人参皂苷的生物制备方法
阅读说明：本技术 人参皂苷的生物制备方法 (Biological preparation method of ginsenoside ) 是由 王宇 李玉花 吴昊 曹领改 张贺 张旸 于 2020-04-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了人参皂苷的生物制备方法,包括：(1)通过组织培养方式诱导生产人参不定根；(2)将诱导的人参不定根转到旋转摇床中的液体培养基中培养；(3)将人参不定根从摇瓶转移到生物反应器中培养一段时间后添加茉莉酸甲酯诱导人参皂苷含量增加；(4)从诱导培养后的不定根中提取人参皂苷；(5)用β-葡萄糖苷酶作为转化酶以人参皂苷混合液为转化底物进行酶促转化反应。本发明提供了组合的人参皂苷的生物制备方法,包括组织培养、酶固定化和水解方法来获得稀有人参皂苷。本发明筛选到6种β-糖苷酶进行酶促水解并将它们组合使用,转化产物中稀有人参皂苷的含量明显提高。本发明生物制备方法可替代直接从人参中提取人参皂苷的方法。(The invention discloses a biological preparation method of ginsenoside, which comprises the following steps: (1) inducing and producing the ginseng adventitious root by a tissue culture mode; (2) transferring the induced ginseng adventitious root into a liquid culture medium in a rotary shaking table for culture; (3) transferring the ginseng adventitious roots from the shake flask to a bioreactor to culture for a period of time, and adding methyl jasmonate to induce the increase of the content of ginsenoside; (4) extracting ginsenoside from adventitious roots after induction culture; (5) and (3) carrying out enzymatic conversion reaction by taking beta-glucosidase as converting enzyme and ginsenoside mixed liquor as a conversion substrate. The invention provides a biological preparation method of combined ginsenoside, which comprises tissue culture, enzyme immobilization and hydrolysis methods to obtain rare ginsenoside. 6 kinds of beta-glycosidases are screened out for enzymatic hydrolysis and are combined for use, and the content of rare ginsenoside in the converted product is obviously improved. The biological preparation method of the invention can replace the method for directly extracting ginsenoside from ginseng.)
技术领域
本发明涉及人参皂苷的制备方法，尤其涉及通过生物转化制备人参皂苷的方法，属于人参皂苷的生物制备领域。
背景技术
人参皂苷是人参的主要药理成分，特别是稀有人参皂苷是发挥抗肿瘤、抗炎症、提高免疫力等功能的分子。由于野生人参中皂苷含量低，稀有人参皂苷的来源极为有限，限制了其在功能性食品和药物中的应用。
因此，在生产实践中亟待需要提供一种效率和产率高的人参皂苷的制备方法。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种产率高的人参皂苷的生物制备方法；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种人参皂苷的生物制备方法，包括：(1)通过组织培养方式诱导生产人参不定根；(2)将诱导的人参不定根转到旋转摇床中的液体培养基中培养；(3)将人参不定根从摇瓶转移到生物反应器中培养一段时间后添加茉莉酸甲酯诱导人参皂苷含量增加；(4)从诱导培养后的不定根中提取人参皂苷。
其中，步骤(1)中所述的通过组织培养方式诱导生产人参不定根的方法包括：(a)将人参根片接种于含1.0mg L-1 2,4-D+0.1mg L-1 kinetin+30g L-1蔗糖的诱导培养基上诱导愈伤组织；(b)愈伤组织转移到含5.0mg L-1 IBA的MS培养基上进行愈伤组织的扩繁；(c)在含3.0mg L-1 IBA和30g L-1蔗糖的MS固体培养基上培养愈伤组织，从愈伤组织中诱导不定根的生成。
步骤(3)中所述添加茉莉酸甲酯是添加200μM茉莉酸甲酯以诱导人参皂苷含量增加；优选的，将人参不定根从摇瓶转移到生物反应器中培养第50天时添加200μM茉莉酸甲酯诱导人参皂苷含量增加。
步骤(4)中所述从人参不定根中提取人参皂苷的方法包括：(a)将人参根粉添加到甲醇/水混合物中37℃过夜；(b)用甲醇为溶剂采用超声波仪提取：(c)将提取液的上清液过滤除菌，蒸发去除甲醇，残渣溶解于水，即得；其中，步骤(a)中甲醇/水混合物由甲醇与水按照4:1的体积比组成；步骤(b)中用80％甲醇为溶剂在超声波仪室温下提取3次，每次提取时间为0.5h。
为了进一步提高不定根中的稀有人参皂苷的含量，采用β-葡萄糖苷酶作为转化酶以从不定根中提取的人参皂苷混合液为转化底物进行酶促转化反应，转化产物中稀有人参皂苷的含量能显著提高。
本发明发现将β-葡萄糖苷酶加入到PPD型人参皂苷混合物中进行酶促反应，能够有效的提高转化产物中稀有人参皂苷的含量；其中，所述的β-葡萄糖苷酶优选自BglSk，BglPm，Bgp1，BglBX10，Tpebgl3或Abf22-3中的任何一种或一种以上的任意组合；其中，所述的酶促反应可以是将β-葡萄糖苷酶溶液与PPD型人参皂苷混合物在37℃的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中进行反应。
酶促反应完成后进行UPLC分析检测人参皂苷的相对含量，并与未经处理的对照进行了比较分析，结果发现，Bgpl、BglBX10和Abf22-3将Rd转换为Rg3，Tpebgl3将Rb1和Rd都转换为Rg3。上述四种反应中Rg3的生成量约占PPD型人参皂苷混合物的15％～30％，Tpebgl3在149.74±5.67mg时达到峰值。BglPm与其他四种具有C-20水解活性的酶(Bgpl、BglBX10、Tpebgl3和Abf22-3)的所有组合酶处理产生超过40％的Rh2，以及超过10％的CMc1和CO。BglSk与这四种酶分别组合可以产生适量的Rg3、Gyp75、CMc、CY和Rh2，比例在10％到20％之间。BglPm和BglSk均能产生高比例的CK(277.61±4.27mg，34.22±1.91％)。在所有转化过程中，利用BglPm+Bgp1组合水解3.0g PPD型人参皂苷混合物，获得的Rh2产率最高(326.61±7.04mg)，占PPD型人参皂苷混合物的10.89±0.23％
本发明中所述的β-葡萄糖苷酶BglSk，BglPm，Bgp1，BglBX10，Tpebgl3或Abf22-3可通过商业化途径购买得到也可以采用本领域常规的基因工程手段制备得到重组β-葡萄糖苷酶，均能适用于本发明。
为了提高酶的利用率和β-葡萄糖苷酶与产物的分离效率，本发明进一步将β-葡萄糖苷酶进行固定化得到固定化的β-葡萄糖苷酶，采用固定化的β-葡萄糖苷酶进行酶促反应能够有效的提高酶的利用率和酶以及产物的分离效率。
作为一种参考，所述的β-葡萄糖苷酶的固定化方法包括：采用分子量为30kDa的聚砜中空纤维膜(MWCO)固定化酶。将膜在磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中平衡30min，采用压力驱动过滤法固定化酶；将β-葡萄糖苷酶溶液(0.5mg mL-1)用蠕动泵以10mL min-1的流速泵入通过膜的腔中，循环2h。β-葡萄糖苷酶被包埋在不对称的、含水的多孔膜中，并被内表面的30kDa纤维膜所固定，即得。
本发明以中空纤维膜固定化重组His-Bgp1和His-BglPm为例进行了将PPD型人参皂苷混合物转化为Rh2的实验，验证了该方法的有效性。固定化后的β-葡萄糖苷酶具有较高的重复利用率，在第9天进行了9个周期的重复催化反应后，其相对活性保持在85％左右。固定化β-葡萄糖苷酶即使在连续15个周期的重复催化反应后仍能保持40％的初始活性。
本发明提供了一种组合的人参皂苷的生物制备方法，包括组织培养、酶固定化和水解方法来获得稀有人参皂苷；本发明根据糖苷酶水解途径筛选到6种β-糖苷酶进行酶促水解，并将它们组合使用，转化产物中稀有人参皂苷Rg3、Rh2、CK、Gyp75、CMc、CY的产量范围为5.54-32.66mg L-1。在优化的pH和温度条件下，固定化BglPm和Bgp1可使Rh2的产率提高7％，最高可达51.17mg L-1(PPD型人参皂苷混合物的17.06％)。本发明的生物制备方法为获得多种稀有人参皂苷提供了一种高效的途径，可以替代直接从人参中提取人参皂苷的方法。
附图说明
图1稀有人参皂苷生物转化系统示意图。
图2糖苷酶转化PPD型人参皂苷的生物转化途径。
图3在生物反应器中培养人参不定根有效生产人参皂苷；(A)人参不定根接种在固体增殖培养基上生长；(B)不定根在固体培养基上生长1个月的增殖情况；(C)不定根在液体培养基中进一步培养7天；(D)不定根扩大到10L生物反应器并生长2个月；(E)不定根和5年生野生人参根中大量人参皂苷的含量。
图4纯化后糖苷酶SDS-PAGE结果图。
图5糖苷酶最适条件温度与pH等高线图。
图6糖苷酶组合处理PPD型人参皂苷混合物24小时的转化的UPLC分析。
图7糖苷酶转化反应中PPD型人参皂苷的相对含量的热图。
图8所有糖苷酶组合中每种稀有的人参皂苷产量。
图9固定化β-葡萄糖苷酶的负载效率和热稳定性。(A)将Bglpm和Bgp1固定在中空纤维柱上；(B)固定化Bgp1和BglPm的储存稳定性测定。
图10β-葡萄糖苷酶Bgp1和BglPm组合转化PPD型人参皂苷混合物的UPLC结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1多种稀有人参皂苷的生物制备
1.生物反应器中培养不定根高效生产PPD型人参皂苷混合物
人参不定根的生物反应器培养是三步放大培养(图3A-D)。将根片接种于含1.0mgL-1 2,4-D，0.1mg L-1 kinetin和30g L-1蔗糖的诱导培养基上诱导愈伤组织，后将愈伤组织转移到含5.0mg L-1 IBA的MS培养基上进行扩繁。然后在含3.0mg L-1 IBA和30g L-1蔗糖的MS固体培养基上培养4周后，从愈伤组织中诱导不定根(图3A，图3B)。
收集约30g的人参不定根，并将其转移到旋转摇床中的液体培养基(1/2MS培养基，包含5mg L-1 IBA和30g L-1蔗糖)中在室温(25℃)，避光，120rpm的条件震荡培养7天((图3C)。将人参不定根从摇瓶转移到生物反应器中进行培养(培养基：1/2MS培养基，包含5mgL-1 IBA和30g L-1蔗糖，培养条件：室温(25℃)，避光，通气培养)，在4周内人参不定根的生物量没有增加。从第5周到第7周，人参不定根系处于快速生长期，进入第8周后生长变缓。在第50天添加200μM茉莉酸甲酯以诱导人参皂苷含量增加，并在第56天采集新鲜的不定根(785.98±29.43g)进行皂苷类物质的提取(图3D)。
将3g干人参根粉添加到30mL甲醇/水混合物(4:1，v/v)中，并保持在37℃过夜。用80％甲醇在超声波仪(PL-S40T，KSJ，China)功率240w中室温下提取3次，提取时间为0.5h。将各提取液的上清液混合在一起，通过0.45μm过滤器过滤除菌，将甲醇蒸发去除，残渣溶解在1mL蒸馏水中。
利用ACQUITY-UPLC-BEH-C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)(美国沃特斯)对人参皂苷进行分离和鉴定。流动相为A(含0.05％磷酸的水)和B(乙腈)。以82％溶剂A和18％溶剂B开始梯度洗脱5min，流速为0.3mL min-1。然后将洗脱溶剂改为20％溶剂B，保持1分钟，流速为0.2mL min-1，保持2分钟，然后改为25％溶剂B，保持1分钟，流速为0.3mL min-1，保持4分钟，接着是30％溶剂B，保持4分钟，流速为0.2mL min-1，保持5分钟，然后是40％溶剂B，保持2分钟，90％溶剂B，13分钟，并保持2分钟。洗脱溶剂改为18％溶剂B，流速为0.3mL min-1。检测波长为203nm，进样量为5μL。
检测结果发现，利用茉莉酸甲酯诱导10L体积生物反应器中培养的人参不定根中PPD型人参皂苷混合物为0.30±0.02g L-1，比对照培养的PPD型人参皂苷混合物高3倍(0.10±0.01g L-1)。
超高效液相色谱法(UPLC)对人参原二醇类主要皂苷(Rg1、Re、Rb1、Rd、Rc、Rb2)和一种稀有皂苷(F2)的分析表明，茉莉酸甲酯诱导的不定根中所有单体皂苷的含量均显著高于未经过诱导处理的培养根，但与5年生野生人参根的含量相似或略低(图3E)。其中Rb1含量由人参根的0.27±0.14mg g-1干重增加到1.75±0.01mg g-1，Rc含量由人参根的0.05±0.01mg g-1干重增加到1.12±0.11mg g-1。不定根中Rd含量为1.29±0.37mg g-1，与5年生野生人参根中Rd含量(1.49±0.19mg g-1)相当。不定根中Rb2含量为0.61±0.06mg g-1，是5年生野生人参根(1.88±0.27mg g-1)的三分之一(图3E)。不定根中稀有人参皂苷F2的含量仅为0.20±0.01mg·g-1，与5年生野生人参根相似。综上所述，在10L生物反应器中培养不定根2个月后，成功地提取出大量人参皂苷，可部分替代野生人参5年的生长含量。
2.PPD型人参皂苷混合物水解用β-糖苷酶的筛选、纯化及性质研究
2.1β-糖苷酶的筛选
为提高PPD型人参皂苷混合物中稀有人参皂苷的含量，采用酶转化法生产稀有人参皂苷。
选用6种β-糖苷酶对大量人参皂苷的C-3和C-20糖基进行特异性水解，用酶催化法合成稀有人参皂苷。为了水解Rb1、Rd、Rc和Rb2的C-3位糖基，从克氏杆菌中筛选出BglSk，从粘膜芽孢杆菌中筛选出BglPm。选择了另外三种β-糖苷酶(Bgp1、BglBX10和Tpebgl3)分别水解上述大量人参皂苷的C-20糖基。为了水解Rc的α-L-阿拉伯呋喃糖基，还采用了源于22-3明串珠菌的Abf22-3进行筛选实验。
表1糖苷酶的来源及性质
2.2β-糖苷酶的纯化
利用大肠杆菌表达重组糖苷酶BglPm、BglSk、Bgp1、BglBX10、Tpebgl3和Abf22-3及蛋白纯化制备。CDS序列及所有引物均由GENEWIZ科技有限公司(中国苏州)合成。将BglSk、Bgp1和BglPm经PCR扩增后克隆到pET14b载体中，将Bglbx10、Tpebgl3和Abf22-3克隆到pCold-SUMO载体中。最佳诱导条件为0.1mM IPTG在15℃下诱导培养24小时。然后在3000g下在4℃离心30分钟。用含有20mM Tris-HCl、0.5M NaCl、30mM咪唑(pH8.0)的溶液清洗细胞，然后在相同的溶液中重新悬浮，然后进行超声波处理，将完整的细胞和碎片在4℃下3000g离心30分钟，用组氨酸FF亲和柱(GE)和AKTA纯化仪(GE Healthcare，USA)纯化带有His标记的融合蛋白。重组蛋白用含有20mM Tris-HCl、0.5M NaCl和300mM咪唑(pH 8.0)的溶液洗脱。最后，将重组β-糖苷酶脱盐至50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)中。蛋白经10％SDS-PAGE和考马斯蓝染色鉴定。以牛血清白蛋白作为标准品，采用中国天根PA115双氰胺酸(BCA)蛋白检测试剂盒测定蛋白质含量。Ni2+结合琼脂糖树脂纯化蛋白的SDS-PAGE分析显示，His-Bgp1的分子量为95kDa，His-BglPm的分子量为48kDa，His-BglSk的分子量为71kDa，His-SUMO-BglBX10的分子量为105kDa，His-SUMO-Tpebgl3的分子量为96kDa，His-SUMO-Abf22-3的分子量为70kDa(图4)。结果表明，重组蛋白以可溶性形式成功表达，增加了其工业化应用的可能性。
2.3β-糖苷酶的性质
为了确定重组β-葡萄糖苷酶活性的最佳pH值和温度，在30-55℃的不同pH值(4.5-9.5)的缓冲液中以pNPG为底物研究了其水解活性。
BglPm在7.8-9.5的所有研究温度下均有较高活性(图5)。BglSk的酶活最优条件需要与BglPm相似的pH值，但温度限制在30-40℃(图5)。在类似的pH和温度条件下，Bgp1、BglBX10和Abf22-3具有80％以上的活性：pH值在7.5到8.5之间，温度在30到37℃之间(图5)。相比之下，Tpebgl3在37至55℃的高温条件下具有更高的活性(图5)。综上所述，大多数β-葡萄糖苷酶在pH 8.0和37℃时具有最佳的pH值和温度，可用于后续的人参皂苷转化。
3.β-糖苷酶水解制备多种稀有人参皂苷
将浓度为0.1mg mL-1的纯化酶溶液与3.0g PPD型人参皂苷混合物在37℃的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中反应24h。
以下实验组包括：(1)BglSk，(2)BglPm，(3)Bgp1，(4)BglBX10，(5)Tpebgl3，(6)Abf22-3，(7)BglPm+Bgp1，(8)BglPm+BglBX10，(9)BglPm+Tpebgl3，(10)BglPm+Abf22-3，(11)BglSk+Bgp1，(12)BglSk+BglBX10，(13)BglSk+Tpebgl3，(14)BglSk+Abf22-3，(15)BglSk+BglPm。
酶促反应完成后加入等体积的水饱和正丁醇以停止反应，将正丁醇上清在60℃的水浴中蒸发，然后溶解在甲醇中并用0.45μm滤膜过滤。最后的滤液进行UPLC分析检测人参皂苷的相对含量，并与未经处理的对照进行了比较分析(图6)。
根据试验结果的数据显示，四种大量人参皂苷Rb1、Rc、Rb2和Rd分别占未处理PPD型人参皂苷混合物的22.95±1.08％、24.26±0.87％、20.10±0.93％和15.68±0.47％(图7)。BglPm单酶处理产生大量的F2(262.83±4.92mg)，分别占PPD型人参皂苷混合物的46.12±1.39％，CMc1和CO的13.72±0.42％和13.39±0.40％(图7、图8)。BglSk可以水解所有类型的大量人参皂苷并以高于20％的比例生产Gyp75、CMc、CY和CK(图3D)。Bgpl、BglBX10和Abf22-3将Rd转换为Rg3，Tpebgl3将Rb1和Rd都转换为Rg3(图2、图7)。
上述四种反应中Rg3的生成量约占PPD型人参皂苷混合物的15％～30％，Tpebgl3在149.74±5.67mg时达到峰值(图8)。BglPm与其他四种具有C-20水解活性的酶(Bgpl、BglBX10、Tpebgl3和Abf22-3)的所有组合酶处理产生超过40％的Rh2，以及超过10％的CMc1和CO(图7)。BglSk与这四种酶分别组合可以产生适量的Rg3、Gyp75、CMc、CY和Rh2，比例在10％到20％之间(图7)。BglPm和BglSk均能产生高比例的CK(277.61±4.27mg，34.22±1.91％)(图7，图8)。在所有转化过程中，利用BglPm+Bgp1组合水解3.0g PPD型人参皂苷混合物获得的Rh2产率最高(326.61±7.04mg)，占PPD型人参皂苷混合物的10.89±0.23％(图8)。
4.多酶固定化聚合膜反应器提高稀有人参皂苷生产效率
为了提高酶的利用率和酶与产物的分离效率，以中空纤维膜固定化重组His-Bgp1和His-BglPm为例进行了将PPD型人参皂苷混合物转化为Rh2的实验，验证了该策略的有效性。
为了适应于常温下的工业级放大，选择在pH 8.0和25℃条件下进一步进行了基于酶固定化的人参皂苷转化反应。
采用分子量为30kDa的聚砜中空纤维膜(MWCO)固定化酶。将膜在磷酸盐缓冲液(pH8.0)中平衡30min，采用压力驱动过滤法固定化酶。将酶溶液(0.5mg mL-1)用蠕动泵以10mLmin-1的流速泵入通过膜的腔中，循环2h。酶被包埋在不对称的、含水的多孔膜中，并被内表面的30kDa纤维膜所固定(图1)。通过在不同时间点(10、20、30、40、50、60、70、80、90和120分钟)初始溶液和收集的部分之间的质量平衡来测量固定化生物催化剂的量。
采用标准分析法对固定化β-糖苷酶在25℃下进行水解，并对其贮存稳定性进行了15天的监测。反应混合物含有50mL 50mM磷酸钠缓冲液，pH值8.0，0.5mM pNPG和50mg固定化β-糖苷酶。
在每个循环中，向进料罐中加入5mL pNPG底物溶液(5mM)，然后在25℃下以最大流速(5mL min-1)在膜反应器中循环0.5h。检测上清液在400nm处的吸收，以测定对硝基苯酚的浓度。固定化酶在第一个周期后的活性被定义为对照，相对活性为100％。剩余活性的计算方法是将当天的酶活性除以固定化稳定性试验开始时(第1天)的酶活性。
固定化酶的含量在最初的60分钟内迅速增加，随后在接下来的30分钟内趋于平稳(图9A)。加载2小时后，中空纤维膜上的重组酶在约45mg处达到饱和水平，这表明非对称中空纤维膜的多孔区域(～50cm2)的最大承载浓度为0.9mg cm-2(图9A)。
固定化后的β-葡萄糖苷酶具有较高的重复利用率，在第9天进行了9个周期的重复催化反应后，其相对活性保持在85％左右。固定化β-葡萄糖苷酶即使在连续15个周期的重复催化反应后仍能保持40％的初始活性(图9B)。
分别以pNPG和PPD型人参皂苷混合物作为底物，针对游离的糖苷酶和固定化的糖苷酶的酶促动力学常数进行了研究。其中Bgpl和BglPm的Km值分别为0.85±0.21mM和0.40±0.12mM，显著高于人参皂苷，表明其对天然底物的亲和力较高。特别是，Rb1的BglPm的Km值为0.04±0.0003mM，较低一个数量级(表1)。本试验还测量了重组His-Bgp1的Vmax，计算了重组His-Bgp1的kcat和重组pNPG的His-BglPm。催化效率(kcat/Km)取决于酶和底物，BglPm对pNPG(154.08s-1mM-1)的催化效率明显较高，表明其具有高活性，Bgp1对Rb1(1.88s- 1mM-1)的催化效率较低(表2)。固定化酶的Vmax值大约是游离酶的5倍，表明水解活性提高(表2)。游离酶和固定化酶的Km处于类似的水平，表明固定化不会改变底物的亲和力(表2)。
表2重组BglPm和Bgp1的动力学参数
将3.0g PPD型人参皂苷混合物添加到固定化Bgp1和BglPm或其游离物的反应池中，通过分析不同时间大量和稀有人参皂苷含量的变化来研究转化效率(图10)。在12小时内Rb1和Rd被快速消耗，中间产物Rg3在开始反应中积累，随后逐渐减少(图6)。其他中间产物包括F2、Gyp17、Gyp75和CK在整个反应过程中稳定地保持较低的水平(图6)。在游离酶体系中，Rh2在24小时内累积到300.30±28.26mg，占PPD型人参皂苷混合物的10.01％。而Rh2在固定化体系中累积到511.72±3.04mg，占PPD型人参皂苷混合物的17.06％(图10)。人参皂苷PPD的最终产物在水解过程中逐渐增加(图10)。固定化葡萄糖苷酶在糖基连续水解过程中可以促进酶的循环利用，生产稀有的人参皂苷，从而降低酶的成本；利用两种固定化的葡萄糖苷酶组合水解PPD型人参皂苷混合物生成Rh2的转化率为68.32％。