浸泡3-5天；
(2)然后加入黄连粉，浸泡1-2天；
(3)过滤，得第一滤液和滤渣，所述的滤渣加水浸泡，然后添加纤维素酶，温度40-50℃，酶解1-2h；
(4)过滤，得第二滤液和滤渣，将第二滤液在90-100℃处理8-10min，然后冷却，过滤，得第三滤液；
(5)合并混匀第一滤液和第三滤液，过滤，得复合抑藻剂。
优选地：所述的大麦秸秆、芦苇、艾草和黄连粉，按照重量份计，加入的量为60-70份大麦秸秆、30-40份芦苇、5-10份艾草、1-2份黄连粉。
优选地：所述的大麦秸秆、芦苇和艾草粉碎成60mm-100mm的颗粒，加水体积为1g:20ml-30ml。
优选地：所述的滤渣加水浸泡中加水体积为1g:5ml-10ml。
优选地：所述的纤维素酶的添加量为大麦秸秆、芦苇、艾草和黄连粉总重的0.2％-0.5％。
优选地：所述的纤维素酶的酶活为10-15万U/g。
优选地：所述的步骤(1)的浸泡过程中添加总重0.1-0.2％乳酸菌和0.05-0.1％根霉。
优选地：所述的乳酸菌中每克含有30亿个活菌。
本发明的有益效果：
本发明采用大麦秸秆为主要辅料，复配芦苇和艾草，浸泡发酵，后期加入黄连粉，然后过滤，酶解滤渣，再过滤，合并滤液，既得抑藻剂，本发明的抑藻剂相对于单独采用大麦秸秆作为抑藻剂，抑藻效果更好，对多种藻类都具有良好的抑制效果，而且保存期长，保存6个月，抑藻效果几乎没有变化。本发明的抑藻剂采用植物废为主要原料，成本低，制备方法简单，而且滤渣可以作为生物肥的原料，相比秸秆作为生物肥原料，更容易分解被利用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
藻类抑藻效果实验：
藻种类：
铜绿微囊藻：编号FACHB-315，培养基：BG11，来源中国科学院武汉水生生物研究；
小球藻：编号FACHB-26，培养基：BG11，来源中国科学院武汉水生生物研究；
羊角月牙藻：编号FACHB-271，培养基：BG11来源中国科学院武汉水生生物研究；
空球藻编号：FACHB-2077，培养基：BG11来源中国科学院武汉水生生物研究；
小环藻编号：FACHB-1638，培养基：CSI，来源中国科学院武汉水生生物研究；
斜生栅藻编号：FACHB-12BG11，培养基：BG11来源中国科学院武汉水生生物研究；
抑制率公式为：IR＝(1-N/N0)×100％
式中，IR—抑制率；
N—加入抑藻剂的藻密度(个/毫升)；
N0—对照组藻密度(个/毫升)。
抑藻效果实验：
按照培养说明，将六种藻培养至对数生长期，然后将对数期的藻加入用 250ml培养瓶，用培养基稀释在4.0×106cells/ml，溶液体积100ml，然后加入1ml 本发明实施例所制备的抑藻剂，同时设定不交抑藻剂的为对照组，每组三个平行，培养5天，进行藻细胞计算。各组培养条件按照关照4000lx，光暗比12:12，温度(25±1)℃。
本发明的大麦秸秆采用驻大麦4号的秸秆。大麦秸秆、芦苇和艾草粉都为干燥产品。
实施例1
大麦秸秆含量对抑制率的影响
一种微生物法制备复合抑藻剂的方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份计，将60-70份大麦秸秆、35份芦苇和8份艾草粉碎成 60mm-100mm的颗粒，然后加水，温度37℃，浸泡5天，加水体积为1g:20ml；
(2)然后加入1份黄连粉，浸泡2天；
(3)过滤，得第一滤液和滤渣，所述的滤渣加水浸泡，所述的滤渣加水浸泡中加水体积为1g:10ml；然后添加纤维素酶，温度40℃，酶解2h，所述的纤维素酶的添加量为大麦秸秆、芦苇、艾草和黄连粉总重的0.3％，所述的纤维素酶的酶活为15万U/g；
(4)过滤，得第二滤液和滤渣，将第二滤液在100℃处理8min，然后冷却，过滤，得第三滤液；
(5)合并混匀第一滤液和第三滤液，过滤，得复合抑藻剂。
不同添加量大麦秸秆对抑制率的影响结果具体见表1。
表1大麦秸秆对抑制率的影响
大麦秸秆加入量
109份
55份
60份
65份
70份
75份
铜绿微囊藻抑制率(％)
80.2
95.2
94.4
95.4
94.2
85.1
小球藻抑制率(％)
50.1
89.1
88.6
89.3
88.4
74.3
羊角月牙藻抑制率(％)
43.6
75.3
83.6
86.4
86.1
86.2
空球藻抑制率(％)
61.2
65.3
75.3
80.3
82.5
82.7
小环藻抑制率(％)
63.2
86.3
83.4
78.2
77.9
76.2
斜生栅藻抑制率(％)
50.3
85.2
88.2
90.1
90.6
91.2
注：大麦秸秆加入量为109份使其采用大麦秸秆代替芦苇、艾草和黄连粉。由表1可知，单独采用大麦秸秆作为原料，对六种藻类的抑制效果一般，对铜绿微囊藻具有良好的抑制作用，而对其他藻类的抑制效果不明显。采用本发明的组合，有效地提高了对铜绿微囊藻、小球藻、羊角月牙藻、空球藻、小环藻和斜生栅藻的抑制率。大麦秸秆浸泡液中随着大麦秸秆含量增高对于铜绿微囊藻、羊角月牙藻、空球藻、小环藻、斜生栅藻的抑制率提高，但是超过70份以后提高不明显，设置有降低的。因此对于大麦秸秆的含量选择在60-70份比较合适。
实施例2
艾草粉含量对抑制率的影响
一种微生物法制备复合抑藻剂的方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份计，将65份大麦秸秆、35份芦苇和5-10份艾草粉碎成 60mm-100mm的颗粒，然后加水，温度35℃，浸泡5天，加水体积为1:2；
(2)然后加入1份黄连粉，浸泡2天；
(3)过滤，得第一滤液和滤渣，所述的滤渣加水浸泡，所述的滤渣加水浸泡中加水体积为1g:10ml；然后添加纤维素酶，温度40℃，酶解2h，所述的纤维素酶的添加量为大麦秸秆、芦苇、艾草和黄连粉总重的0.3％，所述的纤维素酶的酶活为15万U/g；
(4)过滤，得第二滤液和滤渣，将第二滤液在100℃处理8min，然后冷却，过滤，得第三滤液；
(5)合并混匀第一滤液和第三滤液，过滤，得复合抑藻剂。
不同艾草加入量对对抑制率的影响结果具体见表2。
表2艾草对对抑制率
艾草加入量
0
3
5
7
9
10
12
铜绿微囊藻抑制率(％)
83.6
86.1
94.2
95.1
96.4
97.5
98.1
小球藻抑制率(％)
65.2
83.8
88.4
89.2
90.1
91.4
91.6
羊角月牙藻抑制率(％)
72.5
82.4
84.2
85.8
86.4
87.2
87.8
空球藻抑制率(％)
50.4
75.6
78.3
80.2
81.6
82.4
83.0
小环藻抑制率(％)
65.3
74.1
76.2
78.6
79.6
80.7
81.2
斜生栅藻抑制率(％)
52.1
80.3
87.6
89.8
91.2
92.4
93.2
艾草是多年生草本或略成半灌木状植物，植株有浓烈香气，具有广谱的杀菌抑菌作用。大麦秸秆和芦苇具有抑藻作用，可以有效地抑制藻类的生长，但是其抑制作用，随着时间推移，会逐渐降低，不能彻底的解决藻类生长问题。本发明通过添加艾草，增加抑藻剂的抑藻作用的同时，有效地杀死藻类，使其抑藻效果更好。在培养过程中，观察培养液，发现没有添加艾草的培养液抑制效果起作用慢，而且当抑制作用达到最高以后，藻类还是再次繁殖。而添加艾草的培养液抑制效果起作用快，而且抑制作用达到最高以后，藻类基本上不再繁殖，或者缓慢繁殖。由表2可知，艾草的添加对于小球藻和斜生栅藻的抑制率具有明显的作用，抑制率提高80％以上，对于羊角月牙藻和空球藻的抑制率提高不是很高，但是也具有提高作用。由此可见艾草与大麦秸秆、芦苇结合可以有效地提高对藻类的抑制种类和抑制率。
实施例3
黄连粉含量对抑制率的影响
一种微生物法制备复合抑藻剂的方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份计，将65份大麦秸秆、35份芦苇和7份艾草粉碎成 60mm-100mm的颗粒，然后加水，温度35℃，浸泡5天，加水体积为1g:20ml；
(2)然后加入1-2份黄连粉，浸泡2天；
(3)过滤，得第一滤液和滤渣，所述的滤渣加水浸泡，所述的滤渣加水浸泡中加水体积为1g:10ml；然后添加纤维素酶，温度40℃，酶解2h，所述的纤维素酶的添加量为大麦秸秆、芦苇、艾草和黄连粉总重的0.3％，所述的纤维素酶的酶活为15万U/g；
(4)过滤，得第二滤液和滤渣，将第二滤液在100℃处理8min，然后冷却，过滤，得第三滤液；
(5)合并混匀第一滤液和第三滤液，过滤，得复合抑藻剂。
不同黄连粉加入量对抑制率的影响结果具体见表3。
表3黄连粉加入量对抑制率的影响
注：0.05份的黄连素相当于1份黄连粉。
由表3可知，黄连为属毛茛科、黄连属多年生草本植物，具有光谱的抗菌作用。黄连加入可以有效地提高抑藻作用。黄连素作为黄连的提取物，在加入量与黄连相同的基础上，黄连粉的抑藻能力更好一点。
实施例4
纤维素酶对抑制率的影响
一种微生物法制备复合抑藻剂的方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份计，将65份大麦秸秆、35份芦苇和7份艾草粉碎成60mm-100mm的颗粒，然后加水，温度35℃，浸泡5天，加水体积为1g:20ml；
(2)然后加入1.5份黄连粉，浸泡2天；
(3)过滤，得第一滤液和滤渣，所述的滤渣加水浸泡，所述的滤渣加水浸泡中加水体积为1g:10ml；然后添加纤维素酶，温度40℃，酶解2h，所述的纤维素酶的添加量为大麦秸秆、芦苇、艾草和黄连粉总重的0.2％-0.5％，所述的纤维素酶的酶活为15万U/g；
(4)过滤，得第二滤液和滤渣，将第二滤液在100℃处理8min，然后冷却，过滤，得第三滤液；
(5)合并混匀第一滤液和第三滤液，过滤，得复合抑藻剂。
不同纤维素酶加入量对抑制率的影响结果具体见表4。
表4纤维素酶加入量对抑制率的影响
纤维素酶加入量(％)
0
0.1
0.2
0.3
0.5
0.6
铜绿微囊藻抑制率(％)
89.6
93.2
94.5
96.4
97.2
95.1
小球藻抑制率(％)
80.2
86.3
88.6
91.2
91.8
90.3
羊角月牙藻抑制率(％)
81.2
83.6
85.7
86.7
87.6
84.6
空球藻抑制率(％)
75.2
78.6
80.1
81.3
82.1
80.6
小环藻抑制率(％)
70.6
75.4
78.6
80.2
81.5
81.8
斜生栅藻抑制率(％)
81.5
86.1
88.6
90.6
91.4
89.6
由表4可知，纤维素酶可以有效的分解纤维，有利于以大麦秸秆、芦苇和艾草中有效成分的提取，因此相对于不加纤维素酶处理，添加纤维素酶处理可以有效地提高抑藻率。随着纤维素酶添加量增加，抑藻率逐步升高，但是添加量过大，会造成在后滤过滤(本发明采用8层纱布过滤)中，蛋白质影响过滤，导致部分抑藻物质被截留在滤渣中，进而影响抑藻率。因此纤维素酶的添加量在0.2-0.5％比较合适，具有较高的抑藻率。
实施例5
添加菌种发酵对对抑制率的影响
一种微生物法制备复合抑藻剂的方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份计，将65份大麦秸秆、35份芦苇和7份艾草粉碎成 60mm-100mm的颗粒，然后加水，温度35℃，浸泡5天，加水体积为1g:20ml，所述的步骤(1)的浸泡过程中添加总重0.1-0.2％乳酸菌和0.05-0.1％根霉，所述的乳酸菌中每克含有30亿个活菌；根霉采用中国普通微生物菌种保藏管理中心的CGMCC3.5778的米根霉，采用PDA培养基将米根霉活化两次，然后作为种子液接种。
(2)然后加入1.5份黄连粉，浸泡2天；
(3)过滤，得第一滤液和滤渣，所述的滤渣加水浸泡，所述的滤渣加水浸泡中加水体积为1g:10ml；然后添加纤维素酶，温度40℃，酶解2h，所述的纤维素酶的添加量为大麦秸秆、芦苇、艾草和黄连粉总重的0.3％，所述的纤维素酶的酶活为15万U/g；
(4)过滤，得第二滤液和滤渣，将第二滤液在100℃处理8min，然后冷却，过滤，得第三滤液；
(5)合并混匀第一滤液和第三滤液，过滤，得复合抑藻剂。
添加菌种发酵对对抑制率的影响见表5。
表5菌种发酵对对抑制率的影响
由表5可知，添加乳酸菌和根霉，混合发酵，有利于提高抑藻剂的综合抑藻能力，尤其是对于铜绿微囊藻、空球藻、小环藻的抑制率提高比较好，添加量达到0.5ml时，具有良好的抑制效果。但是对于小球藻、羊角月牙藻和斜生栅藻的抑藻能力提升不大。乳酸菌和根霉复合在一起才会起到良好的作用，但是添加一种，起到的作用不到，尤其是单独添加根霉，甚至会导致抑藻效果下降。
实施例6
本发明的抑藻剂为发酵产品，属于生物制品，不容易保存，容易变质，进而影响其保质期。因此本发明从抑菌和除蛋白出发，考虑具有杀菌作用的艾草和黄连，以及制备工艺上来综合考虑本发明所制备的抑藻剂的保质期问题。
一种微生物法制备复合抑藻剂的方法，包括以下步骤：
(1)按照重量份计，将65份大麦秸秆、35份芦苇和7份艾草粉碎成 60mm-100mm的颗粒，然后加水，温度35℃，浸泡5天，加水体积为1g:20ml；
(2)然后加入1.5份黄连粉，浸泡2天；
(3)过滤，得第一滤液和滤渣，所述的滤渣加水浸泡，所述的滤渣加水浸泡中加水体积为1g:10ml；然后添加纤维素酶，温度40℃，酶解2h，所述的纤维素酶的添加量为大麦秸秆、芦苇、艾草和黄连粉总重的0.3％，所述的纤维素酶的酶活为15万U/g；
(4)过滤，得第二滤液和滤渣，将第二滤液在100℃处理8min，然后冷却，过滤，得第三滤液；
(5)合并混匀第一滤液和第三滤液，过滤，得复合抑藻剂。
表6抑藻剂保质期实验结果
注：艾草和黄连不加入时，采用同质量的大麦秸秆代替。
由表6可知，本发明的抑藻剂的保质期受艾草、黄连和工艺条件的综合影响，尤其是黄连对保质期的影响最大，一方面黄连、艾草和工艺条件对抑藻率有明显影响，而且对于保质期的影响更大，添加黄连、艾草，以及采用黄连混合浸泡、高温灭菌，可以有效得提高抑藻剂的保质期，本发明的抑藻剂六个月，抑藻效果降低率(％)仅为1.1％，而对比例最低的为5.1％，最高的可达56.7。可见本发明的抑藻剂具有良好的保质效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。