阅读说明：本技术 一种产淀粉酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌在禽类发酵饲料中的应用 (Application of bacillus cereus for producing amylase and xylanase in poultry fermented feed ) 是由 冯焱 王雷 郝琴琴 冯江浩 姚军虎 于 2020-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种产淀粉酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌菌株Bacillus cereus W3。本发明还公开了一种用于改善家禽纤维消化能力的饲用微生物添加剂,由高纤维饲料原料为基质,对蜡样芽孢杆菌菌株Bacillus cereus W3进行富集发酵制备而成,活菌发酵量1013CFU/g时,在玉米-豆粕型饲粮中添加5％饲用微生物添加剂替代玉米,使用效果显著。本发明能提高家禽肠道中淀粉酶和木聚糖酶的活性,优化肠道菌群结构,增强家禽对高纤维饲料的消化吸收能力,对提高家禽饲料转化效率和新型饲料开发与高效利用具有指导意义。(The invention provides a Bacillus cereus strain Bacillus cereus W3 for producing amylase and xylanase. The invention also discloses a feeding microbial additive for improving the fiber digestibility of poultry, which is prepared by taking a high-fiber feed raw material as a substrate and carrying out enrichment fermentation on the Bacillus cereus strain Bacillus cereus W3, wherein when the viable bacteria fermentation amount is 1013CFU/g, 5 percent of the feeding microbial additive is added into the corn-soybean meal type feed to replace corn, and the using effect is obvious. The invention can improve the activity of amylase and xylanase in poultry intestines, optimize the intestinal flora structure, enhance the digestion and absorption capacity of poultry on high fiber feed, and has guiding significance for improving the poultry feed conversion efficiency and developing and efficiently utilizing novel feed.)

一种产淀粉酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌在禽类发酵饲料中 的应用

技术领域

本发明涉及一种产淀粉酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3及其在饲用微生物添加剂制备中的应用，属于养殖饲料技术领域。

背景技术

我国是世界禽肉产量第一的农业大国，特别是集约化养殖大大降低了生产成本，使禽肉成为营养丰富，价格实惠的优质动物蛋白来源。家禽的饲料转化效率相对猪和反刍动物较高，但由于其自身不能分泌纤维素酶系，对小麦、麦麸等纤维含量较高的饲料原料消化能力较弱，因而成为限制家禽饲料的原料选择与高效利用的主要瓶颈。

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)可通过固态发酵进行富集培养，部分菌株可同时分泌淀粉酶和木聚糖酶。淀粉酶是动物体的主要内源酶之一，在饲料消化中占有重要地位；木聚糖酶可对饲料中半纤维素结构中的木聚糖进行降解，产生的低聚木糖还可被微生物或动物体利用而避免营养流失，从而整体提高家禽对高纤维饲料营养的转化效率。此外Bacillus cereus 作为益生菌能够调节肠道菌群结构，抑制有害菌群的繁殖，可减少消化道疾病，促进肠道健康。因此可将Bacillus cereus作为微生物添加剂应用于饲料行业。

发明内容

本发明的目的是将难以直接利用麦麸中的营养物质通过微生物发酵释放更多的营养物质，从而提高家禽的生产性能。

为了解决家禽对纤维类饲料的消化能力不足，弥补由消化道分泌酶系不全造成饲料中纤维物质营养流失的缺陷，本发明提供了一种产淀粉酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3及其制备的用于改善家禽纤维消化能力的饲用微生物添加剂，在玉米-豆粕型饲料中添加后可提高家禽肠道淀粉酶和木聚糖酶的活性，同时可优化肠道菌群结构，从而提高家禽对高纤维饲料的消化能力和饲料整体营养的转化效率。

本发明为解决上述问题采取的技术方案为：

提供一种产淀粉酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3，其保藏编号为CGMCC No.19785。

以上述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3制备一种用于改善家禽纤维消化能力的饲用微生物添加剂，它包含蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3和发酵基质两种功能成分。本饲用微生物添加剂可应用于家禽饲料，主要用于提高家禽对纤维类饲料的消化能力，改善家禽肠道菌群结构，提高纤维饲料的转化效率。

上述的饲用微生物添加剂，它的发酵基质可选常见家禽高纤维饲料原料，优选麦麸。

上述的饲用微生物添加剂的发酵温度为28-45℃，含水10％-40％，最终活菌发酵量10¹¹-10¹⁶ CFU/g，优选发酵温度35-37℃，含水15％-20％，最终活菌发酵量10¹³-10¹⁴CFU/g。

上述的饲用微生物添加剂在玉米-豆粕型饲料中的添加量为3％-25％，优选5％-15％。

本发明提供的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3及其制备的用于改善家禽纤维消化能力的饲用微生物添加剂，其有益效果在于，可提高家禽肠道消化酶，特别是淀粉酶和木聚糖酶的活性，弥补家禽纤维酶系分泌能力的缺失，增强家禽对高纤维饲料的消化能力；同时优化肠道菌群结构，减少有害菌的繁殖，提高家禽饲料的整体转化效率。

生物保藏

本发明的蜡样芽孢杆菌于2020年5月8日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.19785。

附图说明

图1为本发明中所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3的不同发酵时间淀粉酶和木聚糖酶的折线图；

图2为本发明中所述饲用微生物添加剂对肉鸡肠道微生物结构影响的PCoA分析结果；

其中拟合过程采用Unweighted UniFrac距离算法；

其中椭圆表示同一处理组样本肠道微生物结构的拟合区域，椭圆间分离越明显，对应处理组样本间的肠道微生物结构区分越明显；

其中R值和P值为ANOSIM组间差异置换检验结果，置换次数为999次。

具体实施方式

利用以下具体实施例，可更加容易理解本发明。实施例中所述具体实施动物、饲料配制与生产工艺及结果仅用于对本发明的解释说明，而不能理解为是对本发明的条件限制。实施例中涉及动物、饲料原料和试剂如无特殊说明，均可从商业途径获得。

【实施例1】蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3液体发酵淀粉酶和木聚糖酶测定

(1)液体发酵与酶液提取

取蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3甘油菌100μL，接种到30mL LB培养基中，200r/min 37℃振荡发酵培养，分别在0、24、48、72、96、120h后吸取菌液1mL，4℃6000r/min离心 1min除去菌体，吸取上清液转移至4℃预冷的无菌EP中作为酶液。

(2)淀粉酶和木聚糖酶活性测定

酶促反应的底物如下：

淀粉：1g/mL淀粉的Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L，pH 8.0)溶液400μL。

木聚糖：0.2g/mL木聚糖的柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH 5.0)溶液400μL。

吸取30μL酶液依次加入含有以上底物的离心管中，55℃水浴反应30min；对照组混合后先在100℃反应10min使木聚糖酶失活再实施55℃水浴处理。再向430μL的酶促反应体系中混合860μL DNS试剂，100℃金属浴加热反应10min后，吸取1mL反应液以4mL去离子水稀释，以对照组标零，测定稀释后反应液在540nm处的吸光度值，对照还原糖-OD540标准曲线计算还原糖的生成量，判断淀粉酶和木聚糖酶的活性。

酶活单位的定义：在上述反应条件下，1mL发酵产物每分钟从足量底物中降解并释放 1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位，单位U/mL。计算公式如下：

EA＝S×D×1000/(V×T×M)

式中：EA-发酵样本酶活力，U/mL；S-还原糖的生成量，mg；D-酶液的稀释倍数；1000- 摩尔转化系数，1mmol＝1000μmol；V-酶的添加量，mL；T-反应时间，min；M-还原糖的相对分子质量，g/mol。

试验结果和分析

按照公式分别计算本专利所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3在不同发酵时间淀粉酶和木聚糖酶的活性，绘制发酵酶活曲线，见附图1。发酵96h蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus W3淀粉酶和木聚糖酶的活性同时达到最高，分别为49.78U/mL和56.91U/mL。

【实施例2】蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3制备饲用微生物制剂对肉鸡的影响

(1)微生物添加剂的发酵制备

利用蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus W3进行固态发酵，采用麦麸作为营养基质，补充水分至含水量20％，pH自然，置于37℃恒温发酵罐中搅拌发酵，至活菌发酵量10¹³CFU/g。

(2)试验动物和分组

选取21日龄白羽肉鸡180羽，平均体重782g,随机分为3组,每组6重复，每重复10羽肉鸡。不同组别饲料配方见表1。各组按照饲料配方对饲料原料进行称重配合，粉碎后混合制粒。发酵组饲料原料中的饲用微生物添加剂每5天制作一批，以保证新鲜有效，其余物质提前预混，按比例与微生物添加剂配合后充分混合并制粒。

对照组：玉米-豆粕型饲料；

麦麸组：替换玉米-豆粕型饲料中的玉米为5％麦麸，微量调整其余营养成分，保持禽代谢能不变；

发酵组：替换玉米-豆粕型饲料中的玉米为5％饲用微生物添加剂(活菌发酵量为10¹³CFU/g)，微量调整其余营养成分，保持禽代谢能不变。

表1不同处理组的干基饲料配方与营养含量

¹预混矿物质为每千克饲料提供如下营养物质：Cu(硫酸铜)8mg；Fe(硫酸亚铁)80mg；Zn(硫酸锌)80mg；Mn(硫酸锰)100mg；I(碘化钙)0.35mg；Se(***钠)0.30mg。

²禽维生素为每千克饲料提供如下营养物质：视黄醇18000IU；胆钙化固醇2000IU；生育酚 20IU；维生素K 0.5mg；硫胺素2g；核黄素8mg；烟酸10mg；泛酸35mg；吡哆素3.5mg；生物素0.18mg；叶酸0.55mg；钴胺素0.01mg。

(3)饲养管理

饲喂试验周期为21-42日龄，采用三层笼养，环境湿度保持50％，鸡舍温度21日龄时为 26℃，以后每天下降0.3℃，保持通风。各组供应足量对应饲料，饲喂过程自由饮水和采食。

(4)测定指标

平均日增重、料重比、肠道酶活性和微生物多样性。

(5)结果和分析

添加本发明所述微生物添加剂对肉鸡生产、肠道酶活性及肠道微生物多样性的影响，其结果见表2和附图2。发酵组中添加本发明所述微生物添加剂后，肉鸡的日增重和料重比有明显改善，十二指肠中淀粉酶和木聚糖酶的活性相比对照组分别提高了227％和62％，盲肠微生物丰富度有显著提升，菌群结构亦发生明显改善。综上可知，使用本发明所述微生物添加剂，在提高肉鸡饲料消化能力、改善肠道菌群结构和提高生产效率方面均有良好效果。

表2麦麸发酵微生物添加剂对肉鸡生长及肠道的影响