一种抗消化系统肿瘤的浆水无细胞培养液
阅读说明：本技术 一种抗消化系统肿瘤的浆水无细胞培养液 (Serous acellular culture solution for resisting digestive system tumors ) 是由 陈朋 刘宇恒 张仁涛 马万通 周忠坤 胡树坚 马云浩 杜康嘉 于 2020-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物制药技术领域,尤其涉及一种抗消化系统肿瘤的浆水无细胞培养液及其制备方法和应用,所述的浆水无细胞培养液通过以下方法制备：取浆水加入RPMI培养基或DMEM培养基重悬沉淀,恒温培养,离心获得的培养液即为浆水无细胞培养液。所述的浆水中含有植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、木糖葡萄球菌和发酵乳杆菌中的一种或者几种,所述的浆水无细胞培养液对结直肠癌、胃癌、肝癌和胰腺癌均具有较强抑制作用,且所述的浆水无细胞培养液来源于食品,是浆水的主要成分,安全,副作用小。(The invention relates to the technical field of biological pharmacy, in particular to a serous acellular culture solution for resisting digestive system tumors, a preparation method and application thereof, wherein the serous acellular culture solution is prepared by the following method: adding the plasma into RPMI culture medium or DMEM culture medium to perform basic suspension precipitation, performing constant temperature culture, and centrifuging to obtain a culture solution, namely the plasma-water cell-free culture solution. The serous fluid contains one or more of lactobacillus plantarum, lactobacillus paracasei, staphylococcus xylosus and lactobacillus fermentum, the serous fluid cell-free culture solution has a strong inhibition effect on colorectal cancer, gastric cancer, liver cancer and pancreatic cancer, and the serous fluid cell-free culture solution is derived from food, is a main component of the serous fluid, and is safe and small in side effect.)
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种抗消化系统肿瘤的浆水无细胞培养液及其制备方法和应用。
背景技术
2017年WHO统计表明，2015年共有5600万人口死亡，其中非传染性疾病(NCD)死亡人数4000万，占总人口数的70％。癌症作为NCD导致死亡第二原因占22％。2012年全球癌症统计结果表明，世界范围内结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在发达国家的死亡率及发病率均位列前三，在发展中国家其男女发病率及死亡率均位列前三。近年来，在我国CRC发病率及死亡率为14.2/10万和7.4/10万，均居第五位。现阶段我国结直肠癌发病率明显上升，其在41-65岁人群中发病率最高，且呈现稳定的增长趋势。目前，治疗结肠癌的主要是通过手术切除，术后服用5-Fu等化疗药物防止肿瘤复发。但目前，5-Fu等一线化疗药物一般作用于细胞的DNA结构影响其增殖，缺乏选择性，靶向性。
浆水是一种历史悠久的发酵食品，特别在我国西北地区，其深受人们的喜爱。研究发现浆水具有诸多的益生功能如：促进消化、调节血脂、维持肠道稳态等功能，并且在对于糖尿病、高血压、消化系统癌症等预防方面具有潜在的应用价值。浆水在中华传统药物典籍中一直是被看作为治疗胃肠道和呼吸道疾病的良药。浆水中含有丰富的益生菌资源，且其中的微生物经过几千年的自然驯化和选择，一些具有益生功能特性的微生物得以保存，这些适应于东方人肠道益生菌的资源为研究开发提供了广阔的资源。研究人员对多种采用传统工艺制备的浆水的微生物群落进行了系统分析，发现植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、木糖葡萄球菌和发酵乳杆菌等益生菌中的一种或几种是浆水的高丰度菌群，即使浆水的来源不同，其优势菌群的种类基本相同。
发明人意外地发现，将浆水加入RPMI培养基或DMEM培养基发酵后获得的浆水无细胞培养液对结直肠癌、胃癌、肝癌和胰腺癌细胞均具有较强抑制作用，且具有低毒高效的特点。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的第一目的是提供一种浆水无细胞培养液，所述的浆水无细胞培养液通过以下方法制备：
取浆水加入RPMI培养基或DMEM培养基重悬沉淀，恒温培养，离心获得的培养液即为浆水无细胞培养液。
进一步地，所述的浆水中含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)中的一种或者几种。
进一步地，所述的浆水中含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
进一步地，所述的浆水无细胞培养液通过以下方法制备：
(1)取浆水离心，弃上清液，用MRS培养基将其下层沉淀重悬，恒温培养，得浆水初级培养物，离心弃上清，浆水一级培养物沉淀备用；
(2)用RPMI培养基或DMEM培养基重悬步骤(1)中浆水初级培养物沉淀，调节pH至细胞最适pH，恒温培养，得浆水二级培养物；
(3)将步骤(2)中所得浆水二级培养物离心，取上清液；
(4)将步骤(3)中所得上清液用无菌滤膜过滤，即得浆水无细胞培养液。
进一步地，所述的浆水中含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)中的一种或者几种益生菌。
进一步地，所述的浆水中含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
进一步地，所述步骤(1)中浆水的制备方法，具体包括如下步骤：
按重量份，将1～3份的冻干蔬菜粉及5～15份辅料混合后加入到100份的沸水，冷却后加入1～3份发酵种子，所述的发酵种子含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)中的一种或者几种，于30℃条件下放置24～48h，即得浆水。
进一步地，所述发酵种子中含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
进一步地，所述的步骤(3)中，RPMI培养基或DMEM培养基中均含10％胎牛血清。
本发明的第二目的是提供所述的浆水无细胞培养液在制备治疗消化系统肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述的消化系统肿瘤为结直肠癌、胃癌、肝癌和胰腺癌中的一种或者几种。
本发明的第三目的是提供一种浆水无细胞培养液的制备方法，取浆水加入RPMI培养基或DMEM培养基重悬沉淀，调节pH至细胞最适pH，恒温培养，离心获得的培养液即为浆水无细胞培养液。
进一步地，所述的浆水中含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)中的一种或者几种。
进一步地，所述的浆水中含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
进一步地，所述的制备方法步骤为：
(1)取浆水离心，弃上清液，用MRS培养基将其下层沉淀重悬，恒温培养，得浆水初级培养物，离心弃上清，浆水一级培养物沉淀备用；
(2)用RPMI培养基或DMEM培养基重悬步骤(1)中浆水初级培养物沉淀，调节pH至细胞最适pH，恒温培养，得浆水二级培养物；
(3)将步骤(2)中所得浆水二级培养物离心，取上清液；
(4)将步骤(3)中所得上清液用无菌滤膜过滤，即得浆水无细胞培养液。
进一步地，所述的浆水中含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)中的一种或者几种益生菌。
进一步地，所述的浆水中含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
进一步地，所述步骤(1)中浆水的制备方法，具体包括如下步骤：
按重量份，将1～3份的冻干蔬菜粉及5～15份辅料混合后加入到100份的沸水，冷却后加入1～3份发酵种子，所述的发酵种子含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)中的一种或者几种，于30℃条件下放置24～48h，即得浆水。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
a.本发明所述的浆水无细胞培养液对结直肠癌、胃癌、肝癌和胰腺癌均具有较强抑制作用。
b.本发明所述的浆水无细胞培养液来源于食品，是浆水的主要成分，安全，副作用小。
附图说明
图1浆水无细胞培养液抗结直肠癌细胞实验
图2浆水无细胞培养液抗胃癌细胞实验
图3浆水无细胞培养液抗肝癌细胞实验
图4浆水无细胞培养液抗胰腺癌细胞实验
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的保护范围进行说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
实施例一、浆水的制备方法
(1)辅料的制备：将水煮沸后缓慢加入面粉，进行缓慢搅拌，待面粉糊化后停止加热，冷却至室温即得种子培养基；所述面粉与水的重量比为1：100；
(2)浆水的制备：按重量份，将1份的冻干蔬菜粉及10份所述辅料混合后加入到100份的沸水，冷却后加入1份所述发酵剂，然后于30℃条件下放置48h，即得浆水；所述市售浆水中至少包括植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、木糖葡萄球菌和发酵乳杆菌。
(3)浆水菌剂的制备：将所述浆水发酵液浓缩至原体积的1/10后，加入冻干保护剂，置于真空冷冻干燥机中冻干，得浆水菌剂。
实施例二、浆水无细胞培养液的制备
(1)将实施例一制备的浆水3000g/min离心10min，弃去其上清液，并用与上清等体积的MRS培养基将其下层沉淀重悬，并在恒温水浴摇床120rpm，37℃培养24h。
(2)将上述培养物用3000g/min离心10min，弃去其上清液，并用PBS重悬洗涤2次，3000g/min离心5min取沉淀。
(3)用RPMI培养基(含10％胎牛血清)重悬(2)中沉淀，用1M NaOH和乳酸调节上清液pH至细胞最适pH，在恒温水浴摇床120rpm，37℃培养16h，使其中菌落数达到109CFU。
(4)将(3)中所得培养物用3000g/min离心10min，取上清液。
(5)将(4)中所得溶液用0.22μm的无菌滤膜过滤两次，即得浆水无细胞培养液。
实施例三、浆水无细胞培养液抗结直肠癌细胞实验
(1)将结直肠癌细胞HCT116按照104/孔加入96孔板，每孔含100μl培养基，过夜培养。
(2)按照每孔20μl、40μl、60μl、80μl、100μl加入上述无菌溶液。每个孔重复六次。然后将平板在37℃和5％CO2中孵育48h。
(3)吸出上层培养物，并用PBS洗涤两次，加入含10μl MTT的培养基100μl，反应4h，吸出上清，加入DMSO150μl，充分溶解后490nm测量吸光度。
(4)通过与阴性对照对比计算浆水抗结直肠癌效果，实验结果如图1所示。
由图1可知，所述的浆水无细胞培养液作用于结直肠癌细胞HCT116后对其产生了较强的抑制作用，且具有浓度依赖关系，其抑制率随着浓度的增加而增加。说明所述的浆水无细胞培养液具有抗直肠癌的效果，可作为抗直肠癌的候选药物。
实施例四、浆水无细胞培养液抗胃癌细胞实验
(1)将胃癌细胞AGS按照104/孔加入96孔板，每孔含100μl培养基，过夜培养。
(2)按照每孔20μl、40μl、60μl、80μl、100μl加入上述无菌溶液。每个孔重复六次。然后将平板在37℃和5％CO2中孵育48h。
(3)吸出上层培养物，并用PBS洗涤两次，加入含10μl MTT的培养基100μl，反应4h，吸出上清，加入DMSO150μl，充分溶解后490nm测量吸光度。
(4)通过与阴性对照对比计算浆水抗胃癌效果，实验结果如图2所示。
由图2可知，所述的浆水无细胞培养液作用于胃癌细胞AGS后对其产生了较强的抑制作用，且具有浓度依赖关系，其抑制率随着浓度的增加而增加。说明浆水无细胞培养液具有抑制胃癌的作用，可作为抗胃癌的候选药物。
实施例五、浆水无细胞培养液抗肝癌细胞实验
(1)将肝癌细胞HepG2按照104/孔加入96孔板，每孔含100μl培养基，过夜培养。
(2)按照每孔20μl、40μl、60μl、80μl、100μl加入上述无菌溶液。每个孔重复六次。然后将平板在37℃和5％CO2中孵育48h。
(3)吸出上层培养物，并用PBS洗涤两次，加入含10μl MTT的培养基100μl，反应4h，吸出上清，加入DMSO150μl，充分溶解后490nm测量吸光度。
(4)通过与阴性对照对比计算浆水抗肝癌效果，实验结果如图3所示。
由图3可知，所述的浆水无细胞培养液作用于肝癌细胞HepG2后对其产生了较强的抑制作用，且具有浓度依赖关系，其抑制率随着浓度的增加而增加。说明所述的浆水无细胞培养液具有抗肝癌的作用，可以作为抗肝癌的候选药物。
实施例六、浆水无细胞培养液抗胰腺癌细胞实验
(1)将胰腺癌细胞PANC-1按照104/孔加入96孔板，每孔含100μl培养基，过夜培养。
(2)按照每孔20μl、40μl、60μl、80μl、100μl加入上述无菌溶液。每个孔重复六次。然后将平板在37℃和5％CO2中孵育48h。
(3)吸出上层培养物，并用PBS洗涤两次，加入含10μl MTT的培养基100μl，反应4h，吸出上清，加入DMSO150μl，充分溶解后490nm测量吸光度。
(4)通过与阴性对照对比计算浆水抗胰腺癌效果，实验结果如图4所示。
从图4中可知，所述的浆水无细胞培养液作用于胰腺癌细胞PANC-1后对其产生了较强的抑制作用，且具有浓度依赖关系，其抑制率随着浓度的增加而增加，说明所述的浆水无细胞培养液具有抗胰腺癌的作用，可作为抗胰腺癌的候选药物。
本发明通过体外MTT抗肿瘤活性评价发现，浆水无细胞培养液对人结直肠癌细胞株HCT116、胃癌细胞株AGS、肝癌细胞株HepG2、胰腺癌细胞株PANC-1的生长均具有显著的抑制作用。综上，浆水无细胞培养液可作为抗结直肠癌、胃癌、肝癌和胰腺癌的候选药物，具有潜在的开发应用前景。