阅读说明：本技术 一种基于提高赛门苷含量而提高罗汉果甜苷整体甜度的方法 (Method for improving overall sweetness of mogroside based on improvement of siamenoside content ) 是由 刘晴云 苏志鹏 陈宏坤 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于提高赛门苷含量而提高罗汉果甜苷整体甜度的方法,将鲜罗汉果或干罗汉果经提取、树脂吸附、脱色等步骤制得含罗汉果甜苷V含量大于50%的罗汉果甜苷产品,将罗汉果甜苷产品溶于同浓度的发酵培养液中,灭菌处理后,再将原液接种筛选出的特异性清酒酵母菌CN01,自然发酵72h后,可将80%以上的罗汉果苷V转变为赛门苷,离心过滤,收集除去菌体的含高含量赛门苷的发酵液,将此发酵液经离子型色谱树脂分步纯化,收集赛门苷富集段,并经浓缩,干燥制得成品。本发明提高了罗汉果甜苷的附加值,扩展了罗汉果深加工产品品类,产品可作为新型天然甜味剂。(The invention discloses a method for improving the integral sweetness of mogroside based on the improvement of the siamenoside content, which comprises the steps of extracting, resin adsorption, decoloring and the like of fresh or dried momordica grosvenori to prepare a mogroside product containing more than 50% of mogroside V, dissolving the mogroside product in a fermentation culture solution with the same concentration, sterilizing, inoculating a stock solution to screened specific sake yeast CN01, naturally fermenting for 72 hours, converting more than 80% of mogroside V into siamenoside, centrifugally filtering, collecting a fermentation solution containing high-content siamenoside from which thalli is removed, purifying the fermentation solution step by ion type chromatographic resin, collecting a siamenoside enrichment section, concentrating and drying to obtain a finished product. The invention improves the added value of the mogroside, expands the product types of the deep processing of the grosvenor momordica, and the product can be used as a novel natural sweetener.)

一种基于提高赛门苷含量而提高罗汉果甜苷整体甜度的方法

技术领域

本发明涉及罗汉果加工领域，主要涉及一种基于提高赛门苷含量而提高罗汉果甜苷整体甜度的方法。

背景技术

罗汉果甜苷又称罗汉果甜甙，萃取于广西特产经济植物--罗汉果，其甜度为蔗糖的300倍，其热量为零，具有清热润肺镇咳、润肠通便之功效，对肥胖、便秘、糖尿病等具有防治作用。但实际罗汉果中甜度最高的并非是罗汉果甜苷V，而是赛门苷，其甜度约为罗汉果甜苷V的1.5倍，其化学结构正好比罗汉果甜苷V少一个β-D-葡萄糖，但赛门苷在罗汉果中含量极低。若能提高赛门苷的含量，则可以从整体上提升罗汉果甜苷的甜度。

发明内容

本发明的目的在于在通过筛选一种优势菌种水解β-D-葡萄基，从而提供一种基于提高赛门苷含量而提高罗汉果甜苷整体甜度的方法，该方法通过生物转化提高赛门苷的含量，继而提升罗汉果甜苷整体甜感。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于提高赛门苷含量而提高罗汉果甜苷整体甜度的方法，包括以下步骤：

1)溶解：将罗汉果甜苷溶于同浓度的发酵培养液中，其中罗汉果甜苷浓度为45-50mg/ml，灭菌处理后得到原液；

2）筛选优势菌株：

2-1）从罗汉果表皮、罗汉果生长土壤及罗汉果渣中分理出不同菌株，各菌株各自接种于以纤维素、淀粉为底物的培养液中，培养24h后，通过检测底物中葡萄糖的浓度确认可产生外源性糖苷酶的优势菌株，共筛选得到五株优势菌株，编号分别为Sc001，VSc01，CN01，CN01-A，T-CN00，五株优势菌株均为酿酒酵母菌株；

2-2）将可产生外源性糖苷酶的酿酒酵母菌株Sc001，VSc01，CN01，CN01-A，T-CN00分别接种于以Morgroside V为底物的培养液中，常温发酵168h，每隔24h对发酵液与原液进行甜度对比，筛选出发酵液甜度最高所对应的菌株为特异性清酒酵母菌CN01；

3）发酵：将特异性清酒酵母菌CN01经过马铃薯斜面培养基复壮后，接种于MS培养基扩培，经过两级扩培后作为发酵种子液，然后将步骤1）得到的原液接种所述发酵种子液，接种量为原液的10-12%，控制发酵温度为30-32℃，自然发酵72-80 h，得到发酵液；

4)离心过滤：将发酵液离心、过滤，收集上清液；

5)色谱层析：将上述上清液经转型后的离子型色谱树脂进行分离，过柱流速2BV/h，过柱2h，收集45min-1.2h内的流出液；

6)浓缩冻干：将上述流出液真空减压浓缩，并冷冻干燥，得到提高了甜度的罗汉果甜苷。

步骤1）所述罗汉果甜苷是罗汉果经提取、树脂吸附、脱色后喷雾干燥的产物，其Morgroside V含量大于50%。

步骤4）所述离心、过滤操作为：将发酵液经6500-7000转/分钟的蝶式离心机离心后，过1um的精滤膜，收集上清液。

步骤5）所述的离子型色谱树脂的转型方法为：将001×7阳离子树脂装入色谱柱中，用4BV体积的2%的HCL冲洗树脂，接着用蒸馏水洗至中性，再用4BV 体积2%的氢氧化钠冲洗树脂，接着用蒸馏水洗至中性，最后用4B体积的2% 的LaCl转型成LA^＋树脂。

步骤6）所述浓缩冻干的操作为：将流出液经真空减压浓缩成10波美度，速冻至-50℃，然后按照以下冻干曲线进行冻干：-50℃维持1h，再升温至-30℃维持2h，继续升温至-15℃维持2h，继续升温至0℃维持2h，继续升温至15℃维持2h，继续升温至30℃维持4h，继续升温至50℃维持8h ，然后降温至30℃维持4h，最后降温至25℃维持2h。

本发明采用以上的技术方案，将鲜罗汉果或干罗汉果经提取、树脂吸附、脱色等步骤制得含罗汉果甜苷V含量大于50%的罗汉果甜苷产品，将罗汉果甜苷溶于同浓度的发酵培养液中，灭菌处理后，再将原液接种筛选出的特异性清酒酵母菌CN01，自然发酵72h后，可将80%以上的罗汉果苷V转变为赛门苷，离心过滤，收集除去菌体的含高含量赛门苷的发酵液，将此发酵液经离子型色谱树脂分步纯化，收集赛门苷富集段，并经浓缩，干燥制得成品。罗汉果在成熟过程中会产生许多特异性酶，这些酶是罗汉果甜味苷类物质产生的必要条件。本发明通过发酵，模拟甜味物质的产生条件，定向将低甜味物质转化为高甜味物质，提高罗汉果深加工产品附加值。

本发明通过特异性发酵将罗汉果甜苷转化为高甜味的赛门苷，所制得赛门苷甜味绵长，无后味，相比同浓度罗汉果甜苷，甜味高了将近1.5倍，其可应用于多种代糖产品及减肥保健食品中。本发明提高了罗汉果甜苷的附加值，扩展了罗汉果深加工产品品类，产品可作为新型天然甜味剂。

具体实施方式

一种基于提高赛门苷含量而提高罗汉果甜苷整体甜度的方法，包括以下步骤：

1)溶解：将罗汉果经提取、树脂吸附、脱色后喷雾干燥获得的Morgroside V含量大于50%的罗汉果甜苷溶于同浓度的发酵培养液中，其中罗汉果甜苷浓度为45-50mg/ml，灭菌处理后得到原液；

2-1）从罗汉果表皮、罗汉果生长土壤及罗汉果渣中分理出不同菌株，各菌株各自接种于以纤维素、淀粉为底物的培养液中，培养24h后，通过检测底物中葡萄糖的浓度确认可产生外源性糖苷酶的优势菌株，共筛选得到五株优势菌株，编号分别为Sc001，VSc01，CN01，CN01-A，T-CN00，五株优势菌株均为酿酒酵母菌株；

2-2）将可产生外源性糖苷酶的酿酒酵母菌株Sc001，VSc01，CN01，CN01-A，T-CN00分别接种于以Morgroside V为底物的培养液中，常温发酵168h，每隔24h对发酵液与原液进行甜度对比，筛选出发酵液甜度最高所对应的菌株为特异性清酒酵母菌CN01；

3）发酵：将特异性清酒酵母菌CN01经过马铃薯斜面培养基复壮后，接种于MS培养基扩培，经过两级扩培后作为发酵种子液，然后将步骤1）得到的原液接种所述发酵种子液，接种量为原液的10-12%，控制发酵温度为30-32℃，自然发酵72-80 h，得到发酵液；

4)离心过滤：将发酵液经6500-7000转/分钟的蝶式离心机离心后，过1um的精滤膜，收集上清液；

5)色谱层析：将上述上清液经转型后的离子型色谱树脂进行分离，过柱流速2BV/h，过柱2h，收集45min-1.2h内的流出液；

6)浓缩冻干：将上述流出液经真空减压浓缩成10波美度，速冻至-50℃，然后按照以下冻干曲线进行冻干：-50℃维持1h，再升温至-30℃维持2h，继续升温至-15℃维持2h，继续升温至0℃维持2h，继续升温至15℃维持2h，继续升温至30℃维持4h，继续升温至50℃维持8h，然后降温至30℃维持4h，最后降温至25℃维持2h，得到提高了甜度的罗汉果甜苷。

本发明所述的菌株Sc001，VSc01，CN01，CN01-A，T-CN00可从大闽食品（漳州）有限公司获得。

本发明所涉及的离子型色谱树脂的转型方法为：将001×7阳离子树脂装入色谱柱中，用4BV体积的2%的HCL冲洗树脂，接着用蒸馏水洗至中性，再用4BV 体积2%的氢氧化钠冲洗树脂，接着用蒸馏水洗至中性，最后用4B体积的2% 的LaCl转型成LA^＋树脂。

实施例1

筛选优势菌株：

1）从罗汉果表皮、罗汉果生长土壤及罗汉果渣中分理出不同菌株，各菌株各自接种于以纤维素、淀粉为底物的培养液中，培养24h后，通过检测底物中葡萄糖的浓度确认可产生外源性糖苷酶的优势菌株，共筛选得到五株优势菌株，编号分别为Sc001，VSc01，CN01，CN01-A，T-CN00，五株优势菌株均为酿酒酵母菌株；

2）将可产生外源性糖苷酶的酿酒酵母菌株Sc001，VSc01，CN01，CN01-A，T-CN00分别接种于以Morgroside V为底物的培养液中，常温发酵168h，每隔24h对发酵液与原液进行甜度对比，筛选出发酵液甜度最高所对应的菌株为特异性清酒酵母菌CN01。

实施例2

一种基于提高赛门苷含量而提高罗汉果甜苷整体甜度的方法，包括以下步骤：

1)溶解：将罗汉果经提取、树脂吸附、脱色后喷雾干燥获得的Morgroside V含量为50%的罗汉果甜苷溶于同浓度的发酵培养液中，其中罗汉果甜苷浓度为45mg/ml，灭菌处理后得到原液；

2）发酵：将实施例1筛选出的特异性清酒酵母菌CN01经过马铃薯斜面培养基复壮后，接种于MS培养基扩培，经过两级扩培后作为发酵种子液，然后将步骤1）得到的原液接种所述发酵种子液，接种量为原液的10%，控制发酵温度为30℃，自然发酵80 h，得到发酵液；

3)离心过滤：将发酵液经6500转/分钟的蝶式离心机离心后，过1um的精滤膜，收集上清液；

4)色谱层析：将上述上清液经转型后的离子型色谱树脂进行分离，过柱流速2BV/h，过柱2h，收集45min内的流出液；

5)浓缩冻干：将上述流出液经真空减压浓缩成10波美度，速冻至-50℃，然后按照以下冻干曲线进行冻干：-50℃维持1h，再升温至-30℃维持2h，继续升温至-15℃维持2h，继续升温至0℃维持2h，继续升温至15℃维持2h，继续升温至30℃维持4h，继续升温至50℃维持8h，然后降温至30℃维持4h，最后降温至25℃维持2h，得到提高了甜度的罗汉果甜苷。

本实施例制备的的罗汉果甜苷色泽雪白，无异味，口感清甜，后甜绵长，其中赛门苷含量60%，总皂甙含量88%，罗汉果甜苷V 含量20%。

实施例3

一种基于提高赛门苷含量而提高罗汉果甜苷整体甜度的方法，包括以下步骤：

1)溶解：将罗汉果经提取、树脂吸附、脱色后喷雾干燥获得的Morgroside V含量为55%的罗汉果甜苷溶于同浓度的发酵培养液中，其中罗汉果甜苷浓度为50mg/ml，灭菌处理后得到原液；

2）发酵：将实施例1筛选出的特异性清酒酵母菌CN01经过马铃薯斜面培养基复壮后，接种于MS培养基扩培，经过两级扩培后作为发酵种子液，然后将步骤1）得到的原液接种所述发酵种子液，接种量为原液的12%，控制发酵温度为32℃，自然发酵72h，得到发酵液；

3)离心过滤：将发酵液经7000转/分钟的蝶式离心机离心后，过1um的精滤膜，收集上清液；

4)色谱层析：将上述上清液经转型后的离子型色谱树脂进行分离，过柱流速2BV/h，过柱2h，收集1.2h内的流出液；

5)浓缩冻干：将上述流出液经真空减压浓缩成10波美度，速冻至-50℃，然后按照以下冻干曲线进行冻干：-50℃维持1h，再升温至-30℃维持2h，继续升温至-15℃维持2h，继续升温至0℃维持2h，继续升温至15℃维持2h，继续升温至30℃维持4h，继续升温至50℃维持8h，然后降温至30℃维持4h，最后降温至25℃维持2h，得到提高了甜度的罗汉果甜苷。

本实施例制备的的罗汉果甜苷色泽雪白，无异味，口感清甜，后甜绵长，其中赛门苷含量70%，总皂甙含量93%，罗汉果甜苷V 含量10%。

实施例4

一种基于提高赛门苷含量而提高罗汉果甜苷整体甜度的方法，包括以下步骤：

1)溶解：将罗汉果经提取、树脂吸附、脱色后喷雾干燥获得的Morgroside V含量为56%的罗汉果甜苷溶于同浓度的发酵培养液中，其中罗汉果甜苷浓度为48mg/ml，灭菌处理后得到原液；

2）发酵：将实施例1筛选出的特异性清酒酵母菌CN01经过马铃薯斜面培养基复壮后，接种于MS培养基扩培，经过两级扩培后作为发酵种子液，然后将步骤1）得到的原液接种所述发酵种子液，接种量为原液的10%，控制发酵温度为30℃，自然发酵72 h，得到发酵液；

3)离心过滤：将发酵液经6800转/分钟的蝶式离心机离心后，过1um的精滤膜，收集上清液；

4)色谱层析：将上述上清液经转型后的离子型色谱树脂进行分离，过柱流速2BV/h，过柱2h，收集60min内的流出液；

5)浓缩冻干：将上述流出液经真空减压浓缩成10波美度，速冻至-50℃，然后按照以下冻干曲线进行冻干：-50℃维持1h，再升温至-30℃维持2h，继续升温至-15℃维持2h，继续升温至0℃维持2h，继续升温至15℃维持2h，继续升温至30℃维持4h，继续升温至50℃维持8h，然后降温至30℃维持4h，最后降温至25℃维持2h，得到提高了甜度的罗汉果甜苷。

本实施例制备的的罗汉果甜苷色泽雪白，无异味，口感清甜，后甜绵长，其中赛门苷含量80%，总皂甙含量98%，罗汉果甜苷V 含量10%。