阅读说明：本技术 一种莱鲍迪苷d的制备方法及其产品和应用 (Preparation method of rebaudioside D, and product and application thereof ) 是由 李丽 聂在建 程保华 李德春 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种莱鲍迪苷D的制备方法及其产品和应用,所述制备方法包括以甜菊苷为原料,以乙酸乙酯和β-环糊精为糖基供体,在复合酶的催化下发生转化反应,生成莱鲍迪苷D。本发明采用廉价易得的乙酸乙酯和β-环糊精作为糖基供体,替换成本高昂的UDP-葡萄糖,在复合酶的催化作用下生成莱鲍迪苷D,该反应为制备莱鲍迪苷D开辟了新的途径,反应的产物得率高,制备工艺简单,适用于工业化生产,具有广阔的应用前景。(The invention provides a preparation method of rebaudioside D, a product and application thereof. According to the invention, ethyl acetate and beta-cyclodextrin which are cheap and easy to obtain are used as glycosyl donors to replace UDP-glucose with high cost, rebaudioside D is generated under the catalytic action of the complex enzyme, the reaction opens up a new way for preparing rebaudioside D, the product yield of the reaction is high, the preparation process is simple, and the method is suitable for industrial production and has wide application prospect.)

一种莱鲍迪苷D的制备方法及其产品和应用

技术领域

本发明属于生物催化转化技术领域，涉及一种莱鲍迪苷D的制备方法及其产品和应用，尤其涉及一种以乙酸乙酯和β-环糊精为糖基供体的莱鲍迪苷D的制备方法及其产品和应用。

背景技术

甜菊苷(Steviol glycosides)是从菊科草本植物甜叶菊叶中提取的天然甜味剂。是多种糖苷的混和物，不同糖苷在味质上存在较大的差异。甜菊苷具有高甜度、低热量、高稳定性，以及抗高血糖、抗高血压、抗炎症、抗肿瘤、抗腹泻等潜在疗效，免疫调节等效果，将其作为甜味剂应用于食品和饮料中的相关研究与经济性受到广泛关注。在美国和欧盟高纯度的甜菊糖产品已被正式批准作为食品添加剂。

近年来，已从甜叶菊中分离得到十多种糖苷。莱鲍迪苷D(Rebaudioside D，Reb D)是其中最有应用潜力的甜菊糖苷，与其它甜菊糖苷相比，其甜度高，约为蔗糖的300-350倍，且甜味纯正，口感也更接近蔗糖，没有甘苦味和甘草异味，稳定性好，是一种理想的天然高倍甜味剂产品。2013年，美国FDA批准使用从甜叶菊叶子中提取的含有50％含量莱鲍迪苷D的甜菊糖产品，并承认它的一般安全性(GRAS)。

甜叶菊叶子中莱鲍迪苷D的含量极少(少于5％)，采用提取法生产莱鲍迪苷D需要大量的甜叶菊原料，另外富集莱鲍迪苷D的工艺繁琐，提取后需要多次过柱和脱盐、脱色、重结晶，并在生产过程中产生大量的废水，其生产成本较高，不适合工业化大生产。

CN107446874A公开了一种利用重组大肠杆菌生产莱鲍迪苷D的方法，利用生物学方法构建重组大肠杆菌，将eugt11基因引入大肠杆菌中诱导表达，得到重组蛋白酶，催化莱鲍迪苷A(RA)转化成莱鲍迪苷D(RD)，但该方法涉及菌种改造，方法稳定性有待提高。

CN104726523A公开了一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法，该方法利用番茄UDP-糖基转移酶和土豆蔗糖合成酶，以莱鲍迪苷A和蔗糖为原料生产莱鲍迪苷M。该方法首先利用基因工程技术获得UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合酶的高产重组菌株，然后收集生物酶粗品直接进行催化反应，反应体系中不添加UDP或UDP-葡萄糖，以莱鲍迪苷A和蔗糖为原料，通过蔗糖合酶催化UDP-葡萄糖高效循环，通过番茄UDP-葡萄糖基转移酶的作用，催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M。但该方法并不适用于莱鲍迪苷D的生产。

目前生物酶法合成莱鲍迪苷D的方法需要外加昂贵的UDP-葡萄糖为底物，通过UDP-葡萄糖基转移酶的作用，以甜菊苷或莱鲍迪苷A为底物，催化生成莱鲍迪苷D。但由于UDP-葡萄糖极高的售价，几乎完全限制了工业化制备莱鲍迪苷D的可行性，经济性较差、缺乏市场竞争力。

因此，提供一种经济的制备莱鲍迪苷D的方法具有重要意义和广阔市场前景。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种莱鲍迪苷D的制备方法及其产品和应用，本发明采用廉价易得的乙酸乙酯和β-环糊精作为糖基供体，替换成本高昂的UDP-葡萄糖，在复合酶的催化作用下生成莱鲍迪苷D，该反应为制备莱鲍迪苷D开辟了新的途径，反应的产物得率高，制备工艺简单，适用于工业化生产，具有广阔的应用前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种莱鲍迪苷D的制备方法，所述制备方法包括以甜菊苷为原料，以乙酸乙酯和β-环糊精为糖基供体，在复合酶的催化下发生转化反应，生成莱鲍迪苷D。

本发明中，发明人意外发现可采用廉价易得的乙酸乙酯和β-环糊精作为糖基供体，以甜菊苷为底物原料，在复合酶的催化下反应生产莱鲍迪苷D，替换现有技术中成本高昂的UDP-葡萄糖，乙酸乙酯通常用作萃取剂或有机溶剂，但其与β-环糊精共同使用可作为甜菊苷的糖基供体，使整个制备工艺更加简单高效，提高莱鲍迪苷D的产率，为工业化生产奠定基础。需要特别说明的是，在甜菊苷转化为莱鲍迪苷D的过程中会先转化成莱鲍迪苷A，进而转化为莱鲍迪苷D，因此，此处也可以用莱鲍迪苷A作为底物原料，采用上述相同的技术手段进行制备莱鲍迪苷D。

优选地，所述甜菊苷的初始反应浓度为0.1-3g/L，例如可以是0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、1.6g/L、1.7g/L、1.8g/L、1.9g/L、2g/L、2.1g/L、2.2g/L、2.3g/L、2.4g/L、2.5g/L、2.6g/L、2.7g/L、2.8g/L、2.9g/L或3g/L。

优选地，所述乙酸乙酯和甜菊苷的质量比为(40-200):1，例如可以是40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1、105:1、110:1、115:1、120:1、125:1、130:1、135:1、140:1、145:1、150:1、155:1、160:1、165:1、170:1、175:1、180:1、185:1、190:1、195:1或200:1。

本发明中，通过调整乙酸乙酯与甜菊苷的用量比例，发现在乙酸乙酯和甜菊苷比例低于40:1或者高于200:1时，都会使莱鲍迪苷D的转化率降低，这可能与低浓度乙酸乙酯无法满足酶促反应要求，而高浓度乙酸乙酯影响了体系中的酶活有关。

优选地，所述β-环糊精和甜菊苷的质量比为(30-100):1，例如可以是30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。

本发明中，通过调整β-环糊精和甜菊苷的质量比，发现在β-环糊精和甜菊苷比例低于30:1或者高于100:1时，都会使莱鲍迪苷D的转化率降低，这可能与低浓度β-环糊精无法满足酶促反应要求，而高浓度β-环糊精的包埋作用影响了体系中的酶促反应有关。

优选地，所述复合酶包括酰基转移酶和糖基转移酶。

优选地，所述酰基转移酶包括棕榈酰转移酶。

优选地，所述糖基转移酶包括环糊精糖基转移酶。

本发明中，通过棕榈酰转移酶和环糊精糖基转移酶的组合作为复合酶，并调整两种酶的用量，可进一步提高甜菊苷转化为莱鲍迪苷D的产率，使得甜菊苷主要转化为莱鲍迪苷D，超出本发明所述复合酶配比范围，均降低莱鲍迪苷D的得率。

优选地，所述环糊精糖基转移酶在反应体系中的添加量为25000-50000U/L，例如可以是25000U/L、30000U/L、35000U/L、40000U/L、45000U/L或50000U/L等。

本发明中，环糊精糖基转移酶添加量低于25000U/L时，会使莱鲍迪苷D的转化率降低，添加量高于50000U/L时，生成大量副产物，也会使莱鲍迪苷D的转化率降低。

优选地，所述棕榈酰转移酶在反应体系中的添加量为50000-100000U/L，例如50000U/L、60000U/L、70000U/L、80000U/L、90000U/L或100000U/L等。

本发明中，棕榈酰转移酶添加量低于50000U/L时，会使莱鲍迪苷D的转化率降低，添加量高于100000U/L时，生成大量副产物，也会使莱鲍迪苷D的转化率降低。

优选地，所述转化反应采用水相体系，在pH＝6-8(例如pH＝6、pH＝7或pH＝8等)的缓冲液中进行生物转化。

优选地，所述转化反应的温度为20-50℃，例如可以是20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、48℃或50℃等，优选为35-40℃。

优选地，所述转化反应的时间为1-24h，例如可以是1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h，优选为16-20h。

作为本发明的优选技术方案，所述制备方法具体包括如下步骤：

以甜菊苷为原料，以乙酸乙酯和环糊精为糖基供体，以棕榈酰转移酶和环糊精糖基转移酶组成的复合酶为工具酶，在pH＝6-8的缓冲液水相体系中进行生物转化，反应温度20-50℃，反应时间1-24h，得到含有莱鲍迪苷D的水溶液；任选地，所述水溶液分离纯化后得高纯度的莱鲍迪苷D；

其中，所述甜菊苷的初始浓度为0.1-3g/L，所述乙酸乙酯和甜菊苷的质量比为(40-200):1，所述β-环糊精和甜菊苷的质量比为(30-100):1，所述复合酶中环糊精糖基转移酶的添加量为25000-50000U/L；所述棕榈酰转移酶的添加量为50000-100000U/L。

本发明中，通过本发明的方法制备得到主产物为莱鲍迪苷D的水溶液，可选择地进行分离纯化，得到高纯度的莱鲍迪苷D，分离纯化方式典型但非限定的如结晶、膜浓缩、树脂分离等。

以甜菊苷为底物的酶催化法通常只能得到多种糖苷的混合物，通过调控反应条件和使用的酶的种类，使得某种特定糖苷为主要产物，本发明通过调控原料、糖基供体、复合酶的种类和比例关系，使得反应主要生成莱鲍迪苷D，显著提高莱鲍迪苷D的产率。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的制备方法得到的莱鲍迪苷D组合物或莱鲍迪苷D纯化产物。

第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的莱鲍迪苷D组合物或莱鲍迪苷D纯化产物在制备甜味剂、食品、饮料、口腔卫生产品或药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的莱鲍迪苷D制备方法开创性地采用廉价易得的乙酸乙酯和β-环糊精为复合糖基供体，替换昂贵的UDP-葡萄糖，实现莱鲍迪苷D的制备；

(2)本发明使用棕榈酰转移酶和环糊精糖基转移酶作为复合酶，在本发明所述酶的配比条件下，以及本发明所述比例的乙酸乙酯存在的条件下，能够将β-环糊精上的葡萄糖基添加到甜菊苷相应位点，从而将其转变为莱鲍迪苷D；

(3)本发明提供的制备方法简单高效，适用于工业规模生产，提高莱鲍迪苷D的产率。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

下述各实施例中涉及的莱鲍迪苷D转化率为制得的莱鲍迪苷D质量与甜菊苷质量之比值。

实施例1

配制水相反应体系，甜菊苷的初始反应浓度为2g/L，乙酰乙酯的初始反应浓度为80g/L，β-环糊精的初始反应浓度为60g/L，棕榈酰转移酶初始反应浓度为87000U/L、β-环糊精糖基转移酶初始反应浓度为42000U/L，利用磷酸盐缓冲液调节反应体系在pH＝7。

将水相反应体系置于恒温摇床中，反应温度为35℃，反应时间为24h。即可制得含有莱鲍迪苷D的水溶液，利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为1.57g/L，转化率为78.5％。

实施例2

配制水相反应体系，甜菊苷的初始反应浓度为0.1g/L，乙酰乙酯的初始反应浓度为20g/L，β-环糊精的初始反应浓度为10g/L，棕榈酰转移酶初始反应浓度为57000U/L、β-环糊精糖基转移酶初始反应浓度为28000U/L，利用磷酸盐缓冲液调节反应体系在pH＝6。

将水相反应体系置于恒温摇床中，反应温度为40℃，反应时间为16h。即可制得含有莱鲍迪苷D的水溶液，利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为0.06g/L，转化率为60％。

实施例3

配制水相反应体系，甜菊苷的初始反应浓度为3g/L，乙酰乙酯的初始反应浓度为120g/L，β-环糊精的初始反应浓度为90g/L，棕榈酰转移酶初始反应浓度为90000U/L、β-环糊精糖基转移酶初始反应浓度为46000U/L，利用磷酸盐缓冲液调节反应体系在pH＝8。

将水相反应体系置于恒温摇床中，反应温度为37℃，反应时间为24h。即可制得含有莱鲍迪苷D的水溶液，利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为2.57g/L，转化率为85.7％。

实施例4

与实施例1相比的区别仅在于“乙酰乙酯的初始反应浓度为60g/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为0.75g/L，转化率为37.5％。

实施例5

与实施例2相比的区别仅在于“乙酰乙酯的初始反应浓度为45g/L”，其他条件同实施例2。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为0.05g/L，转化率为2.5％。

实施例6

与实施例1相比的区别仅在于“β-环糊精的初始反应浓度为50g/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为0.35g/L，转化率为17.5％。

实施例7

与实施例2相比的区别仅在于“β-环糊精的初始反应浓度为25g/L”，其他条件同实施例2。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为0.48g/L，转化率为24.0％。

实施例8

与实施例1相比，除了不添加棕榈酰转移酶之外，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为0.37g/L，转化率为18.5％。

实施例9

与实施例1相比，除了不添加β-环糊精糖基转移酶之外，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为0.41g/L，转化率为20.5％。

实施例10

与实施例1相比的区别仅在于“棕榈酰转移酶初始反应浓度为40000U/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为0.38g/L，转化率为19.0％。

实施例11

与实施例1相比的区别仅在于“棕榈酰转移酶初始反应浓度为110000U/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为0.41g/L，转化率为20.5％。

实施例12

与实施例1相比的区别仅在于“β-环糊精糖基转移酶初始反应浓度为20000U/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为0.45g/L，转化率为22.5％。

实施例13

与实施例1相比的区别仅在于“β-环糊精糖基转移酶初始反应浓度为60000U/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷D的浓度为0.50g/L，转化率为25.0％。

由上述实施例的数据结果可知：本发明以乙酸乙酯和β-环糊精作为糖基供体，以甜菊苷为底物原料，在环糊精糖基转移酶和棕榈酰转移酶的催化下反应可以生产莱鲍迪苷D，且转化率较高。其中，乙酸乙酯和β-环糊精的添加浓度、环糊精糖基转移酶和棕榈酰转移酶的添加浓度均是影响其转化率的关键因素，且单一添加环糊精糖基转移酶或棕榈酰转移酶时莱鲍迪苷D的转化率很低。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种莱鲍迪苷D的制备方法及其产品和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。