阅读说明：本技术 一种放线菌抗菌次生代谢产物的制备方法 (Preparation method of antibacterial secondary metabolite of actinomycetes ) 是由 张新军 曹舰艇 于 2019-03-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种放线菌抗菌次生代谢产物的制备方法,涉及微生物技术领域,所述方法首先将产抗菌次生代谢产物的放线菌接种于液体培养基中培养,得到菌体发酵液；所述液体培养基的原料包括酵母提取物、葡萄糖和麦芽提取物和水；所得菌体发酵液接种于固体培养基发酵,得到活性发酵产物；所述固体培养基的原料包括介质支持物、酵母膏和蛋白胨和水；以乙酸乙酯浸提所述活性发酵产物,固液分离得到乙酸乙酯提取物,去除乙酸乙酯,得到放线菌抗菌次生代谢产物。本发明提供的制备方法能够明显增加放线菌抗菌次生代谢产物的积累,提高代谢产量；相对于单纯的液态发酵放线菌而言能耗低,发酵过程无需持续通入氧气。(The invention provides a preparation method of an antibacterial secondary metabolite of an actinomycete, which relates to the technical field of microorganisms, and the method comprises the steps of firstly inoculating the actinomycete producing the antibacterial secondary metabolite into a liquid culture medium for culture to obtain a thallus fermentation liquor; the raw materials of the liquid culture medium comprise yeast extract, glucose and malt extract and water; inoculating the obtained thallus fermentation liquor to a solid culture medium for fermentation to obtain an active fermentation product; the raw materials of the solid culture medium comprise a medium support, yeast extract, peptone and water; and leaching the active fermentation product by using ethyl acetate, carrying out solid-liquid separation to obtain an ethyl acetate extract, and removing the ethyl acetate to obtain the actinomycete antibacterial secondary metabolite. The preparation method provided by the invention can obviously increase the accumulation of antibacterial secondary metabolites of the actinomycetes and improve the metabolic yield; compared with the pure liquid fermentation actinomycetes, the method has low energy consumption, and oxygen does not need to be continuously introduced in the fermentation process.)

一种放线菌抗菌次生代谢产物的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种放线菌抗菌次生代谢产物的制备方法。

背景技术

放线菌抗菌活性次生代谢物的发酵通常是用一定的液体培养基进行液态发酵，实验室里一般用三角瓶在摇床里进行发酵，抗菌活性产物在发酵液中积累，通过一定的提纯手段将活性产物提取出来。一般情况下，发酵液中所能积累的活性产物的量非常少，由于发酵液中活性成分的浓度非常低，由于后续的提纯过程对活性成分损失比较大，有些含量低的活性成分无法被分离出来。因此，目前缺乏一种能够快速大量提取放线菌所产抗菌活性次生代谢产物的方法。

发明内容

本发明为了克服现有放线菌抗菌活性次生代谢产物的方法产量低、分离难度大、能耗高的缺陷，提供了一种放线菌抗菌次生代谢产物的制备方法，所得抗菌次生代谢产物量可提高10倍以上，并且能耗低、产率高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种放线菌抗菌次生代谢产物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将产抗菌次生代谢产物的放线菌接种于液体培养基中培养65～80h，得到菌体发酵液；

按重量份计，所述液体培养基的原料包括酵母提取物2～8份、葡萄糖2～8份和麦芽提取物8～20份和水800～1000份；

(2)以所述菌体发酵液接种于固体培养基进行发酵，得到活性发酵产物；

按重量份计，所述固体培养基的原料包括介质支持物70～150份、酵母膏1～6份和蛋白胨7～20份和水80～120份；

所述介质支持物选自大米、高粱、小麦、米糠或稻壳中的一种或多种；

(3)以乙酸乙酯浸提所述活性发酵产物，固液分离得到乙酸乙酯提取物，去除乙酸乙酯，得到放线菌抗菌次生代谢产物。

优选的，所述步骤(1)中的培养时还伴随搅拌。

优选的，所述步骤(1)中的液体培养基pH为7.0～7.4。

优选的，所述步骤(2)中菌体发酵液的接种量为0.12～0.5ml/kg。

优选的，所述步骤(2)中的固体培养基制备方法包括以下步骤：

S1、将酵母膏、蛋白胨和水混合，调节pH值为7.5，得到预混合液；

S2、将预混合液与介质支持物混合，静置6～10h，得到混合物；

S3、将混合物灭菌，振荡至介质支持物的任意两个颗粒之间不粘连，得到固体培养基。

优选的，所述步骤(3)中，乙酸乙酯的浸提次数为2～4次。

优选的，步骤(3)中，所述乙酸乙酯浸提时，乙酸乙酯与固态发酵物的体积比为1:1。

优选的，步骤(3)中，所述浸提的时间优选为30～60min。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供了一种放线菌抗菌次生代谢产物的制备方法，将产抗菌次生代谢产物的放线菌接种于液体培养基中培养65～80h，得到菌体发酵液；所述液体培养基的原料包括酵母提取物、葡萄糖和麦芽提取物和水；以所述菌体发酵液接种于固体培养基进行发酵，得到活性发酵产物；所述固体培养基的原料包括介质支持物、酵母膏和蛋白胨和水；所述介质支持物选自大米、高粱、小麦、米糠或稻壳中的一种或多种；以乙酸乙酯浸提所述活性发酵产物，固液分离得到乙酸乙酯提取物，去除乙酸乙酯，得到放线菌抗菌次生代谢产物。本发明提供的制备方法能够明显增加放线菌抗菌次生代谢产物的积累，提高代谢产量；同时，本发明所述方法中的固体培养基采用大米、高粱等作为介质支持物，除了起到支持介质作用外，还能为放线菌提供碳源和营养物质，为放线菌提供大量的生长空间，有利于放线菌菌丝的生长以及次级代谢产物的积累。本发明所述制备方法相对于单纯的液态发酵放线菌而言能耗低，发酵过程无需持续通入氧气。

具体实施方式

本发明提供了一种放线菌抗菌次生代谢产物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将产抗菌次生代谢产物的放线菌接种于液体培养基中培养65～80h，得到菌体发酵液；

按重量份计，所述液体培养基的原料包括酵母提取物2～8份、葡萄糖2～8份和麦芽提取物8～20份和水800～1000份；

(2)以所述菌体发酵液接种于固体培养基进行发酵，得到活性发酵产物；

按重量份计，所述固体培养基的原料包括介质支持物70～150份、酵母膏1～6份和蛋白胨7～20份和水80～120份；

所述介质支持物选自大米、高粱、小麦、米糠或稻壳中的一种或多种；

(3)以乙酸乙酯浸提所述活性发酵产物，固液分离得到乙酸乙酯提取物，去除乙酸乙酯，得到放线菌抗菌次生代谢产物。

本发明为了得到放线菌抗菌次生代谢产物，首先以液体培养基对产抗菌次生代谢产物的放线菌进行培养，一方面能够扩大放线菌数量，另一方面先进行液体培养再接种固体培养基更有利于刺激抗菌次级代谢产物的生成。将经过液体培养后得到的菌体发酵液接种在固体培养基中进行发酵，本发明采用的固体培养基中利用大米、高粱、麦麸等天然物质作为介质支持物，一方面作为碳源能够提供放线菌抗菌次级代谢产物产生的营养物质，另一方面所述介质支持物还能够起到支撑介质的作用，为放线菌菌丝提供更大的生存、延展空间，却又避免了如液体培养时容易出现菌丝团的问题，因而采用本发明提供的固体培养基进行固体发酵可以得到积累了大量抗菌次生代谢产物的活性发酵产物。本发明对所得活性发酵产物以乙酸乙酯进行浸提，分离得到含有放线菌抗菌次生代谢产物的混合物。如本发明的具体实施例所示，按照本发明所述方法制备得到的放线菌抗菌次生代谢产物产量是传统液态发酵方式的11.3倍，显著提高了产量，能耗较低。

具体来说，本发明首先将产抗菌次生代谢产物的放线菌接种于液体培养基中培养65～80h，得到菌体发酵液；按重量份计，所述液体培养基的原料包括酵母提取物2～8份、葡萄糖2～8份和麦芽提取物8～20份和水800～1000份。本发明得到的菌体发酵液中包括放线菌菌体及其部分次生代谢产物和液体培养基。

在本发明中，所述产抗菌次生代谢产物的放线菌包括但不限于抗金黄色葡萄球菌的放线菌、抗枯草芽孢杆菌的放线菌。

在本发明中，按重量份计，所述液体培养基优选的包括酵母提取物3～5份、葡萄糖3～6份和麦芽提取物9～12份和水950～980份。在本发明中，所述液体培养基的pH值优选为7.0～7.4，更优选为7.2。在本发明中，所述酵母提取物和麦芽提取物均为市售商品，本发明对此不做限定。

在本发明中，所述液体培养基中培养的时间优选为70～75h，更优选为72h；所述培养的温度优选为25～32℃，更优选为28℃。在本发明中，所述液体培养基中的培养时还伴随搅拌；更优选的，所述搅拌速率优选为

得到菌体发酵液后，本发明将所述菌体发酵液接种于固体培养基进行发酵，得到活性发酵产物；按重量份计，所述固体培养基的原料包括介质支持物70～150份、酵母膏1～6份和蛋白胨7～20份和水80～120份；

在本发明中，所述菌体发酵液在固体培养基的接种量优选为0.12～0.5ml/kg，更优选为1.0ml/L。在本发明中，所述发酵的温度优选为25～32℃，更优选为28℃。在本发明中，所述发酵的时间优选为10～15d，更优选为12～14d。

在本发明中，按重量份计，所述固体培养基的原料包括介质支持物80～120份、酵母膏2～5份和蛋白胨8～12份和水90～110份。在本发明中，所述固体培养基中的介质支持物选自大米、高粱或小麦中的一种或多种；本发明选择的介质支持物均为天然物质，其营养成分复杂但以淀粉(多糖)为主，兼具营养提供和支持介质的作用，为放线菌的菌丝生长提供更大空间。在本发明中，酵母膏和蛋白胨为放线菌提供有机氮、碳源、维生素等其他营养物质。

在本发明中，所述固体培养基的制备方法优选的包括以下步骤：

S1、将酵母膏、蛋白胨和水混合，调节pH值为7.5，得到预混合液；

S2、将预混合液与介质支持物混合，静置6～10h，得到混合物；

S3、将混合物灭菌，振荡至介质支持物的任意两个颗粒之间不粘连，得到固体培养基。

本发明先将酵母膏、蛋白胨和水混合并调节pH值的目的是为了进行预混合，以便后续介质支持物进行吸附。

在本发明中，所述预混合液与介质支持物混合后的静置过程中，介质支持物将含有酵母膏、蛋白胨的预混合液吸收，介质支持物的体积随之膨胀，进而使得酵母膏、蛋白胨进入到氮源中，为后续介质支持物分散情况下放线菌的生长提供充足营养。在本发明中，所述预混合液与介质支持物混合后的静置时间优选为8h

本发明将混合物灭菌后即可得到固体形态的培养基，将介质支持物的任意两个颗粒振荡至不相互黏连才能够保证空气在介质支持物颗粒之间畅通，有利于放线菌菌丝生长，便于通风透气和菌丝蔓延，从而省去了常规发酵培养时需要持续向发酵培养基中通入氧气的步骤，有效节省能耗。本发明对于灭菌方法没有特殊限定，采用本领域已知的灭菌方法即可，比如高温蒸汽灭菌。

得到活性发酵产物后，本发明以乙酸乙酯浸提所述活性发酵产物，固液分离得到乙酸乙酯提取物，去除乙酸乙酯，得到放线菌抗菌次生代谢产物。本发明采用乙酸乙酯作为浸提溶剂能够提高放线菌的抗菌次生代谢产物，通过浸提将活性发酵产物中的抗菌次生代谢产物浸提到乙酸乙酯中，提取率较高。

本发明为了进一步提高放线菌抗菌次生代谢产物的得率，优选的以乙酸乙酯浸提2～4次；每次乙酸乙酯浸提时，所述活性发酵产物与乙酸乙酯优选的按照等体积比混合。在本发明中，每次乙酸乙酯浸提时的浸提时间独立地优选为30～60min，更优选为40～50min。

放线菌抗菌活性次生代谢物的发酵通常是用一定的液体培养基进行液态发酵，实验室里一般用三角瓶在摇床里进行发酵，抗菌活性产物在发酵液中积累，通过一定的提纯手段将活性产物提取出来。一般情况下，发酵液中所能积累的活性产物的量非常少，由于发酵液中活性成分的浓度非常低，后续的提纯过程对活性成分损失比较大，有些含量低的活性成分无法被分离出来。

本发明针对性的对提高放线菌的抗菌次生代谢产物的产量进行研究，获得了上述可显著提高抗菌次生代谢产物产量，并相对于常规液体发酵方式降低能耗的制备方法。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、培养基的制备：

(1)固体培养基的配制：①称取大米100g装入1000mL三角瓶中，加入自来水冲洗至淘米水不再混浊，把水沥干备用；②称取酵母膏3g，蛋白胨10g，加入到盛有100mL蒸馏水的三角瓶中，搅拌待其溶解，调pH7.5后备用；③将②中配制的酵母膏和蛋白胨溶液加入到①中的大米中，浸泡8h，待大米把酵母膏和蛋白胨溶液吸收，此时大米因吸收水分膨胀。

将浸泡后得到的混合物在121℃高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌后将三角瓶取出，摇晃使大米粒之间不粘连。大米颗粒之间不粘连保证了空气在大米粒之间畅通，也有利于菌丝的生长。

(2)液体培养基的配制：酵母提取物4g，葡萄糖4g，麦芽提取物(麦芽提取物(MaltExtract))10g，去离子水1000mL，pH 7.2，110℃高压灭菌锅内灭菌30min灭菌。

2、固态发酵物的制备

(1)菌种活化：取保存产抗菌产物的放线菌菌种——抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)菌株放线菌在高氏1号平板上划线法纯化，在28℃恒温培养箱中培养48h，长出单菌落；

(2)挑取单菌落至液体培养基中，在28℃摇床中200rpm培养72h，即得菌体发酵物；

(3)接种：用1000μL微量移液器吸取1000μL菌液打入盛有200ml固体培养基的三角瓶中，摇匀，使菌体在培养基中分布均匀。

(4)发酵：将接种过和固体培养基在28℃恒温培养箱中培养15d。

3、抗菌粗提物的制备

(1)向装有固态发酵物的三角瓶中加入乙酸乙酯200ml浸提，倒出液体部分；重复上述步骤2次，合并所得液体部分，即得乙酸乙酯浸提液；

(2)将乙酸乙酯溶液在旋蒸仪上蒸干，得到放线菌抗菌次生代谢产物提取物。

实施例2

1、培养基的制备：

(1)固体培养基的配制：①称取大米100g装入1000mL三角瓶中，加入自来水冲洗至淘米水不再混浊，把水沥干备用；②称取酵母膏3g，蛋白胨10g，加入到盛有100mL蒸馏水的三角瓶中，搅拌待其溶解，调pH7.5后备用；③将②中配制的酵母膏和蛋白胨溶液加入到①中的大米中，浸泡8h，待大米把酵母膏和蛋白胨溶液吸收，此时大米因吸收水分膨胀。

将浸泡后得到的混合物在121℃高压灭菌锅内灭菌20min，灭菌后将三角瓶取出，摇晃使大米粒之间不粘连。大米颗粒之间不粘连保证了空气在大米粒之间畅通，也有利于菌丝的生长。

(2)液体培养基的配制：酵母提取物4g，葡萄糖4g，麦芽提取物(麦芽提取物(MaltExtract))10g，去离子水1000mL，pH 7.2，110℃高压灭菌锅内灭菌30min灭菌。

2、固态发酵物的制备

(1)菌种活化：取保存产抗菌产物的放线菌菌种——抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)菌株放线菌在高氏1号平板上划线法纯化，在28℃恒温培养箱中培养48h，长出单菌落；

(2)挑取单菌落至液体培养基中，在28℃摇床中200rpm培养72h，即得菌体发酵物；

(3)接种：用1000μL微量移液器吸取1000μL菌液打入盛有200ml固体培养基的三角瓶中，摇匀，使菌体在培养基中分布均匀。

(4)发酵：将接种过和固体培养基在28℃恒温培养箱中培养15d。

3、抗菌粗提物的制备

(1)向装有200ml固态发酵物的三角瓶中加入乙酸乙酯200ml浸提，倒出液体部分；重复上述步骤2次，合并所得液体部分，即得乙酸乙酯浸提液；

(2)将乙酸乙酯溶液在旋蒸仪上蒸干，得到放线菌抗菌次生代谢产物提取物。

对比例1

1、培养基的制备：

液体培养基的配制：酵母提取物4g，葡萄糖4g，麦芽提取物(麦芽提取物(MaltExtract))10g，去离子水1000mL，pH 7.2，110℃高压灭菌锅内灭菌30min灭菌。

2、抗菌代谢物的发酵

(1)菌种活化：取保存产抗菌产物的放线菌菌种——抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)菌株放线菌菌株P55’-1在高氏1号平板上划线法纯化，在28℃恒温培养箱中培养48h，长出单菌落；

(2)挑取单菌落至液体培养基中，在28℃摇床中200rpm培养15d，得到液体发酵物。

3、抗菌粗提物的制备

(1)向装有200ml液体发酵物的三角瓶中加入乙酸乙酯200ml浸提，倒出液体部分；重复上述步骤2次，合并所得液体部分，即得乙酸乙酯浸提液；

(2)将乙酸乙酯溶液在旋蒸仪上蒸干，得到放线菌抗菌次生代谢产物提取物。

对比例2

1、培养基的制备：

液体培养基的配制：酵母提取物4g，葡萄糖4g，麦芽提取物(麦芽提取物(MaltExtract))10g，去离子水1000mL，pH 7.2，110℃高压灭菌锅内灭菌30min灭菌。

2、抗菌代谢物的发酵

(1)菌种活化：取保存产抗菌产物的放线菌菌种——抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)菌株放线菌菌株P160823在高氏1号平板上划线法纯化，在28℃恒温培养箱中培养48h，长出单菌落；

(2)挑取单菌落至液体培养基中，在28℃摇床中200rpm培养15d，得到液体发酵物。

3、抗菌粗提物的制备

(1)向装有200ml液体发酵物的三角瓶中加入乙酸乙酯200ml浸提，倒出液体部分；重复上述步骤2次，合并所得液体部分，即得乙酸乙酯浸提液；

(2)将乙酸乙酯溶液在旋蒸仪上蒸干，得到放线菌抗菌次生代谢产物提取物。

实施例3

分别以甲醇溶解实施例1～2和对比例1～2得到的放线菌抗菌次生代谢产物提取物，配制成4mg/ml的提取物。

用96孔板法进行抗菌活性检测：

96孔板的每孔中添加菌体浓度为10⁵个/mL金黄色葡萄球菌溶液78μL(MH肉汤)，由于菌体浓度低，所以呈澄清状，加入药物或粗提物，2μL，在28℃恒温培养箱中培养20h。

如果对金黄色葡萄球菌有抑制活性，则为澄清，如果没有抑制活性，则金黄色葡萄球菌在里面繁殖，为混浊状，为客观起见，用酶标仪测其吸光值。

检测结果显示，实施例1采用200ml固体培养基制备得到的放线菌抗菌次生代谢产物提取物中，含有17ml活性为12.5μg/ml(MIC)的抗菌活性物质；实施例2采用200ml固体培养基制备得到的放线菌抗菌次生代谢产物提取物中，含有21.5ml活性为12.5μg/ml(MIC)的抗菌活性物质。

而对比例1采用200ml液体培养基制备得到的放线菌抗菌次生代谢产物提取物中，含有1.5ml活性为12.5μg/ml(MIC)的抗菌活性物质；对比例2采用200ml液体培养基制备得到的放线菌抗菌次生代谢产物提取物中，含有2.3ml活性为12.5μg/ml(MIC)的抗菌活性物质。

可以看出，本发明提供的制备方法所得抗菌次生代谢产物产量显著高于对比例，即本发明提供的制备方法在相同体积的培养基下可以得到更多的放线菌抗菌次生代谢产物，产率显著提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。