阅读说明：本技术 生产含重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的方法以及含重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的用途 (Method for producing transformed plant cells containing recombinant human alkaline phosphatase and use of transformed plant cells containing recombinant human alkaline phosphatase ) 是由 娜塔莉亚·安娜托里耶夫娜·施米科娃 罗马·亚历山德罗维奇·科马金 谢尔盖·阿列克山德罗维奇·斯坦 于 2019-01-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及食品工业和医学,并描述了生产含有重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的方法。本方法包括构建具有人碱性磷酸酶基因的植物表达载体,将具有人碱性磷酸酶基因的植物表达载体导入农杆菌菌株,生产植物愈伤组织细胞,使用农杆菌菌株农杆菌转化愈伤组织细胞；从转化的愈伤组织细胞产生体细胞胚,并在悬浮培养中培养含有人碱性磷酸酶基因的体细胞胚。本发明的目的是调节胃肠道微生物群落以及保护和恢复人体免疫系统。(The present invention relates to the food industry and medicine and describes a method for producing transformed plant cells containing recombinant human alkaline phosphatase. The method comprises constructing a plant expression vector containing human alkaline phosphatase gene, introducing the plant expression vector containing human alkaline phosphatase gene into Agrobacterium strain to produce plant callus cells, and transforming the callus cells with Agrobacterium strain Agrobacterium; somatic embryos were generated from transformed callus cells and somatic embryos containing the human alkaline phosphatase gene were cultured in suspension culture. The aim of the invention is to regulate the gastrointestinal microflora and to protect and restore the human immune system.)

生产含重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的方法以及含重组 人碱性磷酸酶的转化植物细胞的用途

技术领域

本发明涉及食品工业和医学，并描述了生产含有重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的方法，及其在维持胃肠道(GI道)稳态中的用途。

背景技术

众所周知，肠是重要的屏障器官，由正常的(生态上与人类关联的)微生物群落、粘膜层、上皮和上皮下免疫系统组成。肠屏障的主要功能是保护生物体，使其免于细菌转移到体循环中。正常的微生物群落可以留在肠腔内而不刺激宿主的免疫反应，然而相同的细菌如果通过肠屏障转运进入血液并转运到其他器官，则可以诱导免疫反应和炎症。肠壁屏障的破坏会导致对同向细菌成分过度的免疫反应，进而导致慢性炎症性肠病(IBD)的发展，例如克罗恩病和非特异性溃疡性结肠炎(Podolsky，2010)。包括药物在内的异源物质的压力、感染、衰老和毒性作用在这些疾病的发展中也起着重要的作用(Cadwell等，2010)。

当前，维持胃肠道稳态的唯一可广泛使用的手段包括调节胃肠道微生物群落和免疫系统，其是基于益生菌、由肠道中正常存在的物种组成的活微生物培养物的药物和产品。然而，尚无令人信服的证据证明此类产品具有临床功效。此外，外部引入的微生物群落通常无法在人体中生存，而被天然存在的微生物群落所排斥。而且，益生菌通常是两种细菌：乳杆菌和双歧杆菌，而人的微生物群落包括超过300多种细菌。因此，停止使用益生菌后，通常会重新出现胃肠道稳态初始的不稳定。

然而，认为基于使用碱性磷酸酶(AP)酶调节胃肠道动态平衡新方法是有前途的，因为微生物群落、免疫系统和肠屏障功能的紊乱以及IBD的发展在很大程度上由炎症诱导剂引发，其中一些是AP酶的生理底物。最有效的炎症诱因是：1)脂多糖(LPS)–大肠杆菌和其他革兰氏阴性细菌的细菌内毒素；2)细胞外ATP和其他核苷酸和核苷。肠道微生物群落不断释放LPS，当肠屏障被破坏时LPS会进入血液，甚至在最低浓度(ng/kg)时也会引起炎症。在此过程中，LPS与巨噬细胞表面的膜蛋白CD14结合，导致其活化，进而导致数十种生物活性化合物的表达：***素、一氧化氮和细胞因子，包括白介素和TNFα(内森，1987年)。LPS和细胞外ATP是对“异物”和“危险”信号响应而发展全身免疫和炎症反应的重要因素(Matzinger，2002年)。

肠道粘膜细胞产生的肠道碱性磷酸酶通过使LPS失活(解毒)和防止LPS移位、调节肠道微生物群落和肠道表面pH值而在肠道稳态中发挥重要作用(Eskandari等，1999；Weemaes等，2002；Riggle等，2013；Tuin等，2009)。AP催化的LPS脱磷酸作用消除了其促炎活性，从而保护了机体免受各种炎症和自身免疫性疾病的发展(Park，Lee，2013)。

在炎性肠病、腹腔疾病和肥胖症中观察到由于编码AP的基因表达降低而导致的肠道AP正常水平(活性)中断。对患有结肠炎的小鼠口服AP可降低促炎细胞因子TNFα和一氧化氮的mRNK水平(Muginova等，2007)。Molnar等人(2012)已证明，克罗恩病和非特异性溃疡性结肠炎患儿发炎的肠粘膜中的AP水平明显低于对照组。对活动性肠道炎症患者给予外源性AP可预防疾病恶化。在另一项研究中已证明，外源性AP的给药可减轻新生动物的肠炎症，所以提出将AP用于预防新生婴儿的炎症性疾病(Biesterveld等，2015)。

存在一些现有技术专利和专利申请，描述了AP在调节肠道微生物群落、免疫系统活性、预防和治疗各种疾病中的用途：日期为2013年10月24日的US20130280232《使用碱性磷酸酶对粘膜屏障上的LPS毒素进行解毒》，日期为2011年8月25日的US20110206654《用碱性磷酸酶调节胃肠道微生物群落水平的方法》，日期为2013年1月24日的US20130022591《使用碱性磷酸酶降低或抑制与细菌感染有关的毒性作用的方法》，日期为2013年11月5日的US8574863《用于治疗胃肠道炎性疾病的碱性磷酸酶》。

与本发明中公开的与食品生产方法最接近的方法是日期为2011年8月25日的专利申请US20110206654《用碱性磷酸酶调节胃肠道微生物群落水平的方法》中公开的方法，该方法描述了用AP调节GI微生物群落，包括在使用抗生素时保护和恢复正常微生物群落。在该原型和其他公开来源中，作者使用AP作为纯蛋白质，并从体外蛋白质和其他杂质中纯化出来。该AP以纯蛋白质或药物制剂形式(包含纯化的AP和不同的赋形剂)施用于动物或人类(在临床试验中)。通过不同的方法获得的纯化的AP，包括：从牛肠粘膜中分离AP；从哺乳动物胎盘中分离AP：在哺乳动物细胞培养物中生产重组人AP，随后进行分离和纯化。已知方法的共同特征是将AP生产为纯蛋白质，这导致了以下列出的若干缺点，并且实际上消除了将其用作食品或食品成分的可能性。

从哺乳动物肠道或其他器官中分离出来的AP的一个非常重要的缺点是，它对人类是一种外来蛋白质(由于种间遗传差异)，因此在人类中使用AP可能会引起过敏反应，并在重复使用后会发展为危险的过敏反应。此外，动物组织中AP含量低，需要昂贵的蛋白质提取和纯化过程。还存在被朊病毒和病原微生物污染的风险。彻底纯化会大大增加最终产品的成本，并严重限制了其实际使用。

在哺乳动物细胞系统中体外生产重组人AP具有其自身的缺点，包括：过程的可扩展性有限、成本高以及被人病原体污染的风险。

由于重组蛋白质的分离、纯化和质量控制的困难，生产所描述为纯蛋白质的AP方法的一个共同缺点是最终产品的高成本(每包高达1000～2000美元)。这实际上排除了将其用作预防和治疗疾病的食品的可能性。

所述的作为纯蛋白质的AP生产方法的另一个共同的缺点是AP对外部条件例如培养基的温度和pH(酸度)的高敏感性。例如，AP在胃的酸性介质中完全失活。这排除了在食品中使用此类AP的可能性，或排除了需要产生抗胃酸作用的复杂剂型的可能性。

AP生产的上述缺点排除了将AP用作维持肠道正常微生物群落和免疫系统以及预防与胃肠道稳态失调有关的炎性和自身免疫性疾病的广泛可用产品。因此，原型(US20110206654，日期为2011年8月25日)中描述的将AP作为纯蛋白或与标准药物赋形剂混合使用以调节胃肠道微生物群落的可能性受到上述缺点的严重限制，不能用于食品产品或食品成分的操作。

本发明的目的是开发一种新的、有效的、安全的和负担得起的含有AP的食品，用于维持正常的肠道微生物群落和免疫系统，并防止与胃肠道稳态平衡紊乱相关的炎症和自身免疫性疾病的发展。

通过开发其中重组人碱性磷酸酶位于植物细胞中的食品，实现了该目标。含有AP的植物细胞(与使用纯化的AP的原型细胞不同)提供了自然保护，使其免受酸性胃液中AP的失活以及将其递送到肠道中，AP在此发挥其功能—使胃肠道病原微生物群落产生的细菌内毒素去磷酸化(失活)。因此，含AP的食品保持正常的胃肠道微生物群落和免疫系统，防止正常的胃肠道微生物群落和免疫系统失调，在有毒和压力条件下恢复正常的胃肠道微生物群落和免疫系统，还防止炎症和自身免疫性疾病的发展。食品中所含的含AP的植物细胞可供人类安全食用，重复使用不会引起过敏和危险的过敏反应，并且不会使人类感染朊病毒和动物病原性微生物(不同于源自哺乳动物器官的AP)。最后，基于含有重组人AP的植物细胞的食品不仅比基于哺乳动物细胞中产生的纯化重组人AP的药物更安全，而且便宜2～3个数量级。这使得它可以用作食品，以大规模预防胃肠道微生物群落失调和免疫系统疾病，并预防普通人群的炎症性和自身免疫性肠道疾病。

生产基于含重组人碱性磷酸酶的植物细胞的食品的方法包括：构建具有人AP基因的植物表达载体，将具有人AP基因的植物表达载体导入农杆菌，产生植物愈伤组织细胞，利用农杆菌菌株对愈伤组织细胞进行农杆菌转化；通过在悬浮培养中培养含有人AP基因的转化植物愈伤组织细胞而生产该食品。

生产基于含重组人碱性磷酸酶的植物细胞的食品的方法的另一种变化，包括构建具有人AP基因的植物表达载体，将具有人AP基因的植物表达载体导入农杆菌菌株，产生植物愈伤组织细胞，使用农杆菌菌株对愈伤组织细胞进行农杆菌转化，并从所述转化的愈伤组织细胞中生产体细胞胚；通过在悬浮培养物中培养含有人AP基因的体细胞胚而生产该食品。

在体细胞胚生长过程中，通过不同大小的筛子过滤、离心、自动分离或其他同步化方法对胚进行同步发育。在添加了增加渗透压的化合物的液体营养培养基中培养体细胞胚。此类化合物的最佳浓度不超过10％。聚乙二醇、甘露醇和其他化合物可以用作增加渗透压的化合物。

组织特异性碱性磷酸酶，例如肠碱性磷酸酶和胎盘碱性磷酸酶或组织非特异性碱性磷酸酶，以及碱性磷酸酶的其他同工型，可作为本发明的重组人碱性磷酸酶。

干燥在悬浮培养物中培养的转化的愈伤组织细胞或体细胞胚，并用作食品，例如用作胶囊、片剂、小袋和其他可即食的形式，或将其添加到其他食品中。

生产的食品用于调节胃肠道微生物群落，以预防免疫系统疾病并作为免疫调节剂恢复受损的免疫系统。

已知植物生产者是生产高质量、安全和相对廉价蛋白质的最有希望的系统(Conley等，2011；Sharma，Sharma，2009；Sabalza等，2014)。我们利用植物生产者的优势创造了一种根本上新颖的产品，该产品包含含有重组人碱性磷酸酶而不是纯AP的植物。可用于生产重组蛋白的任何食用植物均可用于此目的，包括但不限于胡萝卜(Daucus carota)、莴苣(Latuca sativa)、甘蓝(Brassica oleracea)、大白菜(Brassica pekinensis)、莳萝(Anethum gravolens)、芹菜(Apium ravolens)、黄瓜(Cucumis sativus)、南瓜(Cucurbitapepo)、甜叶菊(Stevia rebaudiana)、烟草(Nicotiana tabacum)、大米(Oryza sativa)，苜蓿(Medicago sativa)、番茄(Solanum lycopersicum)和其他植物。优选使用能够在至少60％的细胞中进行体细胞胚发生的植物。可以使用这些植物整体或一部分，包括但不限于细胞、胚芽、叶、茎和其他部分。可食用完整或磨碎(甚至磨成单独的细胞)的原始以及使用或者不使用不同的干燥方法的干燥形态的含有重组人AP的植物或其部分。该食品可以包含组织特异性AP(例如肠、胎盘)或组织非特异性AP或其他人碱性磷酸酶。

本公开的方法(其变化)包括以下内容。

该方法的第一变化包括以下步骤：构建具有人AP基因的植物表达载体，将所述具有人AP基因的植物表达载体导入农杆菌菌株，产生植物愈伤组织细胞，使用农杆菌菌株对愈伤组织细胞进行农杆菌转化。通过在悬浮培养中培养含有人AP基因的转化植物愈伤组织细胞来生产食品。

该方法的第二种变化包括以下步骤：构建具有人AP基因的植物表达载体，将具有人AP基因的植物表达载体导入农杆菌菌株，产生植物愈伤组织细胞，使用农杆菌菌株对愈伤组织细胞进行农杆菌转化，以及所述转化的愈伤组织细胞产生体细胞胚。通过在悬浮培养物中培养含有人AP基因的体细胞胚来生产食品。

含有重组人碱性磷酸酶的植物细胞也可用于植物的生产和生长。所得的植物生物质可以用作生产基于含重组人碱性磷酸酶的植物细胞的食品的原料。

如下实施用人类AP基因构建植物表达载体：

合成与人碱性磷酸酶基因(智人碱性磷酸酶，肠道(ALPI)，序列ID：NM_001631.4)的天然mRNA核苷酸序列完全一致的、大小为1587个碱基对的人AP重组基因的核苷酸序列。为了促进克隆，在翻译起始位点(atg)之前的5'端将限制性酶切位点Bgl II的序列(agatct)添加到重组AP基因的序列中，而终止密码子(tga)后的3'-末端添加具有限制性酶切位点Xba I的序列(atctagaat)。将具有限制位点Bgl II和Xba I的序列的大小为1602个碱基对的人AP重组基因的核苷酸序列克隆到质粒pAL-Т载体中，并将其命名为pAL-Т-AP。从pAL-Т-AP质粒的限制性酶切位点Bgl II和Xba I上除去了大小为1600个碱基对的AP基因的核苷酸序列，并连接到较早构建的质粒p35S-NLS-recA-licBM3[1]中，该质粒在限制性酶切位点BamH I和Xba I预先水解，产生质粒p35S-AP，其中重组AP基因在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下[2]。通过测序验证了基因构建p35S-AP拼接体的准确性。

如下实施将具有人AP基因的植物表达载体导入农杆菌菌株：

使用“三亲杂交”的方法，将带有人AP基因的植物表达载体导入农杆菌菌株，以带有p35S-AP质粒的大肠杆菌细胞为供体，以HB101 pRK2013菌株的大肠杆菌细胞为接合转移的促进子，GV3101菌株或AGL0菌株的根癌农杆菌作为受体。这产生了含有人AP基因的农杆菌菌株GV3101 p35S-AP和AGL0p35S-AP。

植物愈伤组织细胞的产生以及农杆菌转化愈伤组织细胞。

将植物种子在无菌条件下(层流柜)在加入Tween-20(每100毫升溶液1滴)的含氯商用消毒剂水溶液中灭菌，然后在无菌蒸馏水中洗涤3次，每次10每次分钟。然后从无菌条件下灭菌的种子中提取胚胎，然后将其转移到装有富含生长调节剂的2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和激动素的改良的Murashige和Skoog培养基(MSM)的小瓶中。将小瓶放入恒温器中，并在黑暗中于23℃温育，直到形成愈伤组织。

表1—改良的Murashige和Skoog培养基的组成(Mutsuda等，1981)

在层流柜中，将带有人AP基因的农杆菌菌株GV3101 p35S-AP或AGL0p35S-AP的新鲜培养物中分离出的细菌菌落放入装有3种带有对应于细菌菌株的抗生素的无菌液体培养基LB的小瓶中(使用无菌接种环)。农杆菌在装有恒温器的圆形旋转振动器(振幅5～10cm，速率150～200RPM)上于28℃下培养20～48小时。

使用标准培养基培养农杆菌，例如每升含有：胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠5克和细菌琼脂15克的LB培养基。将培养基在标准条件下高压灭菌15～20分钟。冷却至65℃后，添加抗生素：对于菌株AGL0—每种终浓度为100mg/L卡那霉素和利福平；对于GV3101菌株—每种终浓度为100mg/l的卡那霉素和利福平以及终浓度为25mg/L的庆大霉素。

将植物愈伤组织细胞置于层流柜中的皮氏培养皿中的无菌滤纸上，并将10～25mcl的过夜培养的AGL0农杆菌和具有碱性磷酸酶基因的GV3101应用于每个移植物。进行农杆菌培养后，将愈伤组织稍微干燥，并转移到添加有0.2mg/L2,4-D的MSM营养培养基的小瓶中。3天后，将愈伤组织转移到具有相同组成但添加500mg/L头孢噻肟和100mg/L卡那霉素的琼脂培养基上。在黑暗中于22～24℃下进行培养10天。然后在具有相同组成的培养基上再进行1～2次转移，直到出现新的愈伤组织细胞集落。为了繁殖它们，将愈伤组织细胞转移到含有0.2mg/L 2,4-D和200mg/L头孢噻肟的MSM营养培养基中。可以无期限地将愈伤组织保存在培养物中，定期将其分成碎片并将其种植到新培养基上。利用碱性磷酸酶将对硝基苯基磷酸去磷酸化，产生黄色的对硝基苯酚的能力，进行对转基因胡萝卜细胞的选择。为了产生所需量的食品，在悬浮培养物中在相同组成的无琼脂的液体营养培养基中培养具有人AP基因的愈伤组织细胞。

如果使用食品生产方法的第二种变化，则从转化的植物愈伤组织细胞产生体细胞胚，然后在悬浮培养物中培养。

如下实施从转化的愈伤组织细胞生产体细胞胚：

为了产生体细胞胚，将愈伤组织细胞悬浮液培养在液体MSM营养培养基中，该培养基含有0.2mg/L IAA(吲哚-3-乙酸)和激动素。产生的胚发生悬浮液包含不同的胚前结构以及分离的非胚发生细胞和细胞群。为了获得均匀的体细胞胚群体(以使其同步)，将悬浮培养物通过网眼大小120mcm，然后穿过50mcm的尼龙筛进行过滤。将留在第二个筛子上的细胞团转移到新鲜培养基中以形成胚胎。从1L的培养基中平均可以产生多达7万个胚胎。

生产基于带有人AP基因的植物愈伤组织细胞或体细胞胚的干食品。

用蒸馏水从剩余的营养培养基中洗涤含有人肠道AP基因的愈伤组织细胞，并在﹣55℃冷冻干燥，最后在+30℃干燥，使蛋白质不变性。由碱性磷酸酶使对硝基苯基磷酸酯去磷酸化的能力确定干燥的细胞团中碱性磷酸酶的活性。将制备的含有AP基因的植物细胞块包装到胶囊、片剂、小袋或其他形式中，用作食品成分。

为了更好地说明上述实施例，下面将对食品生产技术的发展和优化进行描述。

在﹣55℃冷冻干燥含有人AP基因的植物细胞，例如胡萝卜细胞，并在20℃、30℃、40℃、50℃和60℃完成干燥。将干燥的生物质(约1g)与10ml的含有5mM Tris HCl、0.1mM氯化镁、0.1mM氯化锌的缓冲溶液一起研磨，并在100g下离心30分钟。通过向溶液中添加20mMpNPP(对硝基苯基磷酸酯)来检测上清液中AP的脱磷酸能力。在37℃下温育反应混合物30分钟，以使混合物着色。用2ml冷却的0.5M NaOH终止反应。产生1mcM pNP所需的酶量作为活性单位。以每克胡萝卜细胞为单位计算比活。

表2—不同干燥方式下胡萝卜细胞生物质中AP的活性

项目	温度模式	活性，U/g
			1	﹣55℃，干燥终止+20℃	216
2	﹣55℃，干燥终止+30℃	225
			3	﹣55℃，干燥终止+40℃	200
4	﹣55℃，干燥终止+50℃	150
			5	﹣55℃，干燥终止+60℃	120

表2证明了植物细胞的最终干燥的温度模式会影响AP的活性，最佳的最终干燥温度为20℃至40℃。

在属于两个不同栽培品种的胡萝卜栽培品种Nantskaya 4和Moscow Winter A-555中研究了营养培养基成分对愈伤组织形成的影响。从成熟的胡萝卜种子分离出的合子胚用作外植体。胚胎在三种最广泛使用的培养基中培养：MS(Murashige，Skoog，1964)、MSM(Masuda等，1981)和B-5(Gamborg等，1976)。为了诱导愈伤组织形成，将2,4-D加入培养基中，结果列于表3。

表3—在不同营养培养基中形成胡萝卜合子胚培养中的愈伤组织

该表表明胡萝卜在所有研究的培养基中都形成了愈伤组织，然而两种胡萝卜的最佳培养基是MSM。

研究了生长调节剂对植物愈伤组织(例如胡萝卜Nantskaya 4栽培品种)进行体细胞胚发生的能力的影响，方法是在具有例如茁壮素(2,4-D，IAA)和细胞***素(激动素和苄基氨基嘌呤(BAP))的生长调节剂不同组合的MSM培养基上悬浮培养。由合子胚产生的Nantskaya 4愈伤组织用作移植物，细胞悬浮液于100ml小瓶中以80ml RPM在摇床上培养，研究结果列于表4。

表4—在生长调节剂不同组合的培养基中悬浮培养Nantskaya 4获得的平均胚胎数

该表表明在不含2,4-D的培养基上可以令人满意地发生胚胎生产。

为了产生愈伤组织，使用了不同类型的外植体：Nantskaya 4胡萝卜的主根组织、茎和叶的片段、叶柄、子叶、下胚轴和合子胚。在含有0.2mg/L 2,4-D的MSM营养培养基上培养外植体，然后为了诱导胚胎发生，将产生的愈伤组织转移至以下组成的培养基上：具有0.2mg/L 2,4-D和激动素的MSM以及含有0.2mg/L IAA和激动素的MSM。在100ml小瓶中以80rpm在摇床上培养细胞悬浮液，研究结果列于表5。

表5—Nantskaya 4胡萝卜不同外植体的愈伤组织产生的胚胎数目

表5证明合子胚是产生胚性愈伤组织的最佳外植体。

通过以下实施例证明了生产和使用基于含有人AP的植物食品的可能性。

为了使用方便，可以通过任何合适的方法干燥生产的具有人AP基因的愈伤组织细胞或植物体胚。

所公开的基于含有人AP的植物食品可以以剂量形式用于内部用途，包括但不限于作为胶囊、片剂、小袋和其他剂型。

所公开的基于包含人AP的植物的食品可以用作大规模消费的食品的成分，例如乳制品、饮料、甜食、以及医学和功能性食品的成分。

所公开的基于包含人AP的植物愈伤组织细胞和体细胞胚的产品可用于健康维护，包括维持胃肠道(GI道)稳态和预防与GI道稳态的破坏相关的疾病。特别是，此产品可用于：

—调节胃肠道微生物群落，包括维持正常的胃肠道微生物群落和防止致病微生物群落在胃肠道中的生长；

—调节生物体的免疫系统，包括维持正常的免疫系统活动并在与各种负面因素有关的免疫系统失调(包括压力、环境因素、药物和其他有害物质的使用)期间恢复其活力；

—减轻毒性作用，包括与细菌感染或炎症性肠病有关的毒性作用；

—预防与使用不同异生物质(包括药物)有关的胃肠道疾病。

健康人和患有各种炎症和自身免疫性疾病的人(包括肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩病、小肠结肠炎)、关节炎、湿疹和其他全身性疾病、与细胞壁通透性增加有关的疾病)都可以使用基于含有人类AP的植物食品。患有肥胖症和不同美容问题的人也可使用该食品。

通过以下实施例说明用所公开的方法生产食品。

实施例1生产基于含有人AP的胡萝卜食品。

为了将人肠道AP基因导入植物表达载体中，通过合成生成了与人碱性磷酸酶基因的天然mRNA的核苷酸序列完全一致的大小为1587个碱基对的人AP重组基因的核苷酸序列。然后在翻译起始位点(atg)之前的5'末端将限制性酶切位点Bgl II的序列(agatct)添加到重组AP基因的序列中，而在3'末在终止密码子(tga)后面添加具有限制性酶切位点Xba I的序列(atctagaat)。将所得的具有1602个碱基对的核苷酸序列克隆到质粒pAL-T载体中。从生成的pAL-T-AP质粒的限制性位点Bgl II和Xba I切去大小为1600个碱基对的核苷酸序列，并连接到较早产生的质粒p35S-NLS-recA-licBM3中，产生质粒p35S-AP，其中重组AP基因受花椰菜花叶病毒35S启动子控制。通过测序验证了基因构建p35S-AP拼接体的准确性。

使用带有p35S-AP质粒的大肠杆菌细胞作为供体，使用HB101 pRK2013菌株的大肠杆菌细胞作为接合转移的促进子，并使用AGL0菌株的根癌农杆菌细胞作为受体，生产具有人AP基因的农杆菌菌株AGL0 p35S-AP。

来自胡萝卜种子合子胚的愈伤组织细胞用作农杆菌转化的对象，其生产过程如下：将在每100毫升溶液加入1滴Tween-20的50％含氯商业消毒剂水溶液中灭菌胡萝卜种子，然后在无菌蒸馏水中洗涤3次，每次10分钟。然后在无菌条件下从无菌种子中提取胚胎，然后将其转移到具有MSM营养培养基的小瓶中，该培养基富含生长调节剂2,4-D和激动素。将小瓶放入恒温器中，并在黑暗中于23℃孵育，直到形成愈伤组织。

农杆菌菌株AGL0的生产过程如下：在层流柜中，用选择性抗生素从新鲜细菌培养物中分离的细菌菌落放入含有3种具有上述组成的无菌液体培养基LB的小瓶中(使用无菌接种环)。农杆菌在装有恒温器的旋转振荡器(振幅5～10cm，速率150～200RPM)上于28℃下生长24～48小时。

根据下面的步骤进行胡萝卜愈伤组织细胞的转化和生长：将来自合子胚的胡萝卜愈伤组织细胞放在层流柜中皮氏培养皿的无菌滤纸上，并将过夜培养的10～25mcl的带有碱性磷酸酶基因的AGL0农杆菌用于每个移植物。之后，将愈伤组织稍微干燥，并移植到小瓶中加入0.2～0.5mg/L 2,4-D的MSM营养培养基上。3天后，将愈伤组织移植到具有相同组成但添加有500mg/L头孢噻肟的琼脂培养基上。在黑暗中于22～24℃培养愈伤组织10天。然后在具有相同组成的培养基上再进行1-2次转移，直到出现新的愈伤组织细胞群落。为了繁殖它们，将愈伤组织细胞转移到具有0.2～0.5mg/L 2,4-D和200mg/L头孢噻肟的MSM营养培养基上。利用碱性磷酸酶将对硝基苯基磷酸去磷酸化，产生黄色的对硝基苯酚的去磷酸化的能力，对转基因胡萝卜细胞进行选择。

然后用蒸馏水从剩余的营养培养基中洗涤含有人AP基因的胡萝卜细胞，并在-55℃下冷冻干燥。通过碱性磷酸酶对对硝基苯基磷酸酯进行脱磷酸的能力来确定干燥细胞团中碱性磷酸酶的活性；将干燥的块放入小袋中。

通过将其添加到乳制品或饮料中(每人每天0.5～1小袋)，将所得食品用于维持正常的胃肠道微生物群落和免疫系统的正常状态。

实施例2.生产基于含人AP的甜叶菊食品。

如实施例1所述生产基于含有重组人AP的植物食品，但是使用作为生产植物的甜叶菊(Stevia rebaudiana)和体细胞胚发生技术来生长含AP的细胞。为了生产甜叶菊体细胞胚，在含有0.2mg/L吲哚-3-乙酸和激动素的液体营养培养基MSM中培养细胞悬浮液。然后，为了获得同质的体细胞胚群体，通过网眼尺寸为120mcm的尼龙筛过滤悬浮培养物，然后通过网眼尺寸为50mcm的尼龙筛过滤。将留在第二个筛子上的细胞团转移到新鲜培养基中以形成胚胎。从1L的悬浮液中平均可以产生多达7万个胚胎。

通过将所得食品添加到加热不超过40℃的食品或饮料中，可将其用于恢复破坏的免疫系统，方法是每人每天0.5～1袋。

实施例3.生产基于包含人AP的莴苣食品。

如实施例1所述生产基于含有重组人AP的植物食品，但是使用莴苣(Latucasativa)作为生产植物，并使用GV3101 p35S-AP菌株作为农杆菌菌株克隆将人分泌AP基因克隆到植物表达载体中，该农杆菌菌株是通过使用具有p35S-AP质粒的大肠杆菌细胞作为供体，HB101 pRK2013菌株的大肠杆菌细胞作为接合转移的促进子，并且GV3101菌株的根癌农杆菌细胞作为受体而产生的。

所生产的食品用于减轻中毒的后果，包括与食物中毒、肠道感染或药物使用有关的中毒，方法是每人每天口服1～2袋，持续7～10天。

实施例4生产基于含有人AP的大白菜食品。

如实施例1所述生产基于含有重组人AP的植物食品，但是使用大白菜(Brassicapekinensis)作为生产植物，MS培养基添加0.1～1.0mg/L的2,4-D，产生和生长愈伤组织细胞。

将所得食品用于预防与抗菌药物有关的不良副作用，方法是每人每天口服1袋，持续7～10天。

实施例5.生产基于含人AP的白菜食品。

如实施例1中所述生产基于含有重组人AP的植物食品，但是使用甘蓝(Brassicaoleracea)作为生产植物并将人胎盘AP基因克隆到植物表达载体中。

所得食品用于志愿者中，以防止与抗生素使用相关的副作用，方法是每人每天口服1袋香糖，持续7～10天。

实施例6生产基于含人AP的莳萝食品。

如实施例1中所述生产基于含重组人AP的植物食品，但是使用莳萝(Anethumgravolens)作为生产植物，在最高达到30℃的温度下冷冻干燥具有人AP基因的莳萝细胞，以生产食品。

所得到的食品用于预防胃肠道和免疫系统疾病，与压力因素的负作用，方法是每人每天口服0.5～1袋，持续7～10天。

实施例7生产基于含有人AP的芹菜食品。

如实施例1中所述生产基于含有重组人AP的植物食品，但是使用芹菜(Apiumgravolens)作为生产植物，冷冻干燥具有人AP基因的芹菜细胞，最后在+30℃至+40℃的温度下干燥，以生产食品。

将所得食品添加到食品或饮料(不会加热到40℃以上)中，以防止肠胃道和免疫系统紊乱(与压力因子的副作用相关)，每人每天0.5～1小袋。

实施例8生产基于含有人AP的黄瓜食品。

如实施例1中所述生产基于含有重组人AP的植物食品，但是使用黄瓜(Cucumissativus)作为生产植物和添加0.1～1.0mg/L的2,4-D的B-5培养基，以产生并生长愈伤组织细胞。

实施例9生产基于含有人AP的南瓜食品。

如实施例1所述生产基于含有重组人AP的植物食品，但是使用南瓜(Cucurbitapepo)作为生产植物，并将具有人AP基因的南瓜细胞与赋形剂混合，并将其放入明胶胶囊中。

所得到的食品用于预防与抗菌药物有关的不良副作用，方法是每人每天口服2粒胶囊，持续7～10天。

实施例10生产基于含有人AP的大米食品。

如实施例1所述生产基于含有重组人AP的植物食品，但是使用大米(Oryzasativa)作为生产植物，并在不超过+50℃的温度下喷雾干燥水稻细胞(以避免蛋白质变性)以生产食品。

所产生的食品用于预防与抗生素使用相关的副作用，方法是每人每天口服1～3粒胶囊，持续7-10天。

实施例11生产基于含人AP的苜蓿食品

如实施例1所述生产基于含重组人AP的植物食品，但是使用苜蓿(Medicagosativa)，并同步胚的发育(通过将它们通过不同大小的筛子过滤、离心和自动分离)，在添加PEG、甘露醇或其他增加渗透压的化合物的液体营养培养基中额外培养体细胞胚。

实施例12生产基于含人AP的番茄食品

如实施例1所述生产基于含重组人AP的植物的食品，但是使用番茄(Solanumlycopersicum)作为生产植物，并在+40℃下干燥番茄细胞至水分含量为4～8％并用羧甲基纤维素和海藻酸钠聚合物覆盖它们，制成微囊/丸，将其装入小袋或明胶胶囊中，制成最终食品。

通过将所得食品其添加到食品或饮料中(每人每天0.5～1小袋微胶囊/丸剂)，可预防胃肠道和免疫系统疾病。

实施例13使用含人AP基因的胡萝卜细胞来恢复被脂多糖作用破坏的免疫参数。

通过以0.5mg/kg的剂量对CD-1小鼠口服给药大肠杆菌脂多糖(Sigma-Aldrich)来模拟与肠道动态平衡破坏有关的免疫系统疾病，尤其是与正常肠道微生物群落和屏障功能的破坏有关的免疫系统疾病。LPS提高了鼠血中观察到的促炎细胞因子IL-6、IL-8和TNFα的水平，表明发生了全身性炎症反应。预期将含人AP基因的胡萝卜细胞口服给药小鼠已显著地降低了促炎细胞因子的水平(降低了53～77％)。

实施例14用链霉素进行抗菌处理后，通过给小鼠喂食含人AP基因的胡萝卜细胞来恢复肠道微生物群落。

在CD-1小鼠中研究了含人肠道AP基因的胡萝卜恢复在抗菌治疗后被破坏0的肠道微生物群落的能力。

第一组动物以200mg/kg的剂量口服链霉素抗生素一次，第二组—口服200mg/kg剂量的链霉素抗生素和100mg/kg剂量的含人肠道AP基因的冻干胡萝卜细胞一次；第三组—口服200mg/kg剂量的链霉素和100mg(胶囊质量)/kg剂量的含冷冻干燥的乳酸菌(嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、粪肠球菌)“Linex”益生菌药物。

每天收集小鼠***物并将其接种在LB营养培养基上，并检查正常肠道微生物群落的存在与否(表6)。

表6—小鼠***物中肠道微生物群落总数的定性检测(存在或不存在)

数据表明，在用链霉素治疗的小鼠中，使用该药物后24小时细菌的生长已停止。保持这组动物的***物无菌8天，仅在第9天才恢复。在摄取链霉素和冷冻干燥的含人肠道AP基因的胡萝卜细胞的老鼠组中，其微生物群落在4天后开始恢复，而在摄取链霉素和对照药物“Linex”的小鼠组中，微生物菌落仅在8天后才开始恢复。

因此，小鼠食用含人肠道AP基因的胡萝卜细胞可以改善链霉素处理后肠道微生物群落的恢复。

实施例15含人肠道AP基因的胡萝卜细胞促进经氨苄西林抗菌处理的后肠道微生物群落的恢复

实验使用了CD-1小鼠。第一组动物以每天50mg/kg的剂量口服抗生素氨苄西林7天，第二组—以每天50mg/kg的剂量口服氨苄西林和含人肠道AP基因的冻干胡萝卜细胞；第三组—每天50毫克(胶囊质量)/kg的剂量的氨苄西林和含冷冻干燥的乳酸菌(嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、粪肠球菌)的“Linex”益生菌药物。

连续3周，每天收集小鼠***物并将其接种在LB营养培养基上。表7显示了结果。

表7–接受氨苄西林治疗的小鼠以及同时摄取氨苄西林和含人肠道AP基因的冻干胡萝卜细胞的小鼠***物中存在的细菌

氨苄西林治疗开始后24小时，鼠肠道细菌的生长已停止。在氨苄西林组中，正常肠道微生物群落仅在实验的第20天才开始恢复。然而，在同时摄取氨苄西林与含人肠道AP基因的胡萝卜细胞的小鼠组中，正常肠道微生物群落已在实验的第11天开始恢复。在摄取链霉素和参考药物“Linex”的小鼠组中，微生物菌落仅在第18天才开始恢复。

所公开的发明可以广泛地用作大量消费的食品的成分，例如乳制品、饮料、糖果、以及医学和功能性食品的成分。

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