阅读说明：本技术 单价疫苗制剂及其制备方法 (Monovalent vaccine formulations and methods of making the same ) 是由 古鲁斯瓦米·巴拉卡兰 玛尼坎姆·拉维汉德兰 古鲁纳森·阿鲁·辛尼亚 恩恩·陈 于 2018-12-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种根据说明性实施方案的疫苗制剂。所述制剂包含：活的减毒霍乱疫苗株VCUSM14P；疫苗培养基,所述疫苗培养基具有淀粉、纤维素、右旋糖和酵母提取物；以及磷酸盐缓冲盐水。(The present invention discloses a vaccine formulation according to an illustrative embodiment. The formulation comprises: live attenuated cholera vaccine strain VCUSM 14P; a vaccine medium having starch, cellulose, dextrose, and yeast extract; and phosphate buffered saline.)

单价疫苗制剂及其制备方法

技术领域

本发明总体上涉及一种疫苗制剂及其制备方法。更具体地，本发明涉及用于治疗O139霍乱弧菌(V.cholerae.)的单价疫苗制剂。该制剂无需冷链且持久，并且本发明还公开了该制剂的制备方法。

背景技术

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是一种革兰氏阴性的、逗号形细菌。细菌的自然生境是微咸水或咸水。一些霍乱弧菌菌株引起霍乱疾病。霍乱可以是地方性的、流行性的或大流行性的。尽管在研究方面取得了重大进展，但该病状对现代医学界仍是一个挑战。虽然该疾病可能是无症状的或轻度的，但严重的霍乱可在发作数小时内引起脱水和死亡。霍乱(腹泻性疾病)造成全球流行，估计在47个国家每年有430万例，死亡129064例。

该细菌栖居在水生生态系统以及宿主肠道中。在水生环境中，产毒性的和非产毒性的霍乱弧菌菌株全年存活。产毒性菌株通常是通过摄取受污染的水或食物进入人宿主，定殖于小肠，繁殖并产生霍乱毒素，从而引起急性腹泻病。在地方病流行区，全世界每年都组织大规模的口服疫苗活动。然而，在发展中国家用WHO许可的现有口服霍乱疫苗，例如和实施霍乱疫苗接种活动存在操作性挑战。此类疫苗基于全细胞、灭活霍乱弧菌O1和O139血清群。此类疫苗是安全的，并且诱导足够的短期保护。然而，疫苗需要冷链供应(2-8℃)，以确保疫苗从生产到免疫部位的效力，从而导致疫苗接种成本增加14-20％。另外，此类疫苗必须反复使用，从而导致高成本。作为替代方案，基于活的减毒菌株的霍乱疫苗可模拟自然感染，具有强免疫原性，无需反复给药。此外，与高度纯化的亚基和全细胞灭活疫苗相比，它不需要复杂的下游处理，并且生产成本相对较低。环境中各种抑制生长的胁迫，诸如营养剥夺、温度、盐度和氧气含量的波动，会在霍乱弧菌中引起涉及调节几种基因的表达的严格反应，以介导其适应、持久性、霍乱的播散和传播。

例如，欧洲专利公布EP1650315B1和美国专利公布US7838016B2公开了霍乱弧菌菌株VCUSM1和VCUSM4、其产生方法及其疫苗衍生物。该方法涉及菌株VCUSM1和YCUSM4的hemA基因突变，该突变致使霍乱弧菌无法从头合成氨基乙酰丙酸(ALA)。此类疫苗显示出作为对O139霍乱弧菌有毒的能够引起高抗体滴度和保护性免疫反应的新的无毒疫苗候选物的潜力。然而，与其他霍乱疫苗类似，用活的减毒VCUSM1和VCUSM4菌株制成的制剂也对热敏感，需要冷链供应。

在另一个实例中，美国专利公开US4169886A涉及针对出血败血性巴斯德菌(Pasteurellamultocida)的活疫苗，该疫苗用于通过注射、经口或作为气溶胶向家禽施加，含有减毒的无毒、遗传稳定性出血败血性巴斯德菌菌株；涉及用于产生减毒的遗传稳定性、无毒出血败血性巴斯德菌菌株的方法，该方法包括培养有毒的野外菌株，处于37℃下18小时后进行选择。然而，该疫苗主要用于家禽并且具有冷链依赖性。

因此，不可避免地要开发一种热稳定的活的减毒霍乱疫苗，该疫苗可在室温下储存，以增大其对全球免疫规划的覆盖范围。与其他微生物一样，霍乱弧菌细菌菌株因为在恶劣的自然环境中也具有存活能力，因此也是主要的采用者。因此，通过揭示其在自然条件下的适应/存活机制，我们可以在配制疫苗候选物时模拟相似条件以使其在无冷链的条件下储存以在最后一英里服务于底层的十亿人。

因此，需要开发一种可以无需冷链的疫苗制剂，避免反复给药，从而使其成本更低且寿命更长。

发明内容

针对以上问题而完成了本发明，并且本发明公开了根据说明性实施方案的针对O139霍乱弧菌的单价疫苗制剂。所述制剂包含：活的减毒霍乱疫苗株VCUSM14P；疫苗培养基，所述疫苗培养基具有淀粉、纤维素、右旋糖和酵母提取物；以及磷酸盐缓冲盐水。

在另一个实施方案中，本发明公开了单价疫苗制剂的用途。该制剂包括在疫苗培养基中生长的活的减毒霍乱疫苗株VCUSM14P，所述疫苗培养基具有在磷酸盐缓冲盐水中的淀粉、纤维素、右旋糖和酵母提取物。将该制剂配置用于治疗野生型霍乱弧菌O139。

在另一个实施方案中，本发明公开了单价疫苗制剂的用途。该制剂包括在疫苗培养基中生长的活的减毒霍乱疫苗株VCUSM14P，该疫苗培养基具有在1000mL磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2)中的在1％-5％范围内的淀粉、至少0.3％的纤维素、至少20％的右旋糖和至少0.5％的酵母提取物。将该制剂配置用于治疗野生型霍乱弧菌O139。

在另一个实施方案中，本发明公开了一种用于制备针对O139的单价疫苗制剂的方法。该方法包括在疫苗生长培养基中培养菌株VCUSM14P的活的减毒细菌细胞。该方法还包括从培养物中回收细菌细胞。最后，将回收的细菌细胞悬浮在磷酸盐缓冲盐水中。

附图说明

当参考附图阅读时，从下面的描述看本发明的其他目的、特征和优点将显而易见。在图中，其中相同的参考数字指几个视图中的相应部分：

附图

图1说明了根据本发明的说明性实施方案的活的减毒霍乱疫苗株VCUSM14P的构建示意图；

图2A示出了未接种的兔的图像；图2B示出了接种了未配制的口服单价疫苗制剂的兔的图像；并且图2C示出了接种了根据本发明的示例性实施方案的配制的口服单价疫苗制剂的兔的图像。

表格

表01表示用于开发根据本发明的说明性实施方案的针对O139攻击的单价疫苗制剂的引物及其序列、以及退火温度和功能的列表。

具体实施方式

现在将详细参考本发明的优选实施方案，其实例在附图中示出。

在下面的详细描述中，阐述了许多具体细节以便提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的普通技术人员将理解，本发明可以在没有这些具体细节的情况下实践。在其他情况下，没有详细描述众所周知的方法、程序和/或组分，以免使本发明模糊不清。

从仅以示例方式参考附图给出的以下对本发明方法的描述，将更清楚地理解本发明。在下面的描述中，在所有图中，相同的数字表示相同的元件。例如，在一个图中，数字(2)用于指特定元件，在其他任何图中出现的数字(2)也是指相同的元件。

霍乱是一种急性、腹泻性疾病，由肠道感染霍乱弧菌引起。估计全世界每年发生3-5百万例，超过100,000例死亡。感染常常为轻度或无症状，但有时可能很严重。大约10个感染者中有一个(5-10％)可能患有以大量水性腹泻、呕吐和腿抽筋为特征的严重疾病。在此类人体内，体液的迅速流失导致脱水和休克。在不治疗的情况下，可在数小时内发生死亡。

当前，已开发出许多疫苗制剂来摆脱腹泻性疾病。此类疫苗基于全灭活的霍乱弧菌或活的减毒的霍乱弧菌。两种类型的疫苗都具有作为针对O139霍乱弧菌的疫苗候选物的潜力。此类疫苗具有引起高抗体滴度和保护性免疫反应的能力。然而，疫苗存在某些挑战。例如，疫苗具有冷链依赖性，因此需要其反复给药。其此类特性导致较高的成本且持续时间也较短。

因此，本发明公开了一种活的减毒霍乱疫苗制剂，该制剂无需冷链，导致其单一剂量，因此降低了所涉成本。在一些实施方案中，该制剂在室温下具有稳定性，因此持久。在一些实施方案中，本发明公开了一种制备活的减毒霍乱疫苗制剂的方法。环境中各种抑制生长的胁迫，诸如营养剥夺、温度、盐度和氧气含量的波动，会在霍乱弧菌中引起涉及调节几种基因的表达的严格反应，以介导其适应、持久性、霍乱的播散和传播。因此，霍乱弧菌的此类过继性性状可以在最佳模拟环境胁迫条件的体外条件下加以利用，以在环境温度下长期储存活的减毒霍乱疫苗株。

在一个实施方案中，本发明公开了一种针对O139的单价疫苗制剂。该制剂包括在疫苗培养基中生长的活的减毒霍乱疫苗株。在一些实施方案中，疫苗株是VCUSM14P。VCUSM14P是针对霍乱弧菌的O139血清群构建的氨基乙酰丙酸(ALA)原养型的非产毒株。图1中描绘了用于构建ALA原型VCUSM14P的方案。如图1所示，通过EcoRI限制酶消化从pARO-hemA/M中切除野生型hemA/M基因。然后，用T4 DNA聚合酶将含有5'侧翼hemA/M的2.18kb片段钝化，并将其克隆到线性***载体pCVD442中的SalI限制酶位点，以产生pCVD-hemA/M。通过使用VHF(5'-GAC CTG TGA TGT AAA GGA AC-3')和VHR(5'-CTT CAT AGC GCT CAA CAAGG-3')引物进行PCR确认成功克隆了pCVD-hemA/M。将含有完整hemA/M基因的pCVD-hemA/M从大肠杆菌(E.coli)宿主BW 20767λ-pir中接合转移到VCUSM14菌株。在含有氨苄青霉素和多粘菌素B的LB琼脂上选择由于第一交叉事件而具有整合到VCUSM14染色体中的***载体构建体pCVD-hemA/M的所得局部二倍体。使用含有15％蔗糖的改良LB培养基来选择具有野生型hemA/M基因的原养型菌株。选择对氨苄青霉素敏感，对多粘菌素B和蔗糖均具有抗性并且显示不存在ALA营养缺陷型的菌株，并将其命名为VCUSM14P。表01中已经列出了各种引物序列以及各自的功能。

实验

将活的减毒霍乱疫苗(VCUSM14P)的次代培养物维持在不含任何抗生素的Sigma-Aldrich LB琼脂上，并按常规在37℃下于LB肉汤(LB；10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物和5g/l氯化钠)中繁殖。将野生型(WT)霍乱弧菌0319孟加拉菌株维持在Oxoid营养琼脂上，该营养琼脂由Bacto蛋白胨10g/l、牛肉浸粉(Lab lemco powder)10g/l、氯化钠5g/l和普通琼脂15g/l补充多粘菌素0.75g/ml组成。在肠道定殖研究中，用硫代硫酸柠檬酸胆汁盐蔗糖(TCBS)琼脂对VCUSM14P进行计数。将菌株的储用培养物在-80℃下储存在含脑心浸液肉汤(BHIB，Difco)的15％甘油中直到使用。

在一些实施方案中，使菌株VCUSM14P在疫苗培养基中生长。所述培养基包含在1000mL的pH为7.2±0.2的磷酸盐缓冲盐水中的淀粉(3.25-6.75％)、纤维素(2.50-4％)、右旋糖(18.25-24.50％)、酵母提取物(0.01-0.05％)和NaCl(0.05-0.15％)。

在以上实施方案中，所述制剂介导抗体和细胞毒性T细胞。

在一些实施方案中，本发明公开了一种制备霍乱疫苗制剂的方法。下文描述的方法的步骤顺序本质上是示例性的，以理解本领域的技术。该方法包括在疫苗生长培养基中培养菌株VCUSM14P的活的减毒细菌细胞。该方法还包括从培养物中回收细菌细胞。最后，将回收的细菌细胞悬浮在磷酸盐缓冲盐水中。

实验

将来自储用培养纯度板的VCUSM14P单个菌落接种在装有20ml LB肉汤的100ml锥形烧瓶(Erlenmeyer flask)中，并在设为250rpm的定轨振荡器中于37℃孵育24小时。使用分光光度计监测细菌生长，以在600nm下进行OD测量。此类培养物接种在1000ml锥形烧瓶中的200ml新鲜LB肉汤中，并在相同条件下孵育4小时。此外，4小时培养物接种2L疫苗生长培养基。

在5L桌上型发酵罐(BIOSTAT A Plus，德国赛多利斯(Sartorius,Germany))中，将疫苗株(VCUSM14P)在实验室发酵罐中的疫苗生长培养基(补充有1％淀粉和0.3％纤维素的LB肉汤)中于37℃、0.6vvm充气和150rpm搅拌下培育48小时。通过在4℃下以10,000rpm离心20分钟来回收细胞。将回收的细菌细胞悬浮在200ml磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2)中。

在补充有5％淀粉、1.5％纤维素、20％右旋糖和0.05％酵母提取物的1000ml磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2)中制备无菌赋形剂溶液。通过将200ml细菌细胞的盐水悬浮液(6×108CFU/ml)和800ml无菌赋形剂溶液无菌性混合在一起，完成活的减毒霍乱疫苗(LACV)配制。将该制剂进行均匀地混合并在37℃下孵育48小时。48小时后，将5ml疫苗制剂的等分试样无菌性分配到10ml玻璃小瓶中，用橡胶塞封闭并在室温(25℃±2℃)下储存。

此外，针对制剂的储存稳定性进行纯度、效力和活力的评估。可以通过表型和基因型方法在25℃±2℃和60％±5％的湿度下，在180天的延长储存期内进行评估。

制剂中菌株的活力在储存180天后与在室温(25℃±2℃)下储存相比降低2log；6×108CFU/ml，菌落减少可归因于高湿度。

为了在25℃±2℃和60％+5％下储存180天后，鉴定制剂中的完整VCUSM14P培养物，可以使用两种不同的引物集进行PCR。PCR和凝胶电泳确定了无需冷链的制剂中VCUSM14P培养物的遗传纯度。

第一PCR反应是使用ctxA112MS-F和ctxBCDS-R引物进行的Mctx反应，用于检测样品中突变的ctxA基因的存在，以验证突变的ctxA基因不会回复到产毒形式。制剂中所有含培养物的样品以及是来自甘油原液的VCUSM14P菌株(未配制菌株)的阳性对照均在700bps区域显示出条带，而在阴性对照列中未观察到条带。此类结果表明在培养物中存在突变的ctxA基因，并且它无污染。

第二PCR反应包括KanFse反应。KanFse反应涉及KanFse-2F和KanFse-R引物，以检测***VCUSM14P中的遗传标记的存在，该遗传标记是截短的aphA基因。aphA基因是卡那霉素抗性基因。制剂中含有培养物的所有样品以及阳性对照均在500bps区域显示出条带。制剂培养物中aphA基因的存在表明它是与阳性对照(来自甘油原液(未配制的)菌株的VCUSM14P)相当的VCUSM14P菌株。

在25℃±2℃和60％±5％的湿度下长时间储存期间，定期分离LACV制剂中的细菌菌落并在TCBS琼脂上划线接种。制剂中VCUSM14P的菌落显示出直径为2-4mm的扁平黄色菌落，在TCBS琼脂上有不透明的中心。革兰氏染色在光学显微镜下显示存在革兰氏阴性“逗号”(曲杆)形细胞。此外，还用HiVibrio^TM鉴定试剂盒进行了一系列生化试验，以验证霍乱弧菌(VCUSM14P)菌株的特性。以上所有试验结果都确认LACV制剂中存在VCUSM14P菌株的纯培养物。

由于定殖对于引发免疫反应至关重要，因此在幼小小鼠模型中检查了LACV制剂的定殖情况。对在25℃±2℃和60％±5％的湿度下储存了180天的LACV制剂在幼小小鼠模型中的定殖潜力进行评估。在此类测定中，接种5×106CFU/ml制剂后，回收到7×10⁷CFU/ml的VCUSM14P。经配制的VCUSM14P的定殖潜力具有高出一个对数的回收率。

实验

可以在兔中进行反应原性研究。在结扎理想环测定中，可以对注射了10⁴、10⁵和10⁶CFU的LACV制剂的环进行记录，其积液显著减少(0.2积液率)。然而注射了10⁴、10⁵和10⁶CFU的野生型霍乱弧菌O139的环记录到积液增加4倍(0.8积液率)，并显示存在出血。在兔理想环模型中，LACV制剂在10⁴-10⁶的剂量下无反应原性。

对该疫苗制剂在兔模型中的保护能力进行进一步评估。可以使用可逆性肠结扎成兔腹泻(RITARD)模型测定保护能力。通过用10⁹CFU/ml的野生型霍乱弧菌O139攻击，对正常兔和用LACV制剂免疫的兔进行RITARD测定。如图2A、图2B和图2C所示，用10ml的LACV制剂(5×10⁶CFU/ml)免疫的兔到5天观察时未显示出腹泻或死亡的任何迹象，而在RITARD模型中，正常兔在18小时后观察到100％的死亡率。用1×10⁹CFU/ml的野生型霍乱弧菌O139孟加拉菌株攻击2只未接种疫苗的雄兔，每只3kg。在第18小时后，发现其小肠中有积液，如图2A所示。3只以口服10mL未配制的VCUSMP14P接种的雄兔(每只3.1kg)在接种第6天后未显示出腹泻迹象。如图2B所示，其小肠中没有积液。类似地，当3只雄兔(每只3.2kg)以口服10mL经配制的VCUSMP14P进行接种时，兔在接种第6天后未显示出腹泻迹象。如图2C所示，其小肠中没有积液。

通过测量抗CT IgG抗体来评估用LACV制剂免疫的兔的免疫反应。当与免疫前血清相比时，在用LACV制剂接种的兔中诱导出了抗CT IgG。在接种了LACV制剂的兔中，IgG抗体反应的增加从第2周开始增加6倍，并且在第4周记录到17倍的最高IgG反应。

因此，LACV制剂无需冷链，可在25℃±2℃和60％+5％的湿度下稳定180天，在体内无反应原性而具有免疫原性，保护动物免受致死性野生型霍乱弧菌O139攻击。

虽然在上面的具体实施方式中公开了本发明的优选实施方案及其优点，但是本发明不限于此，而仅受所附权利要求的范围限制。

对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不背离本发明的基本特征的前提下，可以容易地以其他特定形式来产生本发明。因此，本实施方案仅被认为是说明性的而非限制性的，本发明的范围由权利要求书而不是前面的描述来指示，因此落入其中的所有变化都旨在被涵盖在其中。