阅读说明：本技术 马铃薯内生菌的具有抗病原活性的发酵有机物、其制备工艺、应用以及发酵产物 (Fermented organic matter with anti-pathogenic activity of potato endophyte, preparation process and application thereof, and fermented product ) 是由 冯涛 艾洪莲 何隽 杨会祥 李正辉 刘吉开 于 2020-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及发酵技术领域,具体而言,涉及马铃薯内生菌的具有抗病原活性的发酵有机物、其制备工艺、应用以及发酵产物。该发酵有机物选自以下结构式所示化合物中的任意一种：<Image he="372" wi="596" file="DDA0002597764500000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>和<Image he="383" wi="557" file="DDA0002597764500000012.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>该有机物为首次利用马铃薯内生菌Trichotheciumcrotocinigenum得到的化合物,其为马铃薯内生菌制备得到的新化合物提供新的思路,扩大了马铃薯内生菌制备化合物的类型和范围。且制备该有机物的方法简洁,易于实施,可以大规模工业化生产。(The invention relates to the technical field of fermentation, in particular to a fermented organic matter with anti-pathogenic activity of potato endophyte, a preparation process and application thereof, and a fermented product. The fermentation organic matter is selected from any one of the compounds shown in the following structural formula: and the organic matter is a compound obtained by utilizing potato endophyte Trichothecium crotoconigenium for the first time, provides a new thought for preparing a new compound by the potato endophyte, and enlarges the type and range of the compound prepared by the potato endophyte. And the method for preparing the organic matter is simple and easy to implement, and can be used for large-scale industrial production.)

马铃薯内生菌的具有抗病原活性的发酵有机物、其制备工艺、 应用以及发酵产物

技术领域

本发明涉及发酵技术领域，具体而言，涉及马铃薯内生菌的具有抗病原活性的发酵有机物、其制备工艺、应用以及发酵产物。

背景技术

内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段，生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。现有技术对于马铃薯内生菌的研究一般是分离得到不同的内生菌，而后检测或者评价该内生菌对于植物的生长有何影响或者该内生菌有何作用，但是对内生菌的发酵产物或者发酵有机物的研究较少。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供马铃薯内生菌的具有抗病原活性的发酵有机物、其制备工艺、应用以及发酵产物。该发酵有机物为一种新的化合物，为马铃薯内生菌制备得到的新化合物提供新的思路，扩大了马铃薯内生菌制备化合物的类型和范围。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种马铃薯内生菌的具有抗病原活性的发酵有机物，发酵有机物选自以下结构式所示化合物中的任意一种：

本发明提供的有机物为利用马铃薯内生菌Trichotheciumcrotocinigenum进行发酵，并对发酵产物进行后处理得到的化合物。

第二方面，本发明实施例提供一种马铃薯内生菌的具有抗病原活性的发酵有机物的制备工艺，包括利用马铃薯内生菌Trichotheciumcrotocinigenum的发酵产物进行后处理得到发酵有机物。

在较优地实施例中，后处理包括：对发酵产物进行液液分离，而后对液液分离得到的有机相依次进行硅胶柱分离、中压色谱分离和高压液相制备。液液分离可以是萃取或者其他现有可以进行分离的方式。

在较优地实施例中，后处理包括：利用乙酸乙酯对发酵产物进行萃取，而后对萃取液进行硅胶柱分离，接着对硅胶柱分离得到的第四个洗脱组合液进行中压色谱分离，而后对中压色谱分离得到的第二个洗脱组合液进行高压液相。

在较优地实施例中，硅胶柱分离的洗脱过程为：将氯仿和甲醇按浓度梯度为100:0、50:1、30:1、20:1、10:1以及5:1的比例进行洗脱，并收集每次洗脱得到的洗脱液，得到6种洗脱组合液。

需要说明的是，利用氯仿和甲醇进行梯度洗脱，是将氯仿和甲醇分别按照100:0、50:1、30:1、20:1、10:1以及5:1的体积比进行混合形成洗脱液，而后进行洗脱，且洗脱后收集对应浓度的洗脱液。即氯仿和甲醇按照体积比为100:0的比例混合形成的洗脱液，而后进行洗脱，并收集该洗脱液，作为第一个洗脱组合液，而后将氯仿和甲醇按照体积比为50:1的比例混合形成的洗脱液，而后进行洗脱，并收集该洗脱液，作为第二个洗脱组合液，而后将氯仿和甲醇按照不同体积进行混合，再洗脱，得到6个洗脱组合液。

下文的按浓度梯度洗脱与上述氯仿和甲醇进行梯度洗脱是相同的，都是将溶剂按照体积比进行混合形成洗脱液，而后进行洗脱，收集得到不同组分的洗脱组合液。

优选地，中压色谱分离的洗脱过程为：将甲醇和水按浓度梯度为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40：70:30、80:20、90:10以及100:0的比例对硅胶柱分离得到的第四个洗脱组合液进行洗脱；也就是说中压色谱分离总共得到10个洗脱组合液。

优选地，高压液相分离的洗脱过程为：将乙腈和水按浓度梯度为25:75和50:50的比例对中压色谱分离得到的第二个洗脱组合液进行洗脱，得到2个洗脱组合液，每个洗脱组合液对应上述结构式所示的化合物中的一个。

在较优地实施例中，对Trichotheciumcrotocinigenum的发酵过程为：将Trichotheciumcrotocinigenum接种于培养基而后进行发酵；

优选地，发酵的条件为：24-26℃，pH值为5.9-6.1，转速为220-280r/min，空气的通入量为0.8-1.2vvm。

在较优地实施例中，以质量百分数计，培养基包括0.45-0.55wt％的酵母粉、0.12-0.18wt％的猪肉蛋白胨、4.8-5.2wt％的葡萄糖、0.045-0.055wt％的磷酸二氢钾以及0.045-0.055wt％的硫酸镁。

在较优地实施例中，Trichotheciumcrotocinigenum的接种量为6-12vt％。

第三方面，本发明实施例提供一种发酵产物，其包括上述的发酵有机物。

第四方面，本发明实施例提供上述马铃薯内生菌的具有抗病原活性的发酵有机物、上述马铃薯内生菌的具有抗病原活性的发酵有机物的制备工艺制备得到的发酵有机物或者上述发酵产物在抑制植物病原菌或者制备植物杀菌剂中的应用；

优选地，植物病原菌包括Phytophthorainfestans，Alternariasolani，Rhizoctoniasolani和Fusariumoxysporum(blast)中的任意一种。

本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供一种新的Trichotheciumcrotocinigenum的发酵化合物，该化合物为首次从马铃薯内生菌Trichotheciumcrotocinigenum中得到的新的化合物，为马铃薯内生菌制备得到的新化合物提供新的思路，扩大了马铃薯内生菌制备化合物的类型和范围。且制备该有机物的方法简洁，易于实施，可以大规模工业化生产。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供一种马铃薯内生菌的具有抗病原活性的发酵有机物，该发酵有机物选自以下结构式所示化合物中的任意一种：

两种化合物分别标示为LYBR115和LYBR117。上述两种有机物为首次从Trichotheciumcrotocinigenum的发酵产物中提取得到的物质。其为马铃薯内生菌的发酵化合物的研究提供新的思路。

本发明实施例还提供一种上述发酵有机物的制备工艺，包括：

首先，Trichotheciumcrotocinigenum为现有公知的马铃薯内生菌，其可以通过市场购买也可以，也可以利用马铃薯作为原料，自行培养得到。利用马铃薯培养得到Trichotheciumcrotocinigenum的操作如下：对马铃薯进行消毒并切块，而后将马铃薯的根块、茎块以及叶块分别接种于包括青霉素和链霉素混合液的固体培养基上，每板1-2块，并于22-25℃恒温培养箱中培养。每日定时观察，当观察到马铃薯各个不同的组织内部向培养基四周长出肉眼可见的菌落时，根据菌落形态、颜色及长出时间，挑取差异明显的单菌落进行纯化培养。

上述差异明显的单菌落包括但不仅限于具有以下特征：菌丝为白色，菌落中央为白色，稀疏，成放射状生长。

纯化培养的条件如下：挑取菌落前沿白色菌丝至新鲜培养平皿上，重复3次，在普通光学显微镜下观察菌丝的形态，若形态均一，则纯化成功。

纯化培养后的Trichotheciumcrotocinigenum具有但不仅限于以下生理生化特征：生长在PDA培养基上菌落中央为白色，周围为白色的放射状菌丝。

而后对Trichotheciumcrotocinigenum进行发酵，将Trichotheciumcrotocinigenum按照6-12vt％的接种量接种于培养基，而后进行发酵。具体地，接种量可以为6vt％、7vt％、8vt％、9vt％、10vt％、11vt％或12vt％，也可以为上述各接种量点值之间的任何数值，例如8.5vt％、9.5vt％、10.5vt％或11.5vt％。在一些优选的实施方式中，Trichotheciumcrotocinigenum的接种量为9vt％。采用上述接种量能够进一步保证Trichotheciumcrotocinigenum的发酵，有利于后续分离得到所需的发酵有机物。

进一步地，发酵的条件为：24-26℃，pH值为5.9-6.1，转速为220-280r/min，空气的通入量为0.8-1.2vvm。在一些优选的实施方式中，发酵的条件为：25℃、pH值为6.0以及转速为160r/min。且vvm代表通气比，即每分钟通入量与罐体实际料液体积的比值。采用上述发酵条件，能够进一步保证发酵效果，有利于得到发酵有机物。

进一步地，采用的培养基，以质量百分数计，其包括0.45-0.55wt％的酵母粉、0.12-0.18wt％的猪肉蛋白胨、4.8-5.2wt％的葡萄糖、0.045-0.055wt％的磷酸二氢钾以及0.045-0.055wt％的硫酸镁。采用上述培养基能够进一步保证培养效果，有利于分离得到所需的有机物。

而后对发酵产物进行后处理，后处理包括进行液液分离，具体地，利用乙酸乙酯对发酵产物进行萃取，收集有机相，而后利用硅胶柱分离对有机相进行纯化分离，具体地，硅胶柱分离的洗脱过程为：将氯仿和甲醇按浓度梯度为100:0、50:1、30:1、20:1、10:1以及5:1的比例进行洗脱，并收集每次洗脱液，得到6种洗脱组合液。

而后将第四个洗脱组合液利用中压色谱分离，具体地，将甲醇和水按浓度梯度为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40：70:30、80:20、90:10以及100:0的比例对硅胶柱分离得到的第四个洗脱组合液进行洗脱。

而后再对上述中压色谱分离得到的第二个洗脱组合液进行高压液相分离，具体地，将乙腈和水按浓度梯度为25:75和50:50的比例对中压色谱分离得到的第二个洗脱组合液进行洗脱，得到2个洗脱组合液，每个洗脱组合液对应上述结构式所示的化合物中的一个。具体地，分别干燥高压液相分离得到的2个洗脱组合液，即能够得到LYBR115和LYBR117两个化合物。

需要说明的是，硅胶柱分离、中压色谱分离以及高压液相分离等分离的具体操作与现有技术相同，本发明实施例不再进行详述。

采用上述方式进行分离纯化，能够有效分离发酵产物中的杂质，得到所需的化合物。

本发明实施例提供一种发酵产物，其包括上述的发酵有机物。该发酵产物也可以是上述Trichotheciumcrotocinigenum发酵后得到的发酵产物，该产物必然包括上述发酵有机物。

本发明实施例提供上述发酵有机物、上述发酵有机物的制备工艺制备得到的发酵有机物或者上述发酵产物在抑制植物病原菌或者制备植物杀菌剂中的应用；且植物病原菌包括Phytophthorainfestans，Alternariasolani，Rhizoctoniasolani和Fusariumoxysporum(blast)中的任意一种。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种发酵有机物的制备工艺，包括：

将Trichotheciumcrotocinigenum接种于土豆培养基上，而后进行培养，其中，Trichotheciumcrotocinigenum的接种量为6vt％，培养基包括0.50wt％的酵母粉、0.18wt％的猪肉蛋白胨、4.8wt％的葡萄糖、0.055wt％的磷酸二氢钾和0.055wt％的硫酸镁，培养温度为24℃，培养pH为5.9，转速为220r/min，空气的通入量为0.8vvm。

培养结束后，收集培养液即发酵产物。而后将乙酸乙酯与发酵产物进行混合，而后收集有机相，而后利用硅胶柱分离有机相，并收集第四个洗脱组合液，具体地，硅胶柱分离的洗脱过程是：将氯仿和甲醇按浓度梯度为100:0、50:1、30:1、20:1、10:1以及5:1的比例进行洗脱；收集的第四个洗脱组合液即为氯仿和甲醇按体积比为20:1的比例形成洗脱液洗脱样品得到的洗脱组合液，且采用的氯仿和甲醇均为分析纯。

而后再利用中压色谱分离上述第四个洗脱组合液，并收集中压色谱分离得到的第二个洗脱组合液。具体地，中压色谱分离的洗脱过程为：将甲醇和水按浓度梯度为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40：70:30、80:20、90:10以及100:0的比例对硅胶柱分离得到的第四个洗脱组合液进行洗脱。采用的甲醇为分析纯，且收集的第二个洗脱组合液即为甲醇和水按照体积比为20:80的比例形成洗脱液，洗脱第四个洗脱组合液得到的洗脱组合液。

在利用高压液相分离上述第二个洗脱组合液，具体地，将乙腈和水按浓度梯度为25:75和50:50的比例对中压色谱分离得到的第二个洗脱组合液进行洗脱，得到两个洗脱组合液，2个洗脱组合液中对应的化合物即为LYBR115和LYBR117。

而后对高压液相分离得到的两种洗脱组合液进行干燥，即得到化合物LYBR115和化合物LYBR117。

实施例2-实施例3

实施例2-实施例3提供的发酵有机物的制备工艺与实施例1提供的发酵有机物的制备工艺的操作过程基本相同，区别在于，操作条件有所不同，具体如下：

实施例2

Trichotheciumcrotocinigenum的接种量为12vt％，培养基包括0.45wt％的酵母粉、0.12wt％的猪肉蛋白胨、5.2wt％的葡萄糖、0.050wt％的磷酸二氢钾和0.045wt％的硫酸镁，培养温度为25℃，培养pH为6.1，转速为280r/min，空气的通入量为1.2vvm。

实施例3

Trichotheciumcrotocinigenum的接种量为8vt％，培养基包括0.55wt％的酵母粉、0.15wt％的猪肉蛋白胨、5wt％的葡萄糖、0.045wt％的磷酸二氢钾和0.050wt％的硫酸镁，培养温度为26℃，培养pH为6.0，转速为250r/min，空气的通入量为1.0vvm。

表征

对实施例1制备得到的化合物LYBR115和化合物LYBR117分别进行表征，二者的表征结果如下：

化合物LYBR115和化合物LYBR117的¹H(600MHz)和¹³C(150MHz)核磁共振数据

化合物LYBR115：无色油状物；比旋光：[α]²⁶ _D-85.0(c 0.22,MeOH)；紫外(MeOH)λ_max(logε):205(3.84),255(3.85)nm；红外(KBr)ν_max 3400,2940,2835,1674,1450,1115,1023cm^-1；高分辨质谱(ESI)m/z 423.20111[M+H]⁺(calcd for C₂₂H₃₁O₈ ⁺,423.20134)。

化合物LYBR117：无色油状物；比旋光[α]²⁶ _D+53.0(c 0.13,MeOH)；紫外(MeOH)λ_max(logε):205(3.82),255(3.69)nm；红外(KBr)ν_max 3400,2940,2835,1674,1450,1115,1023cm^-1；高分辨质谱(ESI)m/z 423.20181[M+H]⁺(calcd for C₂₂H₃₁O₈ ⁺,423.20134)。

根据上述表征结果可以看出，本发明实施例1成功制备得到化合物LYBR115和化合物LYBR117。

实验例

方法：96孔板二倍稀释法测定化合物的抗菌活性

先用二倍稀释法将受试化合物配比成浓度分别为：256、128、64、32、16、8、4μg/mL的水溶液。往96孔板的每孔中分别注入80μL的PDA培养基，再分别注入上述不同浓度的受试化合物20μL，随后往每孔中加入1m³的带有新鲜培养出的植物病原菌。室温(26℃)下培养24小时后观察病原菌生长情况。病原菌生长被抑制的微孔所对应的化合物浓度被确定为该化合物抑制该病原菌的最小抑菌浓度(MIC)。

实验结果如下(MIC,μg/mL)：

根据该结果可知，本发明实施例提供的发酵有机物即化合物LYBR115和化合物LYBR117能够有效抑制Phytophthorainfestans，Alternariasolani，Rhizoctoniasolani和Fusariumoxysporum(blast)等植物病原菌。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。