阅读说明：本技术 一种根际假河杆菌烟草发酵物、其制备方法及用途 (Rhizosphere pseudoriver bacillus tobacco fermentation product, preparation method and application thereof ) 是由 段焰青 高莉 杜刚 李源栋 董立民 陈兴 蒋举兴 郭青 于 2020-05-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种根际假河杆菌烟草发酵物的制备方法,包括以下步骤：①将根际假河杆菌C1-9菌种活化；②制备根际假河杆菌C1-9种子培养液；③利用根际假河杆菌C1-9对烟草进行发酵,得到烟草发酵液；④提取烟草发酵液,得到根际假河杆菌烟草发酵物。本发明还公开了所述根际假河杆菌烟草发酵物及用于卷烟中的用途。本发明的根际假河杆菌烟草发酵物能显著提升卷烟抽吸品质。(The invention discloses a preparation method of rhizosphere pseudoriver bacillus tobacco leavening, which comprises the following steps: activating rhizosphere pseudoriver bacillus C1-9 strain; preparing a rhizosphere Pseudohelobacter C1-9 seed culture solution; thirdly, fermenting the tobacco by utilizing rhizosphere Pseudohelobacter C1-9 to obtain tobacco fermentation liquor; fourthly, extracting the tobacco fermentation liquor to obtain the rhizosphere pseudoriver bacillus tobacco fermentation product. The invention also discloses the rhizosphere pseudoriver bacillus tobacco fermentation product and application of the rhizosphere pseudoriver bacillus tobacco fermentation product in cigarettes. The rhizosphere pseudoriver bacillus tobacco fermentation product can obviously improve the smoking quality of cigarettes.)

一种根际假河杆菌烟草发酵物、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于烟用香精香料技术领域，具体涉及一种烟草的根际假河杆菌 C1-9的发酵物、其制备方法和用途。

背景技术

香精香料在食品、饲料、化妆品、化工和制药等工业上具有重要地位，其来 源主要包括天然与化学合成两种方式。其中，化学合成的香精香料约占整个产品 的85％，但化学合成的香精香料具有副产物多、产率低、高成本、污染环境等缺 点。随着绿色工业的倡导，天然香精香料越来越被人们看重，天然香精香料主要 来源于动物和植物，但动物、植物香料资源有限，提取成本高，远远满足不了日 益增长的市场需求。微生物制备的香料是以天然原料为起始物，使用发酵技术、 酶技术等产生的香料，也属于天然香料；且微生物制备的香料具有生产周期短， 不受气候影响，反应条件温和，产品分离后形成的“三废”少，对环境友好等多 种优越性，使其可成为产香植物的替代者。

烟草行业是重要的消费品制造行业，通过降焦减害提高卷烟的安全性已成为 烟草行业的共同目标。但随着降低卷烟焦油量的下降，卷烟香气成分不足的问题 也越发凸显。为弥补卷烟香气和吃味，添加烟用香精香料已成为完善产品风格的 决定性因素和提高卷烟香气质量的一个有效手段。获取风格特征各异，且具有良 好安全性能的烟用香精香料也成为了烟草制品研发的重要方向之一。

烟用香精香料按照来源，分为来自烟草本身的香料、非烟草的天然香料和人 工合成的香料。通过微生物制备的天然香料是近年来新兴的烟用香料的原料来源 之一，通过微生物制备的微生物香料具有原料易得，条件温和、选择性高等优势。 但目前能用于微生物产香的优势菌株种类并不多，所以筛选并使用新的菌株用于 烟草发酵制备烟用香精香料具有现实的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种根际假河杆菌烟草发酵物、其制备方法及用途。 本发明的根际假河杆菌烟草发酵物制备方法是利用具有产香功能的微生物根际 假河杆菌C1-9对烟草进行发酵处理，再经加热回流提取、乙醇回溶等制备工艺得 到根际假河杆菌C1-9发酵物，其致香成分种类和含量明显提高，将其用于烟丝中， 具有丰富卷烟烟香、使烟草香韵突出饱满、增强卷烟风格特征的作用。

本发明的技术方案如下：

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

本发明第一方面公开了一种根际假河杆菌烟草发酵物的制备方法，包括以下 步骤：

①将根际假河杆菌C1-9菌种活化；

②制备根际假河杆菌C1-9种子培养液；

③利用根际假河杆菌C1-9对烟草进行发酵，得到烟草发酵液；

④提取步骤③的烟草发酵液，得到所述的根际假河杆菌烟草发酵物。

优选地，步骤①根际假河杆菌C1-9菌种活化具体步骤为：将培养基在121℃ 下灭菌25分钟，摆成斜面，接种根际假河杆菌C1-9菌株，28℃下培养1周，获得 试管菌种；所述培养基为R2A琼脂培养基。

优选地，步骤②制备根际假河杆菌C1-9种子培养液具体步骤为：将种子培 养基在121℃下灭菌25分钟，从斜面培养上挑取部分步骤①得到的菌丝体接入 种子液中，30℃震荡培养48h，获得种子培养液；所述种子培养基为R2A液体 培养基。

优选地，步骤③的发酵步骤为：将烟草粉碎成烟末，加水混合均匀；然后向 其中加入糖源和无机盐，在121℃下灭菌25分钟，按烟末重量的5％～20％接种 步骤②得到的根际假河杆菌C1-9种子培养液，30℃震荡培养进行发酵，发酵时间 24～48h，得到烟草发酵液。烟草可以为烟叶或叶梗。

优选地，所述糖源为葡萄糖、乳糖、果糖中的一种或多种的混合物，其加入 量为混合液的1.0wt％～5.0wt％。

优选地，所述无机盐为KH₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、Fe₃(SO₄)₂、NaCl、CaCl₂中一种或多种的混合物，其加入量为混合液0.1wt％～2.0wt％。

优选地，步骤④提取烟草发酵液的步骤为：将步骤③得到的烟草发酵液在60 ～80℃条件下加热回流提取2～4h，然后在过滤目数为150～250目的条件下抽滤， 所得滤液在45～60℃、60～100kPa条件下浓缩，得到烟草发酵浓缩提取液；向得 到的烟草发酵浓缩提取液中加入其3～5倍质量的85wt％～95wt％乙醇，混合后置 于-10℃冷冻条件下沉降8～12h，得到上层清液和沉淀物；取上层清液在45～65℃、 60～90kPa条件下浓缩至密度为1.0～1.5g/cm³，即得到所述的根际假河杆菌烟草 发酵物。

本发明第二方面公开了所述的制备方法制得的根际假河杆菌烟草发酵物。

本发明第三方面公开了所述的根际假河杆菌烟草发酵物用于提升卷烟抽吸 品质的用途。

优选地，将所述根际假河杆菌烟草发酵物用丙二醇或乙醇稀释3～5倍质量 后，以喷雾的方式喷洒到卷烟烟丝上；所述根际假河杆菌烟草发酵物的添加量为 卷烟烟丝质量0.2～0.5wt％。

本发明的微生物根际假河杆菌C1-9，其是从云南会泽烟草根际土壤中分离 得到的，对其进行了形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明其 是一个新的菌种，微生物学分类命名为根际假河杆菌(拉丁文名称：Rivibacter sp.)， 参椐的生物材料(株)为：C1-9，已于2019年8月9日在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.1.13864，保藏单位为：中国科学院微生物研究所，保藏地址为：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号。

本发明的根际假河杆菌C1-9菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为： 在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起， 呈浅黄色；淀粉水解、纤维素水解，过氧化氢酶、酸性磷酸酶、胰蛋白酶、吐温 20，40，60和80水解呈阳性，氧化酶，酪蛋白水解，α-半乳糖苷酶、脲酶呈阴 性。能利用果糖、乳糖、柠檬酸、纤维二糖、岩藻糖、甜醇、蜜二糖、丙氨酸、 精氨酸、天冬氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油和 磷脂酰乙醇胺，细胞的呼吸醌为泛醌-8(Q-8)。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明首次利用微生物新菌种根际假河杆菌C1-9对烟草进行发酵，得到 的根际假河杆菌烟草发酵物中致香成分种类和含量明显提高；将其应用于卷烟烟 丝中，具有丰富卷烟烟香、使烟草香韵突出饱满、增强卷烟风格特征的作用。本 发明的根际假河杆菌烟草发酵物应用于卷烟中能显著提升卷烟抽吸品质。

2、本发明的根际假河杆菌烟草发酵物的制备过程无有害的有机溶剂引入， 制备工艺安全环保，且原料易得，成本低廉，便于实现工业化生产。本发明的根 际假河杆菌烟草发酵物的制备方法具有良好的应用价值。

附图说明

图1为实施例1所制得的根际假河杆菌烟草发酵物的GC-MS图谱。

图2为实施例2所制得的对照烟草提取物的GC-MS图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释 本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉 及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

1、根际假河杆菌C1-9菌种的活化

采用斜面保藏培养基，培养基为R2A琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖 0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸 钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2。 将培养基在121℃下灭菌25分钟，摆成斜面，接种根际假河杆菌C1-9菌株，28℃ 下培养1周，获得试管菌种。

2、制备根际假河杆菌C1-9种子培养液

采用种子培养基，种子培养基为R2A液体培养基，配方为：葡萄糖0.5g；酵 母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g； 磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；蒸馏水1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下 灭菌25分钟，从步骤(1)的试管斜面上挑取部分菌丝体接入种子液中，30℃震 荡培养48h，获得液体菌种。

3、利用根际假河杆菌C1-9对烟草进行发酵

将晾晒干的烟叶粉碎成粒径50目的烟末，加入其质量4倍的水，混合均匀； 在上述混合液中分别加入占混合液质量1％的葡萄糖、乳糖和果糖，以及加入占 混合液质量0.1％的KH₂PO₄、NaCl、MgSO₄，混合均匀后在121℃下灭菌25分钟， 按烟末质量的5％接种上述得到的根际假河杆菌C1-9种子培养液，30℃震荡培养 进行发酵，发酵时间48h，得到烟末发酵液。

4、烟末发酵液的提取精制

A.加热回流提取：将步骤3所得烟末发酵液在60℃条件下加热回流提取3h； 然后趁热抽滤，过滤目数为200目；所得滤液在50℃，80kPa条件下浓缩至体积不 再变化，得到发酵烟末浓缩提取液。

B.乙醇回溶：向步骤A得到的发酵烟末浓缩提取液中加入其4倍质量的95％ 乙醇，充分搅拌溶解后，置于-10℃冷冻条件下沉降12h，得到上层清液和沉淀物。

C.浓缩：取上层清液在50℃、90kPa条件下浓缩至密度为1.2g/cm³即得到 所述的根际假河杆菌烟草发酵物，其理化指标如表1所示。

表1根际假河杆菌烟草发酵物的理化指标

序号	检测项目	检测结果
			1	外观及澄清度	红棕色液体，澄清
2	相对密度(g/cm<sup>3</sup>)	1.2036±0.008
			3	折光指数	1.3681±0.008
4	挥发性成分总量(wt％)	25.7±5.0
			5	乙醇中的溶混度(25℃)	不溶于水，可溶于60-95wt％乙醇中
6	Pb	<5mg/kg
			7	As	<1mg/kg
8	香豆素	未检出
			9	黄樟素	未检出

5、根际假河杆菌烟草发酵物的应用

取占卷烟烟丝质量0.3％的上述得到的根际假河杆菌烟草发酵物，用其5倍 质量的丙二醇溶解后，以喷雾的方式喷洒到卷烟烟丝上，放入恒温恒湿箱内，在 湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡48h；然后卷制成卷烟烟支进行评吸。

实施例2

1.对照烟草提取物及对照卷烟的制备

将烟叶粉碎成粒径为50目的粉末，加入4倍的水，混合均匀后代替烟末发 酵液，按照实施例1中的步骤4～5，制得对照烟草提取物及其对照卷烟。

2.烟支感官评价

将实施例1含有根际假河杆菌烟草发酵物的命名为试验烟支，不含任何烟草 提取物的命名为空白烟支，本实施例所制含对照烟草提取物的命名为对照烟支； 交由专业的评吸员进行感官对比评吸，结果如表2所示。由评吸结果可知，对照 烟支进行抽吸时，带有一定的膏香和清香香韵，但香气质感稍显单薄，烟气香韵 体现不理想，刺激性稍有改善；而含有本发明的根际假河杆菌烟草发酵物的试验 烟支进行抽吸时，除膏香和清香外，还带有一种特殊的花香、果香和甜香香韵， 香气浓郁自然，香韵更加立体饱满，烟气刺激性也明显减轻，余味较为干净。因 此本发明的根际假河杆菌烟草发酵物能明显提升了卷烟抽吸品质。

表2烟支的评吸结果

3.根际假河杆菌烟草发酵物的挥发性香气成分对比分析评价

将实施例1所制的根际假河杆菌烟草发酵物和实施例2所制的对照烟草提取 物分别进行GC-MS分析，两者的GC-MS图谱见图1和图2，其中的挥发性物质 如表3所示。由表3可知，通过根际假河杆菌发酵制备得到的根际假河杆菌烟草 发酵物，相比实施例2的对照烟草提取物，其挥发性物质种类和含量明显增加， 如环戊酮、苯甲醇、2-乙酰基吡咯、苯乙醇、辛酸、甲酸苯乙酯、γ-壬内酯、(E)-β- 大马酮、二氢猕猴桃内酯和巨豆三烯酮等都有显著增加。这些香味物质香气阈值 较低，含量的稍微增加，都能促使烟草香气浓郁程度明显改善。本发明的根际假 河杆菌烟草发酵物极大地提升了卷烟抽吸品质。

表3实施例1根际假河杆菌烟草发酵物与实施例2对照烟草提取物的香气成分对比

注：“/”表示未检出。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不 用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改 进等，均应包含在本发明的保护范围之内。