一种蝮蛇蛇毒磷脂酶a2特征多肽及其应用
阅读说明：本技术 一种蝮蛇蛇毒磷脂酶a2特征多肽及其应用 (Pallas pit viper venom phospholipase A2 characteristic polypeptide and application thereof ) 是由 王维剑 石峰 咸瑞卿 杭宝建 巩丽萍 王聪聪 张迅杰 姜树银 于 2021-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及化学分析定量检测技术领域,尤其涉及一种蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽及其应用。所述特征多肽的氨基酸序列为WDDYTYSWK,该特征多肽能够用来检测待测样品中蝮蛇蛇毒磷脂酶A2的含量,检测方法为：取氨基酸序列为WDDYTYSWK的蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽,制成系列浓度对照品溶液；取待测样品,酶解,取酶解后的上清液作为供试品溶液；分别注入液相色谱-质谱仪,选择双电荷632.4→624.0作为定量离子对对待测样品中的蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽的含量进行检测,可以大大提高蝮蛇蛇毒药物的质量控制水平,对蝮蛇蛇毒、中间体及其药物制剂的质量控制均有很好地指导作用。(The invention relates to the technical field of chemical analysis and quantitative detection, in particular to a viper venom phospholipase A2 characteristic polypeptide and application thereof. The amino acid sequence of the characteristic polypeptide is WDDYTYSWK, the characteristic polypeptide can be used for detecting the content of pit viper venom phospholipase A2 in a sample to be detected, and the detection method comprises the following steps: preparing a series of concentration reference solutions from pit viper venom phospholipase A2 characteristic polypeptide with an amino acid sequence of WDDYTYSWK; taking a sample to be detected, carrying out enzymolysis, and taking supernatant after enzymolysis as a test solution; injecting into a liquid chromatogram-mass spectrometer respectively, selecting double charges 632.4 → 624.0 as quantitative ion pair to detect the content of the agkistrodon halys venom phospholipase A2 characteristic polypeptide in the sample to be detected, greatly improving the quality control level of the agkistrodon halys venom medicine, and well guiding the quality control of the agkistrodon venom, the intermediate and the pharmaceutical preparation thereof.)
技术领域
本发明涉及化学分析定量检测技术领域，尤其涉及一种蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽及其应用。
背景技术
蛇毒是由蛇的毒腺分泌的一种复杂混合物，含有多种蛋白质、多肽、核苷、酶类、金属离子和其它小分子物质。以蛇毒为原料，分离纯化具有独特药理活性的单一成分是新药研发的热点。目前，已从乌苏里蝮蛇（Gloydius ussuriensis)、短尾蝮蛇（Gloydius brevicaudus）、哈里氏蝮蛇(Gloydius halys)、日本蝮蛇（Gloydius blomhoffii）等蝮蛇的蛇毒中分离出了类凝血酶、降纤酶、神经生长因子、精氨酸脂酶、L-氨基酸氧化酶和磷脂酶A2等成分。
蛇毒磷脂酶A2 (snake venom PLA2s，svPLA2s)是一类脂解酶的超家族，主要催化甘油磷脂sn-2位点的酯键水解，生成脂肪酸(花生四酸酯)和溶血磷脂。svPLA2s具有广泛毒性效应，包括肌毒性、心毒性、神经毒性、肾、肝毒性和全身出血等损伤，还可诱导炎症介质、血管舒张和血管收缩介质的释放，如前列腺素、组胺、血小板活化因子、儿茶酚胺、多巴胺、一氧化氮和内皮素。
目前以蛇毒为原料开发上市的药物多达十几种，其中以白眉蝮蛇（乌苏里蝮蛇亚种）的蛇毒为原料的上市药物就有注射用白眉蛇毒血凝酶、纤溶酶注射液、降纤酶注射液等多个品种，在这些药物中磷脂酶A2作为杂蛋白，会导致神经毒性等多种不良反应，必须严格控制其含量。因此，在这些药物的生产过程中监测蛇毒、工艺中间体及终产品的蛇毒磷脂酶A2的含量，对于优选原料、优化工艺、提高产品安全性有重要意义。但目前报道的蛇毒磷脂酶A2检测方法主要为凝胶电泳法和效价测定法，测定方法繁琐且准确性差，无法准确表征蛇毒及其提取物的质量。因此建立一种方便快捷，定量准确的蛇毒磷脂酶A2检测方法，以表征蛇毒及其提取物的质量具有广泛的社会效益和经济效应。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的发明目的是提供一种蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽。
本发明的另一发明目是提供上述蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽的应用，所述特征多肽可以大大提高蝮蛇蛇毒药物的质量控制水平，对蝮蛇蛇毒、中间体及其药物制剂的质量控制均有很好地指导作用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽，氨基酸序列为WDDYTYSWK。
优选地，所述蝮蛇为乌苏里蝮蛇（Gloydius ussuriensis)、短尾蝮蛇（Gloydius brevicaudus）、哈里氏蝮蛇(Gloydius halys)、日本蝮蛇（Gloydius blomhoffii）。
一种上述蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽在控制蝮蛇蛇毒、中间体或药物制剂质量方面的应用。
进一步地，上述应用采用以下步骤：
（1）取氨基酸序列为WDDYTYSWK的蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽，溶解并稀释制成系列浓度对照品溶液；
（2）在待测样品中加入胰蛋白酶进行酶解预处理，灭活后取上清液，作为供试品溶液；
（3）取步骤（1）和（2）所述对照品溶液和供试品溶液分别注入液相色谱-质谱仪，采用电喷雾正离子模式，进行多反应监测，以质荷比m/z双电荷632.4→624.0作为定量离子对，以质荷比m/z双电荷632.4→962.7作为定性离子对；
（4）提取离子对双电荷632.4→624.0色谱图，以系列浓度对照品溶液中特征多肽的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程，r>0.99，根据回归方程计算待测供试品溶液浓度，计算待测样品中蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽的含量，进而控制待测样品的质量。
优选地，所述蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽检出限为2 ng/mL，定量限为5 ng/mL。
优选地，步骤（3）所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件中，质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测，以质荷比m/z双电荷632.4→624.0作为定量离子对，以质荷比m/z双电荷632.4→962.7作为定性离子对；涡旋离子喷雾温度500 ℃；离子化电压5.0 kV；碰撞室出口电压10 V；入口电压EP 10 V；碰撞能量CE均为45 V，去簇电压DP均为60 V；
优选地，步骤（3）所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件中，液相条件为：Agilent Poroshell 120，SB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序：0→2 min，流动相A 85%；2→6 min，流动相A 85%→60%；6.1→8 min，流动相A 30%；8.1→10 min，流动相A 85%。
优选地，步骤（1）的具体操作为：称取蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽10 mg，用25mmol/L 碳酸氢铵溶液溶解并稀释至100 mL，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液稀释制成浓度为5ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL系列浓度对照品溶液。
优选地，步骤（2）所述具体操作为：称取待测样品10 mg用25 mmol/L 碳酸氢铵溶液溶解并稀释至100 mL；精密量取1 mL，加1 mg/mL 胰蛋白酶溶液（临用新配）10 μL，37 ℃反应2小时，100 ℃灭活10分钟，放冷至室温，12000 rpm离心10分钟，取上清液作为供试品溶液。
本发明可以实现的有益效果：
（1）蝮蛇蛇毒磷脂酶A2是蝮蛇蛇毒、中间体及配制制剂用原料药制备过程中的主要杂质，本发明所述的特征多肽可以用来作为蝮蛇蛇毒药物制备过程中蛇毒磷脂酶A2杂质检测的对照品，以此来监测蛇毒制品的质量；
（2）本发明所述的蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽检出限可达2 ng/mL，定量限可达5ng/mL，检测准确度高，对蛇毒药物制品中的杂质进行定性和定量分析，填补了蝮蛇蛇毒药物质量标准的空白，对控制蝮蛇蛇毒产品质量具有重要意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1中筛选出的蛇毒磷脂酶A2特征多肽的一级质谱图；
图2为实施例1中筛选出的蛇毒磷脂酶A2特征多肽的二级质谱图；
图3为实施例2中空白溶液的专属性考察图谱；
图4为实施例2中特征多肽对照溶液的专属性考察图谱；
图5为实施例2中蛇毒样品溶液的专属性考察图谱；
图6为实施例2中蛇毒样提取物样品溶液的专属性考察图谱；
图7为实施例2中蛇毒样品溶液的线性及范围图谱；
图8为实施例2中蛇毒样品溶液的检出限图谱；
图9为实施例2中蛇毒样品溶液的定量限图谱。
具体实施方式
在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在限制本发明。
除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
下列实施例中，蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽的筛选和确定，其采用的仪器设备、色谱质谱条件、质谱条件等采用专利文献“一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用”（申请号202010752988.2）中实施例1公开的内容。
实施例1
该实施例旨在筛选特征多肽，以纯化的磷脂酶A2为分析物，采用纳升液相-高分辨质谱仪，方法侧重于获得丰富的酶解肽段，保证筛选范围具有尽可能高的覆盖率。
特征多肽筛选用溶液的制备，包括如下步骤：
将5 mg白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2置于容积为10 mL的容量瓶中，然后用摩尔浓度为25 mmol/L的碳酸氢铵溶液溶解并定容至10 mL，并精密量取200 μL，得到溶液a。
向所述溶液a中加入浓度为0.2 mol/L的二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，在60 ℃的恒温水浴加热条件下反应1小时，然后加入浓度为0.2 mol/L的碘乙酰胺溶液20 μL，避光放置30 min。
再加入760 μL浓度为25 mmol/L的碳酸氢铵溶液和10 μL浓度为 0.4 mg/mL胰蛋白酶溶液（临用新制），37 ℃反应90 min后，90 ℃灭活10 min，放冷至室温，1200 rpm离心10 min，取上清液作为特征多肽筛选用溶液。
采用纳升液相分离进样，利用高分辨质谱采集该特征多肽筛选用溶液的一级和二级质谱图。
搜库筛选及确定：用NCBI和UniProt对相关蛇蛋白库和毒液蛋白库进行整合，建立蛇及毒液数据库。通过Uniprot提供的Peptidemass功能模拟胰蛋白酶酶解不同物种磷脂酶A2蛋白的结果，并使用Proteome Discoverer软件（2.2版）对实测样品质谱数据进行搜库，根据长度为8~25氨基酸、无人为修饰位点、无漏切位点等原则筛选候选特征多肽。结果显示，氨基酸序列为“WDDYTYSWK”的候选特征多肽除在乌苏里蝮蛇（Gloydius ussuriensis)的亚种白眉蝮蛇中蝮蛇中发现外，NCBI检索显示，短尾蝮蛇（Gloydius brevicaudus）、哈里氏蝮蛇(Gloydius halys)、日本蝮蛇（Gloydius blomhoffii），都有这个肽段，而其他蛇毒成分中均不含有该氨基酸序列，且该特征多肽质谱响应高、干扰少，可作为上述几种蝮蛇蛇毒磷脂酶A2的特征多肽，该特征多肽的分子量和二级质谱都与理论值相符，见图1和图2。
实施例2
本实施例所述的“供试品溶液”是基于检测实施例1已筛选出的目标特征多肽WDDYTYSWK，最大程度提高样品的酶解效率，不需要考虑其他酶解肽段，因此优化后的方法无需使用实施例1中二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行处理。
多反应监测（MRM）定量分析样品中的蝮蛇蛇毒磷脂酶A2。
1、仪器设备：SCIEX Triple Quad 6500三重四级杆质谱仪，CP225D电子天平（Sartorius，德国），Sigma3-30K冷冻离心机（Sigma，德国），密理博Milli-QAdvantageA10超纯水仪（Millipore，美国）。
2、色谱质谱条件：
（1）液相条件：Agilent Poroshell 120, SB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序：0→2 min，流动相A 85%；2→6 min，流动相A 85%→60%；6.1→8 min，流动相A 30%；8.1→10 min，流动相A 85%。
（2）质谱条件：质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测，以质荷比m/z双电荷632.4→624.0作为定量离子对，以质荷比m/z双电荷632.4→962.7作为定性离子对；涡旋离子喷雾温度500 ℃；离子化电压：5.0 kV；碰撞室出口电压10 V；入口电压EP 10V；碰撞能量CE均为45 V，去簇电压DP均为60 V。
3、对照品溶液制备：
（1）精密称量实施例1筛选得到的特征多肽（WDDYTYSWK）10 mg，将其置于容积为100 mL的容量瓶中，用浓度为25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解该对照品并定容至100 mL，摇匀，得到溶液b。
（2）精密量取所述溶液b 1 ml，置于容积为100 mL的容量瓶中，然后加入浓度为25mmol/L的碳酸氢铵溶液定容至100 mL，摇匀，得到溶液c。
（3）精密量取10 ml所述溶液c，置于容积为100 mL的容量瓶中，然后加入浓度为25mmol/L的碳酸氢铵溶液定容至100 mL，摇匀，得100 ng/mL特征多肽储备液。
（4）精密量取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3. 0mL、4.0 mL、5.0 mL步骤（3）制备的特征多肽储备液，然后分别于容积为10 ml的容量瓶中，分别加入25 mmol/L碳酸氢铵溶液定容至10 mL，摇匀，得浓度分别为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL的对照品溶液，备用。
4、供试品溶液制备：取待测样品10 mg，置于容积为100 mL的容量瓶中，然后加入浓度为25 mmol/L的碳酸氢铵溶液定容至100 mL，摇匀，得到溶液d；精密量取1 mL溶液d，加入浓度为1 mg/mL的胰蛋白酶溶液（临用新制）10 μL，在37 ℃下反应2小时，100 ℃灭活10分钟，放冷至室温，12000 rpm离心10分钟，取上清液作为供试品溶液。
5、空白溶液制备：精密量取浓度为25 mmol/L的碳酸氢铵溶液1 mL，加入1 mg/mL胰蛋白酶溶液（临用新制）10 μL，37 ℃下反应2小时，100 ℃灭活10分钟，放冷至室温，12000 rpm离心10分钟，取上清液作为空白溶液。
6、待测样品中磷脂酶A2含量计算：取上述供试品溶液和空白溶液各10 μL，按照本实施第2项中的色谱质谱条件进行检测，以系列浓度对照品溶液中特征多肽的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程，r>0.99，从回归方程求计算供试品溶液浓度，进而计算待测样品中磷脂酶A2特征多肽含量。
7、专属性考察：取所述供试品溶液、空白溶液和对照品溶液各10 μL，进行液质分析，积分分别如图3至图6所示，其结果显示：空白溶液在对照品溶液出峰位置没有干扰峰出现，供试品溶液在对照品溶液出峰位置有响应色谱峰出现，表明该方法专属性良好。
8、检出限与定量限：取两份浓度为10 ng/mL的对照品溶液，用浓度为25 mmol/L碳酸氢铵溶液稀释，制得浓度为2 ng/mL和5 ng/mL的对照品溶液，量取上述浓度为2 ng/mL和5 ng/mL的对照品溶液10 μL，采用高效液相色谱-质谱联用仪以质荷比m/z双电荷632.4→624.0作为定量离子对进行检测，结果如图8、图9所示。可以看出：对照品溶液浓度为2 ng/mL时特征多肽的定量离子对的信噪比为7.4，浓度为5 ng/mL时信噪比40.6，因此以2 ng/mL和5 ng/mL分别作为检出限和定量限。
9、线性及范围：将上述制备的浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40ng/mL、50 ng/mL的对照品系列标准溶液，以质荷比m/z双电荷632.4→624.0作为定量离子对进行检测。以系列浓度对照品溶液中特征多肽的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程：y=28164x-21066（R2=0.9968），在5 ng/mL～50 ng/mL范围内，特征多肽的浓度与色谱峰面积成线性关系，结果如图7所示。
10、重复性：按照供试品（白眉蝮蛇蛇毒样品批号：20170802）溶液制备方法，平行制备6份后进行分析，以质荷比m/z双电荷632.4→624.0作为定量离子对进行检测。结果如表1所示，可以看出：六次平行测得含量RSD为3.0%，说明测试方法重复性良好。
表1
11、精密度考察：取浓度为10 ng/ml的对照品溶液，连续重复进样6次，以质荷比m/z双电荷632.4→624.0作为定量离子对，测得峰面积，RSD为0.8%，说明仪器精密度良好。
表2
12、稳定性考察：取供试品（白眉蝮蛇蛇毒批号：20170802）溶液，处理后置于8 ℃，分别于0、2、4、6、8、16及24小时进样测定，以质荷比m/z双电荷632.4→624.0作为定量离子对，结果如表3所示，可以看出：测得峰面积RSD为3.0%，说明供试品溶液中特征多肽在8 ℃下24小时内稳定。
表3
13、回收率考察：精密称取已知磷脂酶A2特征多肽含量的蛇毒样品（白眉蝮蛇蛇毒批号：20170802，特征多肽含量84.1 ng/mg）10.27 mg，用浓度为10 ng/mL对照品溶液（25mmol/L碳酸氢铵水溶液溶解）溶解并稀释至100 mL；取6份，每份1 mL，各加入特征多肽溶液，制备回收率考察溶液，以质荷比m/z双电荷632.4→624.0作为定量离子对，进行检测。结果显示三个水平的回收率均在85.3%～94.0%范围内，平均回收率89.6%，RSD为4.2%，该方法回收率良好。结果见表4。
表4
14、样品检测：按照本实施例第3~6项中的方法，对三批次白眉蝮蛇蛇毒（20180601F、20180702F、20170802）及三批不同提取方式的白眉蝮蛇蛇毒提取物（20210612、20210712、20170802）中的蛇毒磷脂酶A2特征多肽进行检测。结果见表5。
表5
在本实施例中，磷脂酶A2为临床止血药物注射用白眉蛇毒血凝酶的有害残留蛋白，可导致神经毒性等不良反应，必须严格控制其含量。利用本发明方法，可准确检测蛇毒、工艺中间体及终产品中蛇毒磷脂酶A2的含量，对于优选蛇毒原料、优化生产工艺、提高产品安全性有重要意义。
以上所述仅说明了本发明的几个实施方式，并不能因此而理解是对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的其他人员来说，在不脱离本发明的构思和范围的情况下，还可进行修改替换改进等，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的专利保护范围应以所描述的根据权利要求为准。
序列表
<110> 山东省食品药品检验研究院
<120> 一种蝮蛇蛇毒磷脂酶A2特征多肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 蝮蛇(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Trp Asp Asp Tyr Thr Tyr Ser Trp Lys
1 5